Name: Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a medir la activación de receptores de olor en células vivas mediante un ensayo de cAMP en tiempo real. Este método permite evaluar eficientemente la interacción entre odorantes y receptores.

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El trabajo fue apoyado por la Fundación de ciencia nacional chino (31070972), ciencia y tecnología Comisión de Shangai municipio (16ZR1418300), el programa para innovadores investigación equipo de Shanghai Municipal Comisión de educación, el Shanghai oriental Programa (J50201) y el programa de investigación básica Nacional de China (2012CB910401).

1. cultivo y mantenimiento de las células Hana3A <ol><li>mantener las células en 10 mL de medio mínimo esencial (MEM) con 10% suero fetal bovino (FBS), 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 1,25 μg/mL anfotericina B en un 100 mm placa de cultivo de células en una incubadora de cultivo celular de 37 ° C con 5% CO 2. Con cada otro paso, añadir 1 puromicina μg/mL para mantener estable de la transfección de plásmidos (véase Introducción). 
	Nota: Realice todos los pasos que implica el cultivo de células en una clase de gabinete de seguridad biológica II a garantizar ambiente estéril.</li>
	<li>Subcultivo en una proporción de 10-20% en 100 mm platos cada 2-3 días.</li>
</ol> 2. Recubrimiento de las células para la transfección <ol><li>observar las células bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar la viabilidad de las células y para estimar la confluencia del Hana3A.</li>
	<li>Aspirar todo medio de la placa de cultivo celular.</li>
	<li>Lavar las células añadiendo 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la placa, el plato se arremolinan y aspirando PBS.</li>
	<li>Añadir 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en la placa. Mezcla durante 1 minuto o hasta que todas las células estén a flote. 
	Nota: Observar el avance de las células de la parte inferior de la placa bajo el microscopio como sea necesario.</li>
	<li>Tripsina Inactivate añadiendo 5 mL de MEM con 10% FBS y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper trozos de Massachusetts de la célula 
	Nota: Para placas antes de transfección, el medio utilizado no debe contener antibióticos. Además de los antibióticos pueden disminuir la eficacia de transfección.</li>
	<li>Transferir una cantidad apropiada de las células a un tubo de 15 mLl dependiendo del número de placas a ser transfectadas. Por cada placa de 96 pocillos, placa de 2 x 10 6 células o aproximadamente 1/5 de un plato de 100 mm confluente del de 100%, dando una cuenta de célula de 2 x 10 4 células por pozo o una densidad de aproximadamente 15-30% confluencia por pozo. Centrifugar los tubos a 200 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular. 
	Nota: Calcular la cantidad correcta de células para ser revestidos en placas de 96 pocillos para evitar sobrecrecimiento o undergrowing las células antes de la estimulación.</li>
	<li>Agregar una cantidad apropiada de MEM con 10% FBS en la 15-mL tubo y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper trozos de la célula de la masa. Para cada placa de 96 pocillos, resuspender las células con 6 mL de MEM con 10% FBS. 
	Nota: Tenga cuidado de no generar burbujas de aire en el tubo de.</li>
	<li>Añadir las células suspendidas en un tanque. Usando una pipeta multicanal, pipetee 50 μl de células en cada pozo de una placa de 96 pocillos. Incubar durante una noche a 37 ° C con 5% CO 2.</li>
</ol> 3. Transfección de plásmidos <ol><li>antes de transfección, observar las células plateadas para asegurar una adecuada confluencia de aproximadamente 30-50% bien bajo el microscopio de contraste de fase y volver a la incubadora de.</li>
	<li>Preparar con antelación el OR tagged Rho construcción 11 , 21 , 22 , 28, el factor accesorio construye (RTP1S 22 , 36 y M3R 23), y la variante de biosensor construir 29 , 30 por miniprep. Cuantificar la concentración de DNA por un espectrofotómetro y ajustar las concentraciones de ADN plásmido (p. ej., a 100 ng/μL) con agua destilada como sea necesario.</li>
	<li>Preparación de las mezclas de transfección <ol><li>prepara una mezcla de transfección del plásmido en 500 μl de MEM para cada placa de 96 pocillos según tabla 1. 
		Nota: Cuando diferentes SRO es probados en la misma placa de 96 pocillos, el volumen de la mezcla de transfección y la cantidad de plásmido ADN añadido debe adaptarse en función del número de pozos transfected con un dado o.</li>
		<li>Prepare una mezcla de transfección en un tubo con 18 μL de reactivo de transfección mediada por lípidos en 500 μl de recordar:</li>
	</ol></li> <li>Mezcle la mezcla de plásmido con la mezcla de transfección mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min</li>
	<li>Detener la reacción agregando 5 mL de MEM con 10% FBS.</li>
	<li>Extienda una capa gruesa de toallas de papel estéril en la campana de la cultura de célula. Tomar una placa de 96 pocillos con células de la incubadora. Suavemente y varias veces toque la placa boca abajo en la pila de toallas de papel para que el medio es completamente absorbido por la toalla de papel. 
	Nota: No con fuerza o bruscamente golpee la placa como uno podría perder células.</li>
	<li>Transferir 50 μl de la mezcla de transfección combinado en cada pocillo de la placa de 96 pocillos e incubar durante la noche por 18-24 h a 37 ° C con 5% CO 2. 
	Nota: Un programa de transfección y la estimulación logró tiempo debe preceder a la medición cuando se prueban más de una placa de 96 pocillos en un experimento para tener todas las placas miden después del mismo tiempo de transfección y tiempo de exposición del estímulo.</li>
</ol> 4. Estimulación y medición o actividad usando el ensayo de campo en tiempo real <ol><li>observar las células transfected con un microscopio de contraste de fase para asegurar una adecuada confluencia de 50-80% por pozo y vuelva a la incubadora.</li>
	<li>Preparar el medio de la estimulación mediante la adición de 10 mM hidroxietil-1-ácido ácido (HEPES) y 5 mM glucosa a Hank &#39; s solución sal balanceada (HBSS).</li>
	<li>Descongelar las alícuotas de reactivo sustrato de ensayo de campo en tiempo real en el hielo. Almacenar el reactivo substrato a-80 ° C a 55 μl por tubo en tubos de PCR. 1 tubo por placa.</li>
	<li>Preparar solución de equilibrado 2% mezcla 55 μl del reactivo de sustrato y solución de glucosa HEPES de HBSS 2750 μl.</li>
	<li>Extienda una capa gruesa de toallas de papel en el Banco. Varias veces y suavemente golpee la placa boca abajo sobre la toalla de papel para que el medio de transfección es completamente absorbido por la toalla de papel.</li>
	<li>Lavar las células por Pipetear 50 μl de solución de glucosa HEPES de HBSS a cada pocillo.</li>
	<li>Grifo suavemente y varias veces la solución de glucosa HEPES de HBSS de la placa de 96 pozos.</li>
	<li>Pipeta 25 μl de la solución de equilibrio de 2% a cada uno bien e incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 2 h.</li>
	<li>Preparar por adelantado 1 M soluciones odorante en DMSO y almacenar a-20 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Antes del final de la incubación, diluir las soluciones stock de olor a las concentraciones de trabajo en medio de estimulación de la HBSS/HEPES/glucosa. 
	Nota: Las concentraciones de las diluciones de olor preparadas en este paso se deben duplicar para obtener las concentraciones finales correctas en cada pozo.</li>
	<li>Con un QL placa lector y antes además de odorante, medir el nivel basal de la luminescencia de la placa por 2 veces consecutivas a una velocidad de 1000 ms por bien 34.</li>
	<li>Rápidamente Retire la placa del lector de la placa y añadir diluciones de odorante de 25 μl a cada pocillo inmediatamente iniciar la medición de la luminiscencia continua de todos los pozos de 20 ciclos dentro de 30 minutos 
	Nota: Pipeta cuidadosamente para evitar la contaminación los vecinos pozos al usar diferentes olores o diferentes concentraciones de los mismos odorantes en el mismo plato.</li>
</ol> 5. Análisis de datos <ol><li>exportar los datos desde el software de lector de placa de quimioluminescencia.</li>
	<li>Cálculo normalizado respuesta OR para cada punto de tiempo utilizando la fórmula de 
	(luminiscencia N &#8211; luminiscencia basal) / (luminiscencia mayor &#8211; luminiscencia basal) donde N = el valor de luminiscencia de un determinado bien; basal = valor promedio de luminiscencia de los dos basales valores de luminiscencia; más alto = mayor valor de luminiscencia de un plato o un conjunto de placas de. 
	Nota: Dependiendo de la finalidad del experimento, pueden adoptarse representaciones gráficas alternativas. Por ejemplo, para la detección del análisis (ver figura 1) y para la generación de curvas de respuesta a la concentración, el valor de luminiscencia de un cierto bien en un momento deseado durante la medición cinética, como el valor máximo o el valor final, se puede usar.</li>
</ol>

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<li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li>
<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Medir con precisión la activación de un OR con la exposición a un determinado odorante es el primer paso para descifrar la codificación de la información olfativa. Los experimentos se muestra en esta representan estudio que un ejemplo de cómo se puede identificar, mediante una en vitro sistema de expresión OR, or sensible entre el repertorio humano de OR para el olor químico de interés y posteriormente caracterizar el receptor Farmacología utilizando diferentes concentraciones de la sustancia. Nuestros resultado...

El sentido del olfato desempeña un papel importante en la supervivencia de animales como ellos confían en sus capacidades olfativas para obtener comida, evitar depredadores y peligros, especies y seleccionar mate1,2. La realización de estas funciones depende de los receptores de olor (RUP), que se expresan individualmente en la superficie ciliar de las neuronas sensoriales olfativas (OSNs) localizada en el epitelio olfatorio (OE). ORs constituyen la mayor familia de la superfamilia de receptores (GPCR) de la proteína G acoplada con aproximadamente 400 y 1200 diversos OR genes en humanos y ratón, respectivamente3,4,5. ORs activados por olores conducen al aumento de los niveles intracelular de cAMP a través de la activación secuencial de proteína olfatoria de G (Golf) y tipo cyclase del adenylyl III (ACIII). El mayor nivel de cAMP intracelular resultante podría funcionar como un segundo mensajero, que se abre el canal nucleotide-bloqueado en la superficie de la célula, provocando afluencia de cationes como Ca2 + y los potenciales de acción y en última instancia iniciando potencial de neuro transmisión y percepción olfativa. El proceso de detectar y discriminar una gran cantidad de olores por ORs es considerado como el primer paso de percepción olfativa6,7.
Puesto que Buck y Axel8 primero con éxito había reproducido receptores odorantes y dilucidado el mecanismo de la percepción olfativa iniciada por ORs, deorphanization de la familia de OR se convirtió en uno de los hotspots en este campo. Varios métodos in vivo, ex vivo y en vitro para medir la activación OR han sido reportados9,10,11,12. Un método tradicional que utiliza Ca2 + proyección de imagen de seguido por RT-PCR unicelular en OSNs permitió la identificación de diferentes SRO a aceites alifáticos13,14,15. Más recientemente, el advenimiento de los análisis del transcriptoma a gran escala promueve el desarrollo de métodos de alto rendimiento en vivo más. El ensayo de Kentucky había identificado ORs de eugenol y muscone-sensible al ratón con el uso de la S100a5-tauGFP reportero ratón cepa y microarrays análisis9. Basado en la disminución de los niveles de mRNA de OR después de la exposición de olor, la tecnología de sueño emplea un enfoque transcriptómicos para determinar perfiles de activación OR en ambas especies de vertebrados y no vertebrados16. Asimismo, habida cuenta de la fosforilación de S6 en activaciones neuronales, la señorita grupo secuenciado mRNAs de immunoprecipitations ribosoma fosforilada para identificar capacidad de respuesta de ORs12. Por último, el grupo de Feinstein informó ratones estupendo sniffer que podrían servir como una plataforma para estudiar olor codificación en vivo, conocido como la tecnología de MouSensor17.
En el Reino de vitro , el reto de cultivo OSNs hace un sistema de expresión heteróloga que imita OR expresión funcional en vivo una solución ideal para la investigación a gran escala de los productos químicos para ORs. Sin embargo, puesto que las líneas de cultivo de células de origen no olfativa difieren OSNs nativos, o proteínas son retenidas en el retículo endoplasmático e incapaz de tráfico a la membrana plasmática, dando por resultado OR degradación y pérdida de función del receptor18 , 19. para resolver este problema, se han realizado trabajos extensos para replicar expresión funcional OR sobre la membrana celular en células heterólogas. Krautwurst et al. primero atribuye los 20 primeros aminoácidos de la rodopsina (Rho-etiqueta) a la N-terminal de la proteína de OR y esto promovió la expresión de superficie de la célula de algunos ORs en células de riñón embrionario humano (HEK)20. Mediante la realización de un análisis de serie de análisis del gene expresión (SAGE) Biblioteca de solo OSNs, Saito et al. clonó por primera vez el transporte del receptor proteína (RTP) miembros de la familia, RTP1 y RTP2 y la proteína del receptor de expresión potenciador 1 (REEP1) que facilitó el tráfico de OR a la membrana celular y mejorada respuestas mediadas por el olor de las RUP en las células HEK293T 21. basándose en estos hallazgos, el grupo de la señorita establecido con éxito la línea celular de Hana3A estable transfected con RTP1, RTP2, REEP1 y Gαolf en HEK293T y transitorio transfected con ORs tagged Rho, eficiente o funcional expresión. Posteriores estudios revelaron 1) una forma más corta de RTP1, RTP1S, que podrían promover más robusta o función de la proteína original de RTP1 y 2) el receptor muscarínico de tipo 3 (M3R) que podría mejorar la actividad OR vía inhibición de la β-arrestin-2 contratación, los cuales fueron introducidos en el sistema de expresión heteróloga para optimizar experimental salida22,23.
Varios métodos de detección se han utilizado para cuantificar la activación del receptor en sistemas heterólogos. El ensayo de la fosfatasa alcalina placentaria secretada (SEAP) trabaja con una enzima reporter reglamentada transcripcionalmente por elementos de la respuesta de campo (CREs), convirtiéndolo en una opción atractiva para evaluar la activación de la OR. La fluorescencia se detecta fácilmente en una muestra de medio de cultivo después de la incubación con SEAP detección reactivo24. Usando este método, las funciones de RUP como una clase secundaria de receptores chemosensory en el OE-el rastro receptores asociados a aminas (Edmonton) han sido caracterizan25,26,27. Otro método común, el ensayo de luciferasa, utiliza un gen de reportero de luciferasa de luciérnaga bajo el control del elemento de respuesta cAMP (CRE). Luminiscencia generada por la producción de luciferase de medición proporciona un medio eficiente y robusto de cuantificación OR activación10,11,28.
Ensayos de campo en tiempo real también han sido ampliamente utilizados en el seguimiento dinámicamente la función de los GPCRs heterólogas o endógenas. Un ejemplo de tales ensayos avanzados aprovecha una variante genéticamente codificados biosensor, que posee un dominio de unión a campo fusionado a la forma mutante de la luciferasa. Cuando el campo se une, el cambio conformacional conduce a la activación de la luciferasa, luminiscencia que puede medirse entonces con un lector de la quimioluminescencia29,30. La tecnología de campo en tiempo real ha informado conveniente para la orfandad de los receptores de olor humano en las células HEK293 y NxG de 108CC15culo = "xref" &gt; 31,32,33, como así como en la Hana3A HEK293T derivado células34,35. El grupo Krautwurst también describe en detalle la tecnología de campo en tiempo real para ser conveniente para enfoques a gran escala o detección bidireccional32,33.
Aquí se describe un protocolo para medir la activación OR usando un análisis de campo en tiempo real en células Hana3A. En el presente Protocolo, la luminiscencia de células vivas previamente equilibradas se mide cinéticamente por 30 min después del tratamiento con compuestos volátiles específicos, que representan un análisis más eficiente y preciso de la activación de OR que son menos susceptibles a artefactos que se producen en el entorno celular con tiempo prolongado y toxicidad celular inducida por el olor. Esta medida en tiempo real permite una proyección a gran escala de SRO y ligandos, así como caracterización de pares OR-ligando específicos de interés. Usando este método, con éxito identificamos OR5AN1 como receptor para el muscone compuesto de almizcle realizando una proyección contra 379 ORs humanas y posteriormente confirmar el resultado de la investigación positiva.

<table><tbody><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP reactivo</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F plásmido cAMP</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Hana3A</td><td></td><td></td><td>células disponibles de los autores bajo petición</td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio ni magnesio</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido</td><td></td><td></td> M3R <td>clonado en un vector de expresión de mamíferos como pCI</td></tr><tr><td>MEM, con EBSS y L-glutamina</td><td>Hyclone</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>Muscone</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Almizcle tibetene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165</td><td></td></tr><tr><td>plásmidos</td><td></td><td></td> OR <td>clonados con un Rho-tag en un vector de expresión de mamíferos como pCI</td></tr><tr><td>PBS, sin calcio ni magnesio</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RTP1S plásmido</td><td></td><td></td><td>clonado en un vector de expresión de mamíferos como pCI</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Hyclone</td><td>SH30236</td><td></td></tr><tr><td>tubo de PCR de 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf de 1,5 mL Eppendorf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico de 17 mm x 120 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>pipeta multicanal de 8 pocillos y/o 12 pocillos</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>96 pocillos placa de cultivo de glóbulos blancos de fondo plano</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 100 mm x 20 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Clase II cabina de seguridad biológica con flujo</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>laminarIncubadora de cultivos celulares, con 5% de CO2</td>Centrífuga, con rotor de cangilón oscilante para tubos cónicos de 15 ml Lector de placas Infinite F200 Microscopio de contraste de <td></td><td></td><td></td></tr> fase <tr><td></td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con objetivos</td><td></td><td></td><td></td>x10 y x20</tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Depósitos de reactivos estériles para distribución</td><td></td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr>Toalla <td></td><td></td><td></td>de<td>papel estéril</td></tr></tbody></table>

células vivas medición de olor del receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

El enorme tamaño de las familias de mamíferos odorante del receptor (o) presenta dificultades para encontrar sus ligandos afines entre los numerosos productos químicos volátiles. Para eficientemente y exactamente deorphanize ORs, combinamos el uso de una línea de células heterólogas ORs mamíferos y un plásmido biosensor genéticamente modificados para medir campo producción aguas abajo de la activación de la OR en tiempo real. Este ensayo puede utilizarse para olores de pantalla contra ORs y viceversa. Las interacciones de los receptores odorantes de las pantallas pueden confirmarse posteriormente por pruebas contra diferentes concentraciones de olor, generación de curvas de concentración-respuesta positiva. Aquí hemos utilizado este método para realizar una proyección de alto rendimiento de un compuesto oloroso contra una biblioteca OR humano expresado en las células Hana3A y confirmó que el receptor responder positivamente es el receptor cognado para el compuesto de interés. Encontramos este método de detección de alto rendimiento eficiente y confiable en la evaluación de la activación de la OR y nuestros datos proporcionan un ejemplo de su uso potencial en estudios funcionales OR.

Muscone es el principal componente aromático de almizcle natural. Recientes estudios OR5AN1 identificados como un receptor humano para el muscone y otros compuestos macrocíclicos de almizcle basadas en homología con el ratón o, MOR215-1, reproducido de glomérulos muscone-responsivo en comportarse ratones37,38. Por proyección el repertorio humano de OR, nuestro grupo y el grupo Touhara también identificado OR5AN1 como un receptor i...

Caracterizar la función de receptores odorantes sirve una parte indispensable en el proceso de deorphanization. Se describe un método para medir la activación de receptores odorantes en tiempo real utilizando un ensayo de campo.

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

El objetivo general de este ensayo de AMP cíclico en tiempo real y alto rendimiento es analizar los odorantes frente a los receptores de odorantes y viceversa. Los ratones son útiles para investigar el funcionamiento de los receptores de odorantes, ya que permiten análisis a mayor escala tanto de receptores de odorantes como de sus ligandos, así como la caracterización farmacológica de pares receptor-ligando de interés. La principal ventaja de esta técnica es que podemos evaluar la activación del odorante al receptor de forma eficiente y confiable.Sistema heterólogo de expresión de odorantes a receptores utilizando células vivas. Comience observando las células Hana3A bajo un microscopio de contraste de fases para asegurar la viabilidad celular y estimar la confluencia. Luego aspire todo el medio del recipiente de cultivo celular.Y lave las células agregando 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato sobre la placa, agitando suavemente el recipiente y aspirando el PBS. A continuación, agregue tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,5 % sobre la placa. Deje la tripsina sobre las células durante un minuto o hasta que todas las células estén en suspensión.Inactivar la tripsina añadiendo 5 mililitros de MEM con 10% de FBS y pipetear hacia arriba y hacia abajo para desagregar los trozos de masa celular. Después de realizar el recuento celular, transferir 2x10⁶ células por placa de 96 pocillos, destinadas a transfección, a un tubo de 15 mililitros. Es importante que calcule el número correcto de células a preparar en la placa de 96 pocillos para evitar un crecimiento excesivo o insuficiente antes de la estimulación.Centrifugar los tubos a 200 veces G durante cinco minutos. Luego, aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular. Añadir seis mililitros de medio sin antibióticos por cada placa de 96 pozos y pipetear hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas de aire para desagregar los grumos de la masa celular.Transfiera las células en suspensión a un depósito. Utilizando una pipeta multicanal, agregue 50 microlitros de células en cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Incube durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Antes de la transfección, observe las células sembradas bajo un microscopio de contraste de fases para asegurar una confluencia adecuada de aproximadamente 30 a 50 % por pocillo y luego regrese a la incubadora. Siga la fila etiquetada como constructo de odorante a receptor, los constructos de factores accesorios y el constructo de la variante del biosensor de AMP cíclico. A continuación, prepare una mezcla de transfección plasmídica en 500 microlitros de MEM para cada placa de 96 pocillos.A continuación, prepare una mezcla de transfección que contenga 18 microlitros de reactivo de transfección mediado por lípidos en 500 microlitros de MEM. Mezcle la mezcla de transfección con la mezcla de plasma pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incube luego a temperatura ambiente durante 15 minutos.Después de la incubación, detenga la reacción agregando 5 mililitros de MEM con 10 %FBS a la mezcla de transfección. A continuación, extienda una capa gruesa de toallas de papel estériles en la cabina de cultivo celular. Tome una placa de 96 pocillos con células del incubador.Toque suavemente y repetidamente la placa boca abajo sobre la pila de toallas de papel para que el medio sea completamente absorbido por las toallas. Transfiera 50 microlitros de la mezcla de transfección combinada a cada pocillo de la placa de 96 pocillos e incube durante la noche entre 18 y 24 horas a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono. Puede gestionar la transfección y el programa de estimulación, que debe mantenerse en el instrumento cuando se prueban más de una placa de 96 pocillos en un mismo experimento, de modo que todas las placas sigan el mismo intervalo de transfección y exposición a los agentes estimulantes.Antes de la estimulación, observe las células transfectadas bajo un microscopio de contraste de fases para asegurar una confluencia adecuada de 50 a 80 % por pocillo antes de regresarlas al incubador. Luego, prepare el medio de estimulación añadiendo 10 milimolares de heaps y 5 milimolares de glucosa a la solución salina balanceada de Hanks. Derrita 55 microlitros de alícuotas del reactivo sustrato para el ensayo de AMP cíclico en tiempo real en hielo.Prepare una solución de abración igual al 2% mezclando 55 microlitros del reactivo sustrato y 2.750 microlitros de medio de estimulación. Después de extender una capa gruesa de toallas de papel sobre la bancada, golpee suavemente y repetidamente la placa boca abajo sobre las toallas de papel para que el medio de transfección sea absorbido por ellas. Lave las células pipeteando 50 microlitros de medio de estimulación en cada pocillo.Toque suavemente y repita la extracción del medio de estimulación de la placa de 96 pocillos. Pipetee 25 microlitros de la solución de equilibrio al 2 % en cada pocillo e incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos horas. Poco antes de finalizar el tiempo de incubación, diluya las soluciones stock de odorizantes descongeladas a la concentración de trabajo y al medio de estimulación.Antes de añadir el odorante, utilice un lector de placas de quimioluminiscencia para medir el nivel basal de luminiscencia de la placa. Retire rápidamente la placa del lector y añada 25 microlitros de las diluciones de odorante a cada pocillo. A continuación, inicie inmediatamente la medición continua de luminiscencia de todos los pocillos durante 20 ciclos dentro de un período de 30 minutos.Se analizaron 379 receptores olfativos humanos únicos frente a 30 micromolar de muscona utilizando el ensayo de AMP cíclico en tiempo real. Los bloques de colores a lo largo del eje X indican diferentes familias de receptores olfativos humanos. El eje Y representa la luminiscencia normalizada 30 minutos después de la adición del odorante, cuando la respuesta alcanzó el máximo para el control positivo.Se indica la respuesta de OR5AN1. Esta figura muestra mediciones en tiempo real de la activación de OR5AN1 por diferentes concentraciones de muscona y el resultado de un control negativo sin olor. La flecha indica el punto temporal de adición del odorante.Aquí se muestra una curva de respuesta frente a la concentración de OR5AN1 frente a la muscona 30 minutos después de la adición del odorante. La técnica descrita aquí requiere un total de tres días, comenzando con una placa stock de niveles de cultivo en el primer día. Una vez dominada, el proceso del último día puede completarse en tres horas por cada placa de 96 pocillos si se realiza correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo gestionar la activación de receptores de olores utilizando un ensayo de AMP cíclico para aprovechar los resultados.

live-cell-measurement-odorant-receptor-activation-using-real-time

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí se demuestra un protocolo para llevar a cabo la tinción de células vivas que se pueden utilizar para detectar los receptores de olor en la superficie de las células HEK293T convenientemente. Además, también puede ser utilizado para el ensayo de expresión en la superficie de otros receptores o quimiosensoriales GPCRs.

Analizando la expresión de superficie de los receptores Quimiosensoriales en células heterólogas

Este video muestra el protocolo para medir la activación del receptor odorante en células transfectadas utilizando un biosensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) y detección de luminiscencia. El método se aplica para estudiar las interacciones receptor-ligando y las vías de señalización en las neuronas olfativas.

Medición de la activación del receptor odorante mediante un ensayo de monofosfato de adenosina cíclico en tiempo real

Fuente: de March, C. A. et. al., Monitoreo in vitro en tiempo real de la activación del receptor de odorante por un odorante en la fase de vapor. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el método para monitorear la activación en tiempo real de los receptores de odorantes en células recombinantes de mamíferos utilizando la medición de luminiscencia. La unión de odorantes desencadena la activación de la proteína G y la producción de AMPc, activando las proteínas glosensoras que emiten...

Monitorización en tiempo real de la activación del receptor odorante en células recombinantes

La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA.

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

Los patrones de activación de receptores olfativos codifican identidad olor, pero la falta de datos publicados identificar ligandos de olor para los receptores olfativos de mamíferos dificulta el desarrollo de un modelo integral de olor de codificación. Este protocolo describe un método para facilitar la identificación de alto rendimiento de ligandos de receptores olfativos y cuantificación de la activación del receptor.

Análisis de alto rendimiento de los mamíferos receptores olfativos: Medición de la activación del receptor a través de actividad luciferasa

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

Fisiológicamente, los receptores odorantes son activados por moléculas odorantes inhaladas en la fase de vapor. Sin embargo, más sistemas in vitro utilizan la estimulación olfativa de fase líquida. Aquí, presentamos un método que permite en tiempo real monitoreo in vitro de la activación del receptor odorante al estímulo odorante en fase de vapor.

En tiempo real en el seguimiento de Vitro de la activación del Receptor odorante por un olor en la fase de Vapor

El protocolo presentado en este estudio ilustra la efectividad del Detector de Diferencia de AMPc In Situ  en la medición de AMPc a través de dos métodos. Un método utiliza un espectrofotómetro de lectura de placa de 96 pocillos con celdas HEK-293. El otro método muestra células HASM individuales bajo un microscopio fluorescente.

Dinámica de cAMP en tiempo real en células vivas utilizando el detector de diferencia de cAMP fluorescente in situ

Neuronas olfativas del receptor (ORNs) convertir señales de olor primero en un receptor de corriente que a su vez desencadena los potenciales de acción que se transmiten a las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio. Aquí se describe la técnica de pipeta de succión de grabar simultáneamente el receptor de odorizantes de la corriente inducida y los potenciales de acción de ORNs ratón.

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Aprende a medir la activación de receptores de olor en células vivas mediante un ensayo de cAMP en tiempo real. Este método permite evaluar eficientemente la interacción entre odorantes y receptores.

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

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