Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general de este procedimiento es generar mapas de todo el genoma de las interacciones proteína-ADN in situ con alta resolución y bajo fondo, sin necesidad de reticulación de formaldehído, solubilización de cromatina o anticuerpos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transcripción, como dónde se asocian varios factores reguladores con la cromatina, en relación con las regiones reguladoras de genes. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona mapas de unión genómica de alta resolución con un fondo insignificante y evita las limitaciones asociadas con los protocolos estándar ChEC-seq.

El demostrador del procedimiento estará a cargo de Sebastian Grunberg, mi colega del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson. En la tarde o noche del día anterior al experimento, comience un precultivo de la cepa de uso experimental. Inocular tres mililitros de peptona dextrosa usada, o un medio selectivo apropiado con una sola colonia de la cepa, que lleve el factor marcado con MNasa.

Incube este cultivo durante la noche en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados. A la mañana siguiente, diluya el cultivo durante la noche en 50 mililitros de medio a una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,2 a 0,3. Incubar el cultivo en la incubadora agitadora hasta que alcance una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,5 a 0,7.

Prepare la cantidad necesaria de tampón A más aditivos y manténgala a temperatura ambiente durante el procedimiento. Preparar tubos de microfuga para la recolección de muestras. Para cada nuevo factor analizado, recoja muestras sin adición de calcio y agregue 30 segundos, un minuto, 2.5 minutos, 5 minutos y 10 minutos después de la adición de calcio.

A cada tubo agregue 90 microlitros de solución de parada y 10 microlitros de SDS al 10%. Cuando el cultivo haya alcanzado una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,5 a 0,7, decantar el cultivo en un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugar a 1.500 veces g durante un minuto a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender completamente las células en un mililitro de tampón A y transfiera las células resuspendidas a un tubo de microfuga.

Granular las células resuspendidas en un microfófugo a 1.500 veces g durante 30 segundos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender completamente las células en un mililitro de tampón A pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Granule las células resuspendidas a 1.500 veces g durante 30 segundos a temperatura ambiente.

Retire el sobrenadante, vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón A y vuelva a centrifugar. Después de eliminar el sobrenadante, resuspender completamente las células en 570 microlitros de tampón A. Añadir 30 microlitros de 2% de digitonina para facilitar la permeabilización de las células, e invertir para mezclar. Permeabilizar las células en un bloque de calor a 30 grados centígrados durante cinco minutos.

Pipetear la reacción hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución uniforme de las células. Como control negativo, transfiera 100 microlitros de alícuota de células permeabilizadas a un tubo de microfuga que contenga solución de parada y SDS, y vórtice brevemente para mezclar. Antes de comenzar el curso del tiempo, es fundamental tener los tubos de solución de parada, la pipeta, las puntas de pipeta y un temporizador junto a los bloques de calor para que los primeros puntos de tiempo se puedan recopilar de manera eficiente.

Para iniciar el curso del tiempo, agregue 1,1 microlitros de cloruro de calcio de un molar a las células permeabilizadas para activar la MNasa, e invierta varias veces rápidamente para mezclar. Regrese inmediatamente la reacción mixta a 30 grados centígrados y ponga en marcha un temporizador. En cada punto de tiempo que se va a recolectar, pipetear la reacción hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución uniforme de las células, y luego retire una alícuota de 100 microlitros de células permeabilizadas a un tubo de microfuga que contiene solución de parada y SDS.

Vórtice brevemente para mezclar. Una vez que se hayan recolectado todos los puntos de tiempo, agregue cuatro microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K a cada muestra. Agite brevemente para mezclar e incubar a 55 grados centígrados durante 30 minutos.

Añadir 200 microlitros de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico a cada muestra, agitar vigorosamente para mezclar y centrifugar a máxima velocidad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire la fase acuosa a un nuevo tubo. Agregue 30 microgramos de glucógeno y 500 mililitros de etanol al 100%.

Agite vigorosamente para mezclar y precipite sobre hielo seco durante 10 minutos, o hasta que la solución esté viscosa. Granular el ADN precipitado centrifugando a máxima velocidad y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante y lavar cada pellet con un mililitro de etanol al 70% a temperatura ambiente.

Decanta el etanol y retira el resto invirtiendo y golpeando suavemente los tubos con una toalla de papel. Haga girar brevemente las muestras con una centrífuga de sobremesa, luego use una pipeta para eliminar el ehtanol residual, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Seque los gránulos al aire ambiente durante cinco minutos.

Mientras se secan los gránulos de ADN, haga una mezcla maestra de tampón Tris y ARNasa A para volver a suspender los gránulos una vez que se sequen, y vórtice para mezclar. Agregue 30 microlitros de la solución de ARNasa A a cada gránulo de ADN seco, vórtice para mezclar e incube a 37 grados Celsius durante 20 minutos para digerir el ARN. Después de 20 minutos, mezcle un microlitro de colorante de carga de ADN 6X con cinco microlitros de cada muestra y ejecute un gel de agarosa al 1,5% a 120 voltios durante 40 minutos.

Comience el procedimiento de selección del tamaño agregando a cada muestra, 75 microlitros de perlas SPRI en una solución de polietilenglicol. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar las perlas y la mezcla de ADN, y luego incuba a temperatura ambiente durante cinco minutos. Durante la incubación de perlas SPRI, prepare tubos de microfuga que contengan 96 microlitros de Tris de 10 milimolares de pH 8.0 y cuatro microlitros de cloruro de sodio de cinco molares para cada muestra.

Coloque los tubos que contienen las perlas y la mezcla de ADN en una rejilla magnética durante dos minutos para recoger las perlas en el costado del tubo, luego transfiera cada sobrenadante a un nuevo tubo que contenga Tris y cloruro de sodio. Agregue 200 microlitros de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico a cada muestra, vórtice para mezclar y centrifugar a máxima velocidad a temperatura ambiente durante cinco minutos. Retire cada fase acuosa a un nuevo tubo, agregue 30 microgramos de glucógeno y 500 microlitros de etanol al 100%.

Precipite el ADN en hielo seco durante 10 minutos o hasta que la solución sea viscosa. Granular el ADN precipitado centrifugando a máxima velocidad y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante y lavar cada pellet con un mililitro de etanol al 70%.

Decanta el etanol, eliminando el resto invirtiendo y golpeando suavemente los tubos con una toalla de papel. Haga girar brevemente las muestras con una centrífuga de sobremesa y utilice una pipeta para eliminar el etanol residual, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Seque los gránulos al aire ambiente durante cinco minutos.

Vuelva a suspender cada pellet seco en 25 microlitros de Tris pH 8. Determine la concentración de cada muestra mediante un ensayo de alta sensibilidad. La electroforesis del ADN en gel de agarosa a partir de un análisis de escisión endógena de cromatina de Reb1, un factor regulador general que se une a las regiones agotadas en nucleosomas, revela un aumento dependiente del calcio en la fragmentación del ADN a lo largo del tiempo, como lo indica el frotis, y finalmente la digestión completa del ADN genómico.

La visualización de los extremos de los fragmentos de un experimento de secuenciación de escisión endógena de cromatina Reb1 revela un enriquecimiento robusto de Reb1 sobre el fondo, derivado de la cepa MNasa libre después de 30 segundos de tratamiento con calcio. De manera similar, se observó una escisión sustancial del ADN mediante una fusión de la subunidad mediadora Med8 con MNasa, pero no impulsada por MNasa libre por el promotor Med8 un minuto después de la adición de calcio. Para comparar los datos de secuenciación de la escisión endógena de la cromatina Reb1 con la inmunoprecipitación de la cromatina y los datos de secuenciación de alto rendimiento, se centraron en el motivo 1.992 picos de Reb1 determinados por el método orgánico, y se determinó el recuento medio de fragmentos finales en cada posición de la base en una ventana de 100 pares de bases alrededor del punto medio del motivo.

Se observó una sorprendente asimetría y escisión con la mayoría de los extremos de los fragmentos liberados por Reb1-MNasa mapeados hacia el lado aguas arriba del motivo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día completo de trabajo, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar limitar el número de muestras analizadas en paralelo, para garantizar tiempos de pipeteo y manipulación precisos.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la transcripción caracterizaran, por primera vez, de manera inequívoca la asociación genómica de un complejo proteico del tamaño de un megadalton que no se une al ADN en la levadura. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar el método ChEC-Seq para el mapeo de todo el genoma de los sitios de unión a proteínas en el genoma de la levadura en ciernes.