Inducción de la diferenciación celular y de imágenes monocelulares de Vibrio parahaemolyticus Células Swimmer y Swarmer

El objetivo general de este método es inducir la diferenciación celular de la bacteria Vibrio parahaemolyticus y la formación de una población de células de enjambre diferenciadas fácilmente disponibles para el análisis de células individuales mediante microscopía de fluorescencia. Este método ayudará a los científicos a comprender cómo las bacterias regulan la organización intracelular durante la diferenciación celular y la morfogénesis. Dado que la obtención de imágenes de células dentro de comunidades bacterianas puede ser un desafío, la principal ventaja de esta técnica es que produce una población de células de enjambre diferenciadas que existen en una sola capa celular fácilmente disponible para el análisis de microscopía de una sola célula.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una mejor comprensión de cómo las bacterias regulan los cambios en el ciclo celular, la morfología celular y la organización intracelular durante la diferenciación celular. La demostración de este método es fundamental, ya que la inducción fiable de la diferenciación celular y la formación de células disponibles para el análisis de células individuales son difíciles de lograr. Para preparar la solución de agar para hacer platos de enjambre, suspenda cuatro gramos de infusión de corazón, o polvo de H.I.agar, y 100 mililitros de agua destilada doble.

Hervir con cuidado la solución de agar H.I. en un horno microondas, agitando la botella de vez en cuando hasta que el polvo se disuelva. Esterilizar la solución de agar en autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos, enfriar la solución de agar a 60 t0 65 grados centígrados con agitación constante. El siguiente paso consiste en manipular 2,2'Bipyridyl, que es altamente tóxico, por lo que se deben usar guantes y gafas de seguridad.

Añadir 2,2'Bipyridyl hasta una concentración final de 50 micromolares. Agregue cloruro de calcio hasta una concentración final de cuatro millamolar. Inocular una pequeña cantidad de células de V. parahaemolyticus del borde de una sola colonia en 5 mililitros de caldo LB.

Incubar el cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora agitadora hasta que alcance una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,8. Esto suele tardar entre dos y tres horas. Mientras el cultivo celular crece, pipetee de 30 a 35 mililitros de la solución final de H.I.agar en una placa de Petri redonda de 150 milímetros y deje que el agar se solidifique.

Justo antes de detectar el cultivo celular, seque la placa de agar en posición vertical con la tapa abierta a 37 grados centígrados durante al menos 10 minutos, o hasta que hayan desaparecido los residuos líquidos, pero no más. Localiza un microlitro de cultivo celular en el centro de la placa de enjambre de H.I.agar y deja que la mancha se seque. Selle la placa con cinta de plástico transparente, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas de aire y pliegues en la cinta.

Incubar la placa a 24 grados centígrados durante la noche. Esto dará lugar a la formación de una colonia de enjambre de V. Parahaemolyticus con llamaradas de enjambre que se extienden desde el centro de la colonia, como se muestra en este videoclip de lapso de tiempo. El primer paso en este procedimiento es preparar portaobjetos de agarosa para microscopía.

Agregue un gramo de agarosa a 100 mililitros de una solución de caldo al 20% de PBS y 10% de libras. Hierva con cuidado la solución en el microondas para disolver la agarosa y luego déjela enfriar a 65 a 70 grados centígrados mientras mezcla con una barra magnética para agitar. Coloque un portaobjetos de microscopio limpio en una sección perfectamente nivelada de un banco de trabajo.

Fije el portaobjetos al banco cubriendo ambos extremos del portaobjetos con dos capas de cinta adhesiva de laboratorio de uso general. La distancia entre los dos trozos de cinta debe ser de unos tres centímetros. Pipetear unos 250 microlitros de la solución de agarosa previamente preparada sobre la superficie de vidrio no cubierta.

Coloque un segundo portaobjetos de microscopio en la misma orientación que el portaobjetos inferior en la parte superior y presione ligeramente hacia abajo para que la agarosa residual pueda fluir hacia los lados. Deje que la agarosa se solidifique durante uno o dos minutos. Use un bisturí para cortar cualquier residuo de agarosa que esté adherido a los lados del portaobjetos del microscopio.

Cuando la agarosa se haya solidificado, retire lentamente la corredera de vidrio superior de la inferior con un movimiento horizontal. Retire lentamente la cinta de los extremos del portaobjetos del microscopio. El portaobjetos de agarosa debe usarse lo antes posible, ya que comenzará a secarse lentamente.

Inmediatamente antes de la transferencia de las células del enjambre al portaobjetos del microscopio, utilice un bisturí para cortar la cinta de plástico de la placa del enjambre previamente preparada. Durante la escisión del agar enjambre, es importante dirigir el corte desde el exterior hacia el interior de la colonia de enjambre para evitar contaminar las llamaradas de enjambre con células que se originan en el centro de la colonia. Use un bisturí nuevo para cortar un trozo de agar de enjambre de tres milímetros por 10 milímetros desde el borde más exterior de una colonia de enjambre, asegurándose de dirigir los cortes desde el exterior del borde de la colonia hasta el interior de la colonia.

Transfiera el trozo de agar enjambre al portaobjetos de agarosa del microscopio con las células orientadas hacia la almohadilla de agarosa para imprimir las células de enjambre en la almohadilla de agarosa. Después de esperar unos 30 segundos, retire el trozo de agar con cuidado de la almohadilla de agarosa. Coloque un cubreobjetos de vidrio en la almohadilla de agarosa donde se imprimieron las células.

Las células ya están listas para la microscopía de fluorescencia. Las imágenes de microscopía estereoscópica de una colonia de enjambre de V. parahaemolyticus con aumento creciente muestran llamaradas de enjambre que se extienden desde la periferia de la colonia de enjambre. Las células de las llamaradas se agrupan solo en monocapas o bicapas, mientras que las células del centro de la colonia de enjambre se apilan en varias capas.

Las imágenes de microscopía DIC revelaron que las llamaradas solo consisten en una población completamente diferenciada de células de enjambre, mientras que las células del centro de la colonia de enjambre son significativamente más cortas y probablemente representan una mezcla de células nadadoras y de enjambre. Como prueba de principio, se realizaron imágenes de DIC y microscopía de fluorescencia en células nadadoras y enjambres de V. Parahaemolyticus de tipo salvaje, que expresan ectópicamente una proteína de quimiotaxis esencial, YFP-CheW. En las células nadadoras, YFP-CheW se localiza de manera unipolar y bipolar, pero en las células de enjambre, YFP-CheW siempre está localizada bipolarmente y también forma grupos colocados aleatoriamente a lo largo de la longitud de la célula.

Los cambios en el patrón de localización de YFP-CheW durante la diferenciación de células de nadador a enjambre, también se mostraron mediante la visualización de la distribución de focos y análisis demográficos de los perfiles de intensidad de fluorescencia. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular microbiana exploraran cómo la bacteria Vibrio parahaemolyticus regula su organización interna durante sus distintos estados diferenciados de células nadadoras y de enjambre. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir la diferenciación celular de la bacteria Vibrio parahaemolyticus y cómo preparar una población de células de enjambre diferenciadas para el análisis de células individuales mediante microscopía de fluorescencia.

No olvide que el Vibrio parahaemolyticus es un patógeno humano y que se deben aplicar los procedimientos y regulaciones adecuados sobre cómo manejar los patógenos BSL 2 en su región.