Microfluidic Imaging Cytometría de flujo por Asimétrica de detección de tiempo de estiramiento Microscopía óptica (ATOM)
28 de junio de 2017
Este protocolo describe la implementación de un sistema de microscopía óptica de estiramiento-tiempo de detección asimétrica para la obtención de imágenes de una sola célula en el flujo microfluídico ultrarrápido y sus aplicaciones en citometría de flujo por imágenes.
El objetivo general de este protocolo es preparar y utilizar un sistema de microscopía óptica de estiramiento de tiempo de detección asimétrica para obtener imágenes de una sola célula de alto contraste sin etiquetas en flujo microfluídico ultrarrápido. La principal ventaja de ATOM es que permite la captura de imágenes ultrarrápida con velocidades de escaneo lineal de hasta decenas de megahercios, al tiempo que mejora el contraste de la imagen en las celdas sin etiquetar. ATOM permite el análisis morfológico complejo de estructuras celulares y subcelulares con ensayos basados en células descentradas a una velocidad de hasta 100.000 células por segundo, lo que no es posible con la citometría de flujo estándar.
para comenzar a configurar el sistema, use un colimador de fibra para acoplar un láser pulsado de banda ancha femto o pico segundo cerca de IR a una fibra óptica dispersiva de modo único conectada a un amplificador óptico. Ilumina una gradación de difracción de transmisión con el láser para producir una lluvia espectral. Oriente la nivelación cerca de la configuración de la hilera para maximizar la eficiencia de difracción.
Configure un conjunto de lentes de relé telescópico en un sistema de imágenes 4f para dirigir la lluvia espectral hacia el plano focal posterior de una lente objetivo debajo de una plataforma de muestra. Asegúrese de que la lluvia espectral llene la apertura trasera de la lente del objetivo. Coloque otra lente de objetivo con un espejo plano en su apertura trasera por encima de la plataforma de muestra.
Ajuste las lentes del objetivo hasta que sus planos focales se superpongan. Compruebe que la lluvia espectral pasa dos veces por el plano de la imagen y sigue el mismo camino de vuelta a la gradación. Coloque un chip microfluídico en la plataforma de muestras y asegúrese de que la lluvia espectral caiga a través del canal microfluídico.
Redirija la luz devuelta con un divisor de haz después de que pase por la clasificación. Separe la luz devuelta en dos haces con otro divisor de haz. Utilice colimadores de fibra para acoplar los haces a fibras monomodo de diferentes longitudes para introducir un retardo de tiempo entre haces.
Conecte las fibras a un osciloscopio en tiempo real a través de un acoplador de fibra y un fotodetector. Ajuste la ganancia del amplificador óptico hasta que la relación señal-ruido de la señal óptica sea superior a 10 decibelios. A continuación, bloquee aproximadamente la mitad de cada viga devuelta con bloques de viga de filo de cuchillo.
Ajuste los bloques de haz hasta que la potencia óptica medida en cada fibra sea aproximadamente la mitad de la potencia antes del bloque. Verifique que el ancho de banda del osciloscopio y la frecuencia de muestreo sean lo suficientemente altos como para no influir en la resolución de la imagen. Para comenzar el experimento, diluya las muestras de células entre 10 y 5 y entre 10 y 6 células por mililitro con solución salina tamponada con fosfato o agua de manantial.
A continuación, cargue la solución celular en una jeringa de 10 mililitros. Conecte la jeringa a la entrada del canal microfluídico. Dirija la salida del canal microfluídico a un tubo de centrífuga.
Asegure la jeringa en una bomba de jeringa y ajuste el caudal adecuadamente para el ancho del canal. Elija el número de puntos de datos que se van a guardar para el experimento. A continuación, adquiera y guarde los datos de la señal óptica.
Digitalice y exporte los datos del osciloscopio a un ordenador. Procese los datos en imágenes 2D y extraiga una biblioteca de parámetros de las imágenes. Importe las imágenes de la biblioteca de parámetros a un programa de visualización.
Asigne un parámetro de interés a cada eje y seleccione el conjunto de datos que se mostrará como un diagrama de dispersión. Compruebe las imágenes de celda asociadas a cada grupo en el gráfico para identificar tendencias. Utilice la compuerta manual o muestre conjuntos de datos adicionales para un análisis más detallado según sea necesario.
ATOM se utilizó para adquirir imágenes unicelulares de alto contraste de células humanas y fitoplancton. Las estructuras celulares características, como vacuolas, pirenoides y flagelos, son visibles en las imágenes de fitoplancton. Parámetros como el tamaño de la celda y la circularidad se determinaron a partir de las imágenes ATOM para clasificar las células para el análisis citométrico.
Los resultados de la clasificación se pueden mostrar como diagramas de dispersión 2D. Aquí se trazó el volumen frente a la circularidad para un MCF7 que se muestra en amarillo y un PBMC que se muestra en rojo. Se observaron dos conglomerados para MCF7.
Al identificar las imágenes de alto contraste correspondientes a puntos de datos individuales, se encontró que el grupo inferior correspondía a fragmentos de células y desechos. Una vez dominado, el sistema de imágenes se puede configurar en dos o tres horas si se realiza correctamente. Los procedimientos de diagnóstico por imágenes se pueden realizar en una hora.
No olvide prestar especial atención a la seguridad ocular mientras trabaja con la fuente láser y la alineación del rayo láser. Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de gafas de seguridad, al realizar estos procedimientos. Al intentar este procedimiento, recuerde monitorear la alineación del haz óptico durante todo el proceso de configuración del sistema de imágenes para garantizar una calidad de imagen óptima.
Si bien esta técnica puede aportar información sobre la detección y cuantificación de células raras o aparentes durante el proceso de la enfermedad, también se puede aplicar a la clasificación de tipos de células, dentro de poblaciones celulares grandes y heterogéneas. Esta técnica es particularmente ventajosa cuando se busca superar la limitación de rendimiento de la citometría de imágenes, al tiempo que se conserva la calidad de la imagen. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implementar ATOM desde la configuración del sistema hasta los procedimientos de imagen.
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Visión general
Este protocolo describe la implementación de un sistema de microscopía óptica de estiramiento de tiempo de detección asimétrica para imágenes de células individuales con alto contraste sin etiquetas en flujo microfluídico ultrarrápido. El sistema ATOM permite la captura de imágenes ultrarrápidas y mejora el contraste de imágenes en células sin etiquetas, permitiendo un análisis morfológico complejo.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microscopía óptica
- Imágenes de células individuales
- Microfluidos
Antecedentes
- ATOM permite imágenes a tasas de escaneo de línea de hasta decenas de megahercios.
- Mejora el contraste de imágenes para células sin etiquetas.
- Permite el análisis de estructuras celulares y subcelulares.
- Soporta ensayos basados en células no centradas a alto rendimiento.
Propósito del estudio
- Preparar y usar un sistema de microscopía óptica de detección asimétrica de estiramiento de tiempo.
- Lograr imágenes sin etiquetas de alto contraste de células individuales.
- Facilitar imágenes en flujo microfluídico ultrarrápido.
Métodos utilizados
- El montaje implica el uso de un colimador de fibra y un láser pulsado de IR cercano.
- Acoplamiento del láser a una fibra óptica dispersiva de modo único.
- Uso de un amplificador óptico para mejorar la señal.
- Iluminación de una rejilla de difracción de transmisión para producir una lluvia espectral.
Principales resultados
- Se logró la imagen de hasta 100,000 células por segundo.
- Se demostró un contraste mejorado para células sin etiquetas.
- Se permitió un análisis morfológico complejo no posible con la citomeitría de flujo estándar.
- Se proporcionó un nuevo enfoque para la imagen de alto rendimiento.
Conclusiones
- ATOM representa un avance significativo en la tecnología de imágenes de células individuales.
- Permite un análisis rápido y detallado de estructuras celulares.
- Este método puede transformar los enfoques en citomeitría de flujo y campos relacionados.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
ATOM addresses the throughput limitation of imaging flow cytometry by enabling high-speed, label-free single-cell imaging at up to 100,000 cells per second while preserving sub-cellular resolution and image contrast. This capability supports high-confidence statistical analysis through multidimensional morphological data, directly enhancing target validation and phenotypic screening in early discovery. By providing label-free biophysical phenotyping, ATOM complements biochemical assays and improves predictive confidence in cellular classification within heterogeneous populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through label-free morphological analysis of cellular and subcellular structures.
- Operational Value: Supports functional target validation by de-risking mechanistic ambiguity via high-throughput biophysical phenotyping.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating quantitative morphological parameters (e.g., size, circularity) for cytometric classification of cell states and functions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering high-contrast, sub-cellular resolution images without labels or stains.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through ultrafast line scan rates and consistent optical signal processing.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by enabling imaging flow cytometry at 100,000 cells/s, overcoming traditional throughput bottlenecks.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by detecting rare or aberrant cells in heterogeneous populations, as demonstrated with human cell lines and micro-algae.
- Preclinical Alignment: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through label-free imaging that complements biomarker-based assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement by linking morphological trends to functional outcomes via scatter plot analysis and manual gating.
Pipeline & Workflow Integration
ATOM integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, providing label-free imaging that supports mechanistic de-risking and predictive analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling complex morphological analysis of cellular structures in microfluidic flow.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through high-speed image capture and quantitative parameter extraction from single-cell images.
- Analytics: Provides measurable outputs such as cell size, circularity, and texture for comparative analysis and classification in scatter plots.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling label-free imaging of heterogeneous cell populations, supporting biomarker-independent phenotypic screening.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for high-throughput imaging across model systems, reducing dependency on staining protocols and accelerating assay development cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free morphological de-risking and reduction of ambiguity in cellular classification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via ultrafast imaging and consistent signal-to-noise ratio control (>10 dB).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of rare or aberrant cells.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative morphological data from high-throughput imaging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical microscopy, ultrafast laser systems, and microfluidic flow control.
- Needs broadband femtosecond/picosecond near-IR pulsed laser, optical amplifier, diffraction grating, and high-bandwidth oscilloscope.
- Demands cross-team standardization for beam alignment, knife-edge blocking, and fiber length calibration to maintain image contrast and timing.
- Involves adaptation considerations for varying cell types and microfluidic channel dimensions to ensure optimal spectral shower coverage.
- Includes practical limitations such as laser safety requirements and the need for precise optical path alignment to avoid resolution degradation.
