Evaluación neuroconductual en un modelo murino de lesión de cerebro hipóxico-isquémica Neonatal

El objetivo general de la cirugía de lesión cerebral hipóxico-isquémica neonatal, seguida de pruebas cognitivas y motoras, es contar con un modelo murino para estudiar dichas lesiones y el daño cerebral relacionado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la lesión cerebral hipóxico-isquémica neonatal, como la forma en que estas lesiones afectan las funciones motoras y cognitivas. La principal ventaja de esta técnica es que es ampliamente conocida y comúnmente utilizada.

Es también un modelo preclínico para la parálisis cerebral y los accidentes cerebrovasculares neonatales. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la arteria carótida derecha unilateral es difícil de identificar. Realizando el procedimiento, junto conmigo, estará Yoon-Kyum Shin, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio.

Después de anestesiar al menos cinco crías de ratón P-siete, coloque una cría bajo un microscopio de disección con el abdomen hacia arriba. A continuación, limpie el cuello con alcohol. Para comenzar la cirugía, use tijeras para hacer una incisión de 0,7 milímetros en el cuello.

A continuación, retire cuidadosamente el tejido adiposo con pinzas hasta exponer la arteria carótida derecha unilateral. Luego, utilizando un hilo de sutura 5-0, ligue la arteria carótida derecha unilateral. Ahora, suture la incisión en el cuello con nylon 5-0 y esterilice la incisión.

Luego, permita que la cría se recupere en una cámara hipóxica de 37 grados Celsius con la tapa abierta durante aproximadamente una hora. Coloque otro ratón sometido a manipulación quirúrgica en la cámara hipóxica para que se recupere. Una vez que todas las crías estén completamente despiertas, cierre la tapa de la cámara y reduzca los niveles de gas para establecer condiciones hipóxicas.

Después de 90 minutos de hipoxia, devuelva las crías con lesión cerebral a sus jaulas. Una semana después, prepare las crías para la cirugía, como antes, para buscar evidencia de la lesión. Haga una incisión en el cuero cabelludo para identificar la lesión cerebral en la zona posterolateral del hemisferio derecho.

Observe a través del cráneo semitransparente en busca de evidencia de una lesión cortical y una lesión hipocampal. De este modo, clasifique las crías como lesionadas o controles no lesionados. Después de verificar, cierre el cuero cabelludo con sutura y esterilice la incisión.

Cuando los ratones tengan seis semanas de edad, evalúe su memoria en función del aprendizaje y la evitación de un estímulo adverso. Utilice un aparato comercial de evitación pasiva de dos compartimentos con paso escalonado para esta tarea. Para comenzar, coloque un ratón en el compartimento iluminado de la caja durante 30 segundos.

Luego, abra la puerta entre los compartimentos y registre la latencia del animal para entrar en el compartimento oscuro. Permita hasta 300 segundos para realizar la tarea. Cuando las cuatro extremidades del ratón estén completamente dentro del compartimento oscuro, cierre la puerta.

Luego, administre una descarga eléctrica de 1/2 miliamperio en las patas durante dos segundos y regrese al ratón a su jaula. Veinticuatro horas después, repita la prueba. Esta vez, permita que el ratón tarde un máximo de 300 segundos en trasladarse a la cámara oscura y no administre descarga eléctrica al ratón.

Realice la prueba de caminata en escalera en ratones de seis semanas de edad para discriminar entre alteraciones sutiles de la función motora, utilizando análisis tanto cualitativos como cuantitativos. Primero, prepare el aparato de escalera y luego coloque una cámara de video para grabar los movimientos de las extremidades de un ratón en el aparato. A continuación, coloque un ratón sobre el panel de inicio y comience a grabar con la cámara de video.

Asegúrese de que el video muestre las patas con un enfoque adecuado. Cuando el ratón toque el último panel del aparato de escalera, detenga la grabación. Luego, regrese el ratón al panel de inicio y grabe nuevamente mientras cruza el aparato.

Realice esto un total de cuatro veces por ratón en cada fecha de prueba. Posteriormente, al analizar el video, cuente manualmente el número de deslizamientos realizados por cada extremidad mientras reproduce el video a una velocidad de 1/10. Cuando una extremidad se desliza entre los barrotes, esto constituye un deslizamiento.

Cuando los ratones tengan seis semanas de edad, evalúe su fuerza de agarre. Utilice un medidor de tensión de empuje/tracción, equipado con un alambre triangular de dos milímetros de diámetro, todo fijado a un panel. Coloque al ratón sobre el panel, sosteniéndolo por la cola.

Luego, permita que el ratón alcance apenas el alambre metálico con sus extremidades anteriores. En cuanto los ratones agarren el alambre, tire suavemente de su cola hasta que suelten el agarre. El aparato registrará la fuerza máxima sobre el alambre en gramos.

Repita esta prueba cinco veces antes de darle al ratón un descanso. Durante la prueba de fuerza de agarre, se observan movimientos notorios de desempeños precisos. Intente identificar esos movimientos a lo largo de cinco intentos antes de descansar al ratón, durante al menos un minuto para reducir su fatiga muscular.

Después de que el ratón descanse al menos un minuto, repita la serie de cinco ensayos nuevamente. Luego, dé al ratón otro descanso y realice la serie por última vez en ese día de prueba. A partir de los datos, utilice el promedio de los tres puntajes más altos para cualquiera de las patas delanteras o para ambas patas delanteras para el análisis.

Después de extraer los cerebros de animales de 14 semanas de edad con lesión por hipoxia-isquemia, los cerebros se evaluaron morfológicamente según presentaran sin lesión cortical, una lesión leve o una lesión grave. Los mismos animales fueron escaneados mediante resonancia magnética una semana antes, lo cual también resultó muy revelador. Incluso el cerebro morfológicamente normal mostró una lesión leve en el hipocampo.

A las seis semanas de edad, cinco semanas después de la lesión, los ratones fueron evaluados mediante diversas tareas conductuales. Los ratones con lesión por hipoxia-isquemia presentaron deterioro cognitivo en la tarea de evitación pasiva a las 24 horas. Dado que solo el hemisferio derecho resultó dañado, los ratones mostraron funciones motoras hemiplégicas.

Esto se reveló mediante la diferencia en el porcentaje de resbalones en los travesaños transversales de la escalera para cada miembro anterior. Además, dado que la fuerza de prensión involucra la corteza motora del cerebro, los grupos de control normal y con lesión cortical mostraron diferencias en la potencia de prensión. No se observó ninguna diferencia entre los controles normales y los ratones clasificados como no lesionados, pero los ratones lesionados presentaron una clara alteración.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ligar la arteria carótida derecha unilateral para generar ratones neonatos con isquemia-hipoxia y cómo realizar análisis conductuales de seguimiento. Es importante tener en cuenta que, incluso cuando no se observa daño visible en el cerebro cortical siete días después de la lesión, una resonancia magnética puede revelar una lesión en el hipocampo. Además, es fundamental recordar tratar a las crías con suavidad y completar la cirugía lo más rápidamente posible.

Los cachorros tienen la piel muy débil y delgada, así que tenga mucho cuidado.