Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

El objetivo general de este ensayo de AMP cíclico de alto rendimiento en tiempo real es evaluar los odorantes frente a los receptores de odorantes y viceversa. Dado que los ratones son útiles para investigar el funcionamiento de los receptores odorantes, ya que permiten cribados a mayor escala tanto de los receptores odorantes como de los ligandos, así como cartelizaciones farmacológicas de un par receptor-ligando de interés. La principal ventaja de esta técnica es que podemos evaluar la activación del odorante al receptor de forma eficiente y fiable.

Sistema heterólogo de expresión de odorante a receptor utilizando células vivas. Comience observando las células Hana3A bajo un microscopio de contraste de fase para garantizar la viabilidad celular y estimar la confluencia. A continuación, aspire todo el medio de la placa de cultivo celular.

Y lave las células agregando 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato en la placa, agitando la placa y aspirando el PBS. A continuación, añade al plato los tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,5%. Deje la tripsina en las células durante un minuto o hasta que todas las células estén a flote.

Inactive la tripsina agregando 5 mililitros de MEM con 10% de FBS y pipeteando hacia arriba y hacia abajo para romper trozos de masa celular. Después de realizar un recuento de células, transfiera 2x10 a la sexta célula por placa de 96 pocillos para transfectarlas a un tubo de 15 mililitros. Es importante que calcule el número correcto de células que se prepararán en una placa de 96 pocillos para evitar el crecimiento excesivo o insuficiente de células antes de la estimulación.

Centrifugar los tubos a 200 veces G durante cinco minutos. Y luego aspirar el sobrenadante sin perturbar la paleta de celdas. Agregue seis mililitros de medio sin antibióticos por cada placa de 96 pocillos y pipetee hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas de aire para romper trozos de la masa celular.

Transfiera las celdas suspendidas a un depósito. Con una pipeta multicanal, pipetee 50 microlitros de células en cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.

Antes de la transfección, observe las células plateadas bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia adecuada de aproximadamente 30 a 50% por pocillo y luego regrese a la incubadora. Siga el constructo de odorante a receptor marcado con fila, los constructos de factor accesorio y el constructo de variante de biosensor AMP cíclico. A continuación, prepare una mezcla de transfección de plasma en 500 microlitros de MEM para cada placa de 96 pocillos.

A continuación, prepare una mezcla de transfección que contenga 18 microlitros de reactivo de transfección mediado por lípidos en 500 microlitros de MEM. Mezcle la mezcla de transfección con la mezcla de plasma pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Después de la incubación, detenga la reacción agregando 5 mililitros de MEM con 10% de FBS a la mezcla de transfección. A continuación, extienda una capa gruesa de toallas de papel estériles en la campana de cultivo celular. Tome una placa de 96 pocillos con células de la incubadora.

Golpee suave y repetidamente el plato boca abajo sobre la pila de toallas de papel para que el medio sea completamente absorbido por la toalla de papel. Transfiera 50 microlitros de la mezcla de transfección combinada a cada pocillo de la placa de 96 pocillos e incube durante la noche durante 18 a 24 horas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Puede manejar la transfección y el programa de estimulación debe persistir en el instrumento para más de una placa de 96 pocillos se prueba en un experimento para que todas las placas se reflejen después de la misma transfección y el intervalo de exposición de los destiladores.

Antes de la estimulación, observe las células transfectadas bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia adecuada del 50 al 80% por pozo antes de regresar a la incubadora. A continuación, prepare el medio de estimulación añadiendo 10 pilas milimolares y cinco milimolares de glucosa a la solución salina equilibrada de Hanks. Descongele 55 microlitros de alcaustres de reactivos de sustrato de ensayo AMP cíclico en tiempo real en hielo.

Prepare una solución de abrasión igual al 2% mezclando 55 microlitros del reactivo de sustrato y 2.750 microlitros de medio de estimulación. Después de extender una capa gruesa de toallas de papel en el banco, golpee suave y repetidamente el plato boca abajo sobre las toallas de papel para que las toallas de papel absorban el medio de transfección. Lave las células pipeteando 50 microlitros de medio de estimulación en cada pocillo.

Golpee suave y repetidamente el medio de estimulación de la placa de 96 pocillos. Pipetear 25 microlitros de solución de equillibración al 2% en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos horas. Antes del final del tiempo de incubación, diluya las soluciones madre odorantes descongeladas hasta la concentración de trabajo y el medio de estimulación.

Antes de agregar odorante, use un lector de placas de quimioluminiscencia para medir el nivel de luminiscencia basal de la placa. Retire rápidamente la placa del lector de placas y agregue 25 microlitros de las diluciones de odorante a cada pocillo. A continuación, inicie inmediatamente la medición continua de la luminiscencia de todos los pozos durante 20 ciclos en 30 minutos.

Se examinaron 379 receptores de odorantes humanos únicos frente a 30 micromolares de muscono mediante el ensayo AMP cíclico en tiempo real. Los bloques coloreados a lo largo del eje X indican diferentes familias de receptores de olores humanos. El eje Y representa la luminiscencia normalizada 30 minutos después de la adición del odorante cuando la respuesta alcanzó el máximo para el control positivo.

Se indica la respuesta de OR5AN1. Esta figura muestra las mediciones en tiempo real de la activación de OR5AN1 por diferentes concentraciones de muscona y el resultado de un control negativo sin olor. La flecha indica el punto de tiempo de la adición de oderante.

Aquí, se muestra una curva de respuesta a la concentración de OR5AN1 frente al muscona 30 minutos después de la adición de oderante. La técnica descrita aquí toma un total de tres días, comenzando con una placa de caldo de niveles de cultivo el primer día. Una vez dominado, el proceso del último día puede completarse en tres horas para cada placa de 96 pocillos si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manejar la activación de los receptores de oderant utilizando un ensayo de AMP cíclico para aprovechar los resultados.