Name: Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprende a enriquecer agregados de proteína insoluble en detergente de tejido cerebral humano postmortem. Este protocolo de fraccionamiento facilita la identificación de proteínas mal plegadas en enfermedades neurodegenerativas.

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Los autores agradecen a los Drs. Jim Lah y Allan Levey, Departamento de Neurología de Emory, para sugerencias y comentarios. Este trabajo fue financiado en parte por la Asociación de medicina acelerar concesión (U01AG046161-02), el Emory Alzheimer centro de investigación de la enfermedad (P50AG025688) y un Instituto Nacional del envejecimiento conceden (R01AG053960-01) a N.T.S. Esta investigación también fue apoyada en parte por el núcleo de la neuropatología de la donacion de Emory Neurociencia NINDS base instalaciones, P30NS055077.

declaración de ética: todos los tejidos del cerebro fueron obtenidos de la Emory de Alzheimer &#39; s enfermedad investigación centro (ADRC) Banco de cerebros. Tejidos humanos post mortem fueron adquiridos bajo adecuados protocolos de la Junta de revisión institucional (IRB).
 1. homogeneización y fraccionamiento <ol><li>selección de tejido Nota: congelados de tejido post mortem corteza frontal de control sano (Ctl) y patológico casos confirmados de AD fueron seleccionados de la Emory Banco de cerebros ADRC (n = 2). Evaluación neuropathological post mortem de la distribución de la placa amiloide fue realizada según el consorcio establecer un registro de Alzheimer &#39; s enfermedad semicuantitativo de puntuación criterios 24, aunque patología neurofibrilares fue evaluado de acuerdo con el sistema de estadiaje de Braak. 16 <ol><li>obtener congelados de tejido cerebral post mortem de control sano (Ctl) y patológico confirmó casos de AD. Utilizando contenedores de hielo seco, pinzas y una navaja, suprimir ~ porciones de 250 mg de materia gris de cada muestra de tejido en desechables previamente tarado pesan barcos, teniendo cuidado de evitar que el tejido descongelado. Registrar el peso de cada pieza a ser homogeneizado.</li>
		<li>Impuesto especial ~ 250 mg de materia gris usando pinzas y navajas por inspeccionar visualmente para localizar la interfaz entre el exterior materia gris y materia blanca interior. Evitar que la materia blanca y lo más importante, cualquier vasos sanguíneos o regiones sangrientas, meninges o aracnoides. Mantener el tejido congelado durante el proceso de corte trabajando rápidamente y con frecuencia colocando peso barco con tejido cerebral en contenedores de poliestireno con hielo seco</li>
		<li>Registrar el peso exacto de la materia gris de cada pieza congelada utilizando una balanza analítica. Calcular el volumen de tampón bajo en sal (LS) (ver tabla 1) necesarios para la homogeneización de dounce (5 mL/g o 20% w/v).</li>
		<li>Preparar 10 mL LS de tampón 1 x inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel y frialdad de hielo.</li>
		<li>Eliminar el tejido pesado y pesaje del barco de hielo seco y dados en trozos de aproximadamente 2 x 2 mm como deshiela. Transfiéralo a un tubo de homogeneizador de 2 mL dounce previamente enfriado en hielo.</li>
		<li>Añadir 5 mL/g (20% w/v) de tampón de helado bajo en sal (LS) con 1 X inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel.</li>
		<li>Homogeneizar el tejido de cerebro en hielo, mediante aproximadamente 10 movimientos de separación alta Maja A y 15 golpes de mortero de baja holgura B.</li>
		<li>Transferencia de homogeneizado de todos a un tubo de polipropileno de 2 mL con un pipeta Pasteur de vidrio. Etiquetar el tubo con &#8220; TH &#8221; (homogenado Total), el tejido del caso número y volumen de homogenado. alícuota 0,8 mL en un tubo de 1,5 mL etiquetado. Cualquier exceso homogeneizado puede ser semejantemente alícuotas y almacenados a -80 ° C.</li>
		<li>a cada 0,8 mL de alícuota, añada 100 μl de 5 M NaCl y sarkosyl 10% (p/v) a concentraciones de 0,5 y 1% w/v, respectivamente. Tubos de mezclar bien por inversión e incubar en hielo por 15 minutos los tubos etiqueta con &#34; TH-S &#34; (homogeneizado Total-Sarkosyl) para indicar que los homogenados en sarkosyl-buffer (tabla 1).</li>
		<li>Someter a ultrasonidos cada tubo de impulsos tres 5 s en amplitud de 30% en el hielo (intensidad máxima = 40%) utilizando una sonda de microtip.</li> <li>determinar las concentraciones de proteína de los homogenados del ácido bicinchoninic (BCA) ensayo 25 método. 
		Nota: La concentración promedio de proteína de TH S homogenados preparados en LS de 5 mL por gramo de tejido es 15-20 mg/mL. Los homogenados pueden ser fraccionada inmediatamente o almacenadas a-80 ° C hasta su uso.</li>
		<li>TH-S diluir homogenados a 10 mg/mL con buffer de sark helada (tabla 1) 1 x inhibidores de la proteasa y fosfatasa.</li>
		Proteína de <li>transferencia 5 mg (0,5 mL) de cada homogenado TH S en 500 μl policarbonato ultracentrífuga tubos y par-equilibrio con tampón de sark. Cargar tubos en un rotor previamente enfriada y ultracentrífuga a 180.000 x g durante 30 min en sobrenadantes de transferencia sarkosyl-soluble 4 ° C. (S1) para tubos de 1,5 mL y guardar a -80 ° C. 
		Nota: (Lavado opcional) Añadir 200 μL de tampón de sark en la ultracentrífuga tubos que contienen las fracciones insolubles en detergente (P1) y desalojar los pellets (P1) de la parte inferior de los tubos de la ultracentrífuga utilizando una pipeta de 200 μl.</li>
		Tubos de <li>brevemente pulso spin la invertida para 2-3 s (&#8804; 2.500 x g) en una microcentrífuga para transferir el pellets (P1) y buffer a los tubos de 1,5 mL a continuación. Resuspender los gránulos insolubles (P1) en el búfer de sark transfiriendo hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de la pelotilla se interrumpe.</li>
		<li>El equilibrio de par y centrifugar a 180.000 x g durante un adicional 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Descarte el sobrenadante del lavado opcional (S2) e incubar los pellets sarkosyl insoluble (P2) en 50-75 μl de tampón de urea (cuadro 1) con 1 x PIC (inhibidor de proteasa y fosfatasa cóctel) durante 30 min a temperatura ambiente para solubilizar el pellets de. 
		Nota: Urea caliente la memoria intermedia a la temperatura ambiente antes de su uso para evitar la precipitación de la SDS. Para aplicaciones sensibles al detergente, omitir SDS desde el búfer de urea y considerar lavado el precipitado insoluble (P2) en tampón salino bajo antes de resuspender en tampón urea.</li>
		<li>Transferir las pelotillas resuspendidas (P2) a tubos de 0.5 mL y uso breve (1 s) microtip sonicación en 20% de amplitud (intensidad máxima = 40%) para solubilizar completamente las pelotillas.</li>
		<li>Determinar las concentraciones de proteína del sarkosyl-soluble (S1) y - insolubles fracciones (P2) con el BCA método de ensayo. Utilice estas fracciones inmediatamente o almacenar a-80 ° C hasta su uso.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>Western blotting Nota: borrar occidental fue realizado según los procedimientos previamente divulgados con leves modificaciones. 5 , 10 <ol><li>preparar 40 μg muestras de homogenados total (TH-S), soluble en sark (S1) y fracciones de sark-insoluble (P2) en el tampón de muestra Laemmli SDS-page de X 1 con pH de 5 mM TCEP 7. Incubar las muestras a 95 ° C por 5 min</li>
		<li>Carga de muestras en un prefabricado 10-pozo 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel. Electrophorese 80 V para el primer centímetro (10 min) y 120 V para el resto (60 min) o hasta que el tinte de seguimiento alcance la parte inferior del gel.</li>
		<li>Utilizar una nueva hoja de afeitar y un cuchillo de gel para split-abrir el cartucho de gel prefabricado. Con cuidado corte el peines y parte inferior del gel con una cuchilla de afeitar nueva.</li>
		<li>Volver a suspender los pellets insolubles (P1) en 200 μL de tampón de sark con 1 x PIC mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
		<li>Transferencia a una membrana de nitrocelulosa de 0.2 μm utilizando un método de transferencia en seco en una máquina de Blot (ver la tabla de materiales).</li>
		<li>Bloquear la membrana en solución amortiguadora de bloqueo (BB) sin Tween 20 durante 30 min, seguida con BB con 0,05% Tween 20 (BB/T) para 30 minutos. Después de bloquear, enjuagar la membrana en TBS/T (0,1% Tween 20) por 5 min eliminar el exceso de tampón bloqueo.</li>
		1:1,000 de <li>preparar diluciones de los anticuerpos primarios pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 y EEA1 en BB/T (0,05% Tween 20).</li>
		<li>Incubar las membranas en solución de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C con agitación circular. Enjuagar la membrana en TBS/T 3 x 15 min</li>
		Anticuerpo secundario cercano-IR de <li>punta de prueba de la membrana con una dilución de 1: 20.000 de la marcada con fluorescencia, en BB/T durante 60 min a temperatura ambiente en oscuridad en coctelera. Enjuagar la membrana para 3 x 10 min en TBS/T y 2 x 5 minutos en TBS.</li>
		<li>Analizar la membrana usando un infrarrojo sistema de la longitud de onda de excitación apropiada (por ejemplo 700 nm (canal rojo) para tinte infrarrojo 680 cabra anti-mouse IgG (H+L) secundaria y 800 nm (canal verde) para tinte infrarrojo 790 burro anti-rabbit IgG (H+L de imagen secundaria)).</li>
		<li>Uso del software de proyección de imagen para cuantificar la intensidades de la señal y realizar mediciones de densitometría según el fabricante &#39; instrucciones, asegurando el ajuste de auto-fondo se establece en promedio el fondo entero.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este documento presentamos y discutir un protocolo abreviado de detergente-fraccionamiento de solo paso que es aplicable a una amplia variedad de aplicaciones experimentales que van desde análisis de proteómica basada en espectrometría de masa al mal plegamiento de análisis funcional de la proteína y western blot. 5 , 6 , 7 , 10 esta metodología es más eficaz cuando se utiliza para el estudi...

Enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las enfermedades de prión estrechamente relacionados son proteinopatías caracterizada por la acumulación gradual de agregados de proteína insoluble en detergente en el cerebro con el acompañamiento cognitivo disminución. 1 , 2 esta característica patológica común se cree que desempeñan un papel central en la etiología y la patofisiología de estas enfermedades neurodegenerativas. 2 estos agregados consisten en típicamente poliméricas fibras amiloides, que se componen de unidades de proteínas mal plegadas que Cruz β-estructura. 1 , 2 , 3 , 4 bioquímico, agregados amiloides son altamente resistentes a la desnaturalización térmica o química y solubilización,3 que presenta retos únicos para su purificación, análisis y estudian por medio de técnicas bioquímicas tradicionales. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , la fracción de proteína insoluble en detergente ha sido el foco de mucha investigación en la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas que implica la acumulación de proteínas mal plegadas. 6 , 12 , 13 , 14
Técnicas de fraccionamiento bioquímico a menudo han sido utilizadas para enriquecer la fracción insoluble en detergente de homogenados de cerebro post mortem. 6 , 12 , 13 , 14 uno de los métodos más comunes consiste en la extracción secuencial de homogenados de tejido con tampones y detergentes de aumentar rigor, seguido por ultracentrifugación para dividir las fracciones solubles e insolubles. Un protocolo comúnmente usado fraccionamiento secuencial6,14 implica la homogeneización de las muestras de tejido congelado en un tampón libre de detergente bajo en sal (LS) y los pellets insolubles resultantes entonces son extraídos secuencialmente con buffers que contengan alta sal, detergentes no iónicos, alta sacarosa, detergentes iónicos y finalmente chaotropes como urea. 6 , 14 un inconveniente obvio de tales protocolos de fraccionamiento secuencial es el substancial del tiempo y el compromiso de la mano de obra necesaria para completarlos. Homogeneización y ultracentrifugación, un protocolo típico fraccionamiento de cinco pasos puede tomar varias horas o incluso días. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 además, tantos agregados de proteína patológica permanecen insolubles en casi todos las más duras condiciones19,20 la mayoría de las fracciones generadas son de valor limitado. Así, los pasos de fraccionamiento menos-rigurosos utilizando altas concentraciones de sal y detergentes no iónicos son en gran medida redundantes.
Estudios previos han demostrado que el detergente iónico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) es un excelente candidato para un protocolo simplificado solo paso detergente fraccionamiento. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 como un desnaturalización detergente sarkosyl es lo suficientemente estricta como para solubilizar la gran mayoría de proteínas de forma nativa plegadas en cerebro sin solubilización agregados de proteínas mal plegadas compuestos de beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilada (pTau),6 proteína de unión a ADN TAR 43 (TDP-43),14 alfa-sinucleína,12,13 tembladera,23 o U1 ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNPs U1) como U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Como sarkosyl es menos estricto que el dodecil sulfato de sodio detergente aniónico ubicua (SDS), conserva formas oligoméricas menos robustas de agregados de proteínas mal plegadas que no pueden soportar el tratamiento de la SDS. 9
Anteriormente, hemos descrito un protocolo abreviado de detergente-fraccionamiento que logra resultados comparables a la metodología de fraccionamiento secuencial más laboriosa. 5 por omitir las medidas menos estrictas de fraccionamiento, hemos sido capaces de desarrollar un protocolo de fácil fraccionamiento solo paso para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem. 5 este protocolo detallado descrito en este documento es adecuado para una amplia gama de aplicaciones experimentales que van desde el Western Blot y análisis de proteómica basada en espectrometría de masa mal plegamiento de proteínas funcionales y siembra de agregación. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa, sin EDTA (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa</td></tr><tr><td>Sistema de desmembración sónica (ultrasonidos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>ultrasonido de micropunta</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optimax TLX</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>ultracentrífuga refrigerada</td></tr><tr><td>Rotor TLA120.1</td><td>Rotor de ultracentrífuga</td> <td>Beckman Coulter</td><td>362224</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) tubos de policarbonato, pared gruesa</td> Tubos de ultracentrífuga <td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>para rotor TLA120.1</td></tr><tr><td>Tampón de muestra 4X SDS</td><td></td> Solución casera <td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP, pH neutro</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>agente reductor</td></tr> <tr><td>(TBS) tampón de bloqueo</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>tampón de bloqueo</td></tr> <tr><td>(TBS) tampón de bloqueo + 0,05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>tampón de bloqueo y diluyente</td></tr><tr><td>de anticuerpos 4-12% Bolt Bis-Tris Plus geles, 10 pocillos</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>geles prefabricados SDS-PAGE</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>sal sódica de N-laurolilsarcosina (sarkosyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Tau-2 (pan tau)</td><td>Anticuerpos Chemicon</td><td>MAB375</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo antifosfo-treonina 231 Tau</td><td>Anticuerpos Millipore</td><td>MAB5450</td><td></td></tr><tr><td>Antifosfo-seroína 202 y treonina 205 Anticuerpo Tau (AT8)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpos Anticuerpo anti-antígeno endosoma precoz 1 (EEA1)</td><td>abcam</td><td>Anticuerpos ab2900</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 anticuerpo secundario IgG (H+L) anticuerpo secundario anti-ratón de cabra</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 anti-conejo anti-conejo anticuerpo secundario IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpos iBlot2 Sistema de transferencia en seco</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Transferencia</td></tr><tr><td>iBlot2 Pilas de transferencia, nitrocelulosa, mini</td><td>Transferencia de</td><td>IB23002</td><td>Thermo Fisher Gel</td></tr></tbody></table>

enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

En este estudio, se describe un protocolo abreviado fraccionamiento solo paso para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem. El detergente iónico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) efectivamente solubiliza proteínas forma nativa plegadas en el tejido cerebral que permite el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de una amplia gama de proteinopatías neurodegenerativas, tales como Enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica y enfermedades priónicas. Control humano y los tejidos del cerebro post mortem AD fueron homogeneizadas y sedimentados por ultracentrifugación en presencia sarkosyl enriquecer agregados de proteína insoluble en detergente incluyendo patológica tau fosforilada, el componente principal de ovillos enredos en AD. Western Blot demostró la solubilidad diferencial de agregados tau fosforilado y la proteína soluble en detergente, temprano Endosome antígeno 1 (EEA1) en control y el cerebro de AD. Análisis proteómico también revelaron enriquecimiento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) y apolipoproteína E (APOE) en las fracciones insolubles en sarkosyl de AD cerebral comparados con los de control, consistente con anteriores estrategias de fraccionamiento de tejido . Así, este Protocolo simple enriquecimiento es ideal para una amplia gama de aplicaciones experimentales que van desde borrar occidental y funcional de la proteína ensayos de agregación Co proteómica basada en espectrometría de masa.

El protocolo abreviado solo paso sarkosyl-fraccionamiento fue utilizado para enriquecer a agregados de proteína insoluble en detergente de control y cerebro post mortem AD (figura 1). Proteínas de fracciones TH S, S1, S2 y P2 fueron resueltas por SDS-PAGE, de 15 min en Coomassie azul fijador tampón seguido de tinción suave con tampón de tinción G-250 azul brillante de Coomassie. El paso de resuspensión es opcional puesto que había niveles indetectables de pro...

Se describe un protocolo abreviado de fraccionamiento para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem.

Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

El objetivo general de este protocolo de fraccionamiento es enriquecer agregados proteicos insolubles en detergente a partir de tejido cerebral postmortem humano. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurodegeneración, como la identificación y caracterización de agregados proteicos mal plegados en enfermedades. La principal ventaja de esta técnica es el enriquecimiento rápido y aislamiento de agregados proteicos insolubles en detergente a partir de tejido cerebral en un breve período de tiempo.Este procedimiento será demostrado por Tram Nguyen, una técnica de mi laboratorio. Obtenga tejido cerebral postmortem congelado de controles sanos y de casos con diagnóstico patológico confirmado de AD. Utilice pinzas y una hoja de bisturí para extraer porciones de aproximadamente 250 miligramos de materia gris de cada muestra de tejido. Deje que el segmento cerebral se descongele durante un minuto.Ahora, corte un trozo de tejido en cubos de aproximadamente dos milímetros mientras se descongela. Transfiera a un tubo de homogenizador Dounce de dos mililitros previamente enfriado sobre hielo. Recuerde evitar la materia blanca y cualquier vaso sanguíneo grande.Trabaje rápidamente y coloque el tejido en embarcaciones desechables para pesar TARE. Tenga cuidado de evitar que el tejido se derrita colocando con frecuencia la embarcación de pesaje con el tejido cerebral en recipientes de poliestireno con hielo seco. Después de diseccionar y pesar todas las piezas de tejido necesarias, retire una embarcación de pesaje que contenga una pieza de tejido del hielo seco.A continuación, agregue cinco mililitros de tampón frío con bajo contenido de sal y una mezcla de inhibidores de proteasa y fosfatasa por cada gramo de tejido, y homogenice en hielo utilizando aproximadamente 10 movimientos con el pistilo A de gran holgura y 15 movimientos con el pistilo B de baja holgura. Luego, utilice una pipeta Pasteur de vidrio de nueve pulgadas para transferir cada homogenato a un tubo de polipropileno de dos mililitros etiquetado. Aliquote el homogenato restante en tubos adicionales de 1,5 mililitros etiquetados de manera similar para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius. Para continuar con la fraccionamiento, agregue 100 microlitros de cloruro de sodio cinco molar y 100 microlitros de sarkosyl al 10 por ciento a cada alícuota de 0,8 mililitros.Mezcle bien mediante inversión. A continuación, incube en hielo durante 15 minutos. Tras la incubación, utilice un sonicador equipado con una sonda de micropunta para aplicar tres pulsos de cinco segundos a una amplitud del 30 por ciento.Después de utilizar el método del ácido bicinconínico para determinar las concentraciones de proteína de los homogenatos, agregue tampón sark frío con inhibidores de proteasa y fosfatasa a cada muestra hasta una concentración final de 10 miligramos por mililitro. Luego, transfiera 500 microlitros de cada muestra a tubos de ultracentrífuga de policarbonato de 500 microlitros. Coloque los tubos en un rotor previamente enfriado y ultracentrifugue a 180.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.Tras la centrifugación, transfiera los sobrenadantes solubles en sarkosyl S1 a tubos de 1,5 mililitros y almacénelos a menos 80 grados Celsius. Añada 200 microlitros de tampón sark a los tubos de ultracentrífuga que contienen las fracciones P1 insolubles en detergente y utilice la punta de pipeta para desprender los pellet del fondo de los tubos de ultracentrífuga. A continuación, transfiera los pellet P1 re-suspendidos a nuevos tubos de ultracentrífuga de 500 microlitros, equilíbrelos por pares y centrifugue a 180.000 × g durante 30 minutos adicionales a cuatro grados Celsius.Deseche el sobrenadante S2. A continuación, agregue de 50 a 75 microlitros de tampón de urea con una mezcla de inhibidores de proteasa y fosfatasa a los precipitados insolubles en sarkosyl e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para solubilizar el precipitado P2. Después de la incubación, transfiera los precipitados P2 re-suspendidos a tubos etiquetados de 0,5 mililitros y solubilice completamente los precipitados, utilizando una sonicación breve de un segundo con microsonda al 20 por ciento de amplitud.Determine las concentraciones de proteína de las fracciones solubles e insolubles en sarkosil mediante el método del ensayo BCA. Prepare muestras de 40 microgramos de la fracción S1 soluble en sarkosil y de la fracción P2 insoluble en sarkosil del homogenado total en tampón de muestra para electroforesis SDS-PAGE de Laemmli al uno-x con TCEP cinco milimolar a pH siete. Incube las muestras a 95 grados Celsius durante cinco minutos.Cargue las muestras en geles precolados de SDS-PAGE Bis-Tris del cuatro al 12 por ciento con 10 pocillos. Realice la electroforesis a 80 voltios durante el primer centímetro y a 120 voltios durante aproximadamente una hora o hasta que el colorante marcador alcance la parte inferior del gel. Sumerja los casetes de gel precolados en agua destilada y luego utilice una cuchilla nueva y un cuchillo para geles para abrirlas.Corte suavemente los peines y la parte inferior de cada gel con una cuchilla de afeitar nueva. Transfiera a membranas de nitrocelulosa de 0,2 micrones utilizando un método de transferencia seca en una máquina de blotting. Después de la transferencia, bloquee las membranas en tampón de bloqueo sin Tween-20 durante 30 minutos, seguido de tampón de bloqueo con Tween-20 al 0,5 por ciento durante 30 minutos.Después de bloquear, enjuague las membranas en TBS con Tween-20 al 0,1 por ciento durante cinco minutos para eliminar el exceso de tampón de bloqueo. Prepare diluciones 1:1.000 de los anticuerpos primarios en tampón de bloqueo con Tween-20 al 0,5 por ciento. Aquí se utilizan Phospho-Tau pT231 y EEA1.Incube las membranas en la solución de anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación circular. Al día siguiente, enjuague las membranas en TBS con 0,1 por ciento de Tween-20 tres veces durante 15 minutos cada vez. Incube las membranas con una dilución 1:20.000 del anticuerpo secundario fluorescente marcado con infrarrojo cercano y tampón bloqueante con 0,5 por ciento de Tween-20 durante 60 minutos a temperatura ambiente en oscuridad sobre un agitador.Después de la incubación, enjuague la membrana tres veces durante 10 minutos en TBS con 0,1 por ciento de Tween-20 y dos veces en TBS durante cinco minutos cada vez. Escanee la membrana utilizando un sistema de imagen infrarroja a la longitud de onda de excitación adecuada para el anticuerpo secundario utilizado. Esta gel teñida con Coomassie muestra 20 mcg de proteína de las fracciones TH-S, S1, S2 y P2.El análisis por inmunotransferencia demuestra claramente que en el cerebro con EA, las agregaciones patológicas de Tau fosforilada de alto peso molecular son insolubles en sarkosil, y quedó muy poca Tau fosforilada en las fracciones de sarkosil. EEA1 se utilizó como marcador general para la mayoría de las proteínas nativas no patológicas que son inherentemente solubles en sarkosil y se distribuyen en la fracción S1 tanto en el cerebro control como en el de EA. Cabe destacar que hubo una señal ligeramente menor para EEA1 en la fracción soluble en comparación con la fracción TH-S, lo que indica que un pequeño grupo de EEA1 probablemente sea insoluble en sarkosil, aunque por debajo del límite de detección mediante inmunotransferencia con este anticuerpo específico.Esta figura muestra el análisis proteómico de proteínas patológicas de la EA mediante un protocolo de fraccionamiento de un solo paso o múltiples pasos. La técnica de fraccionamiento de un solo paso puede ser ventajosa para proteínas de baja abundancia, ya que las pérdidas totales de muestra se reducen significativamente. Al realizar este procedimiento, es importante recordar extraer la mayor cantidad posible de sustancia blanca del tejido cerebral.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la proteómica basada en espectrometría de masas para identificar y caracterizar los componentes proteicos principales de los agregados patológicos en sus enfermedades degenerativas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante para el estudio de las marcas epigenéticas en la cromatina, porque la mayoría de los ensayos de la falta de resolución única célula. Las neuronas normalmente se entremezclan con la glía y otras células no neuronales. Ofrecemos un protocolo para extraer y recoger los núcleos neuronales del cerebro humano.

Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Se describe una técnica para la preparación de aclarar homogeneizados humanos cortical, la separación de proteínas por SDS-PAGE, la recuperación de antígeno y la inmunotransferencia con un anticuerpo para el péptido Aß. El uso de este protocolo, estamos constantemente detectar Aß monoméricos y multimérica en el tejido cortical de los seres humanos con la patología de Alzheimer.

Detección SDS-PAGE/Immunoblot de multímeros Aß en el tejido cortical humano homogeneizados utilizando antígeno de recuperación del epítopo

Una nueva especie de proteína priónica celular...

Aislamiento de oligómeros de PrP soluble e insoluble en el cerebro humano normal

Este video demuestra el protocolo para aislar fibrillas de amiloide del extracto de tejido cerebral de ratón utilizando centrifugación en gradiente de densidad y digestión de proteínas no amiloides.

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Este video explica el proceso de aislar y enriquecer agregados de proteínas insolubles en detergente a partir de tejido cerebral humano postmortem congelado. Demuestra los pasos clave, como la homogeneización, el tratamiento con detergente, la sonicación y la ultracentrifugación para separar y purificar los áridos insolubles. El paso final consiste en solubilizar los agregados en tampón de urea para su posterior análisis.

Aislamiento de agregados de proteínas insolubles en detergente a partir de tejido cerebral humano post mortem

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez más insoluble/agregada a partir de tejido cerebral humano post-mortem. Mediante la utilización de tampones con una fuerza detergente creciente y técnicas de ultracentrifugación de alta velocidad, se pueden examinar las propiedades variables de la agregación α-syn en tejidos enfermos y no enfermos.

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Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Este método de purificación bioquímica con análisis proteómico basado en espectrometría de masas facilita la caracterización robusta de los núcleos de fibrilla amiloide, lo que puede acelerar la identificación de objetivos para prevenir la enfermedad de Alzheimer.

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Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades

Aprende a enriquecer agregados de proteína insoluble en detergente de tejido cerebral humano postmortem. Este protocolo de fraccionamiento facilita la identificación de proteínas mal plegadas en enfermedades neurodegenerativas.

Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

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