Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Este protocolo tiene como objetivo guiar la fabricación de haces tridimensionales autoensamblados de somata astrocítico alineados longitudinalmente y procesos dentro de una microcolumna de hidrogel del tamaño de una micra para su uso como modelo neurobiológico in vitro o como terapia neurorregenerativa. Los traumatismos y las enfermedades neurodegenerativas son particularmente perjudiciales para los pacientes debido a la capacidad neurogénica restringida en el entorno inhibitorio que limita la regeneración en el sistema nervioso central. Los haces astrocíticos diseñados abordan las limitaciones de las estrategias de tratamiento actuales al intentar replicar las características neuroanatómicas clave y los mecanismos de desarrollo mediados por la glía para promover la migración celular dirigida y la búsqueda de vías axónicas.

La arquitectura de estos andamios astrocíticos se inspira principalmente en los procesos astrocíticos alineados en los tubos gliales de la corriente migratoria rostral. Comience preparando una solución de agarosa al 3% en peso por volumen y DPBS en un vaso de precipitados estéril. Mantenga el calentamiento y la agitación para evitar que la solución se solidifique prematuramente.

Inserte una aguja de acupuntura en la abertura inferior del dispensador de pera. Coloque un tubo capilar sobre la aguja expuesta y asegure los dos introduciendo parte de él en la sección de goma del cilindro del dispensador de bulbos. Tape el cilindro para completar el ensamblaje.

Transfiera un mililitro de agarosa líquida a la superficie de una placa de Petri vacía. Mientras aprieta la tapa de goma del dispensador de bulbo, inserte un extremo del tubo capilar en la agarosa y libere la presión sobre la tapa para atraer la agarosa hacia el tubo. Coloque el bulbo, el tubo y los conjuntos de agujas en una placa de Petri y deje que la agarosa se solidifique dentro de los tubos capilares durante 5 minutos.

A continuación, extraiga la aguja del tubo capilar, dejando la microcolumna aún alrededor de la aguja. Use las puntas de los préceps para empujar la microcolumna hasta el extremo de la aguja, luego sostenga la aguja sobre una placa de Petri abierta que contenga DPBS y empuje la microcolumna hacia el DPBS. Para fabricar botes de microcolumnas, que faciliten el manejo posterior de estas construcciones, comience por hacer una solución de agarosa del 4% de peso por volumen, y mantenga la solución calentada y agitada.

Use pinzas para mover una microcolumna a una placa de Petri vacía. A continuación, mientras trabaja bajo un estereoscopio, utilice un microbisturí para recortar las microcolumnas a la longitud deseada, con los extremos cortados en un ángulo de 45 grados. Después de recortar tres microcolumnas más, alinee las cuatro columnas en paralelo.

Cargue una pipeta con 50 microlitros de solución de agarosa al 4% y dispense una línea de líquido sobre la matriz de microcolumnas para conectar y agrupar las construcciones en un bote. Deje enfriar durante 1 a 2 minutos para permitir la gelificación del 4% de agarosa. A continuación, utilice unas pinzas finas para recoger el bote de microcolumna por el puente de agarosa de conexión.

Y muévalo a una placa de Petri que contenga DPBS. Transfiera el bote de microcolumna a una cabina de bioseguridad y esterilícelo con exposición a luz ultravioleta durante treinta minutos. Dentro de un gabinete de bioseguridad, prepare una solución de 1 miligramo por mililitro de colágeno tipo 1 de cola de rata en medio de cocultivo.

Y luego colócalo en hielo. Ajuste el pH de la solución de ECM con ácido o base según sea necesario hasta que el pH esté estable en el rango de 7,2 a 7,4. Transfiera el bote de microcolumna a una placa de Petri de 35 o 60 mL con pinzas.

Utilizando el estereoscopio como guía, sitúe la punta de 10 ml de una micropipeta en un extremo de cada microcolumna y succione para vaciar el lumen de DPBS y burbujas de aire. Cargue una micropipeta P10 con la solución de colágeno. Coloque la punta de 10 ml contra un extremo de cada microcolumna y administre suficiente solución para llenar el lumen.

A continuación, pipetee un depósito de ECM en cada extremo de la microcolumna. Una vez que se hayan llenado todas las columnas, pipetee el medio de cocultivo en un anillo alrededor de la placa de Petri para evitar que las columnas se sequen. Incubar la placa que contiene las microcolumnas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante al menos una hora para promover la polimerización del colágeno antes de agregar las células.

A continuación, coloque la punta de una micropipeta P10 en un extremo de una microcolumna y transfiera aproximadamente 5 ml de solución celular al lumen para llenarla. Después de colocar todas las microcolumnas en un bote, incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 1 hora para promover la unión de los astrocitos a la MEC. Después del período de incubación, llene cuidadosamente las placas que contienen las microcolumnas asentadas con 3 o 6 mL de medios de cocultivo, para placas de Petri de 35 o 60 mL respectivamente.

Mantenga las microcolumnas plateadas y el cultivo a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para promover el autoensamblaje de los haces astrocíticos alineados, que deberían formar una estructura agrupada, similar a un cable, después de seis a diez horas. Una hora después de la siembra, los astrocitos tienen forma esférica y se dispersan por toda la construcción. Cinco horas después de la siembra, los astrocitos inician la extensión y contracción del proceso.

A las ocho horas después de la siembra, los astrocitos se han alineado y contraído. A las 24 horas después de la siembra, se ha formado un denso haz de procesos astrocíticos en este ejemplo. Este haz astrocítico completamente formado, 24 horas después de la siembra, muestra el efecto de cremallera, donde los extremos del cable se unen a distintos extremos de la pared del lumen.

Este video muestra el empaquetado en acción, de 3 a 10 horas después del enchapado. El inmunomarcaje de los andamios astrocíticos demuestra el alineamiento longitudinal de los procesos astrocíticos. En esta imagen confocal de un haz astrocítico, se lee el marcador astrocítico GFAP.

Y los núcleos se ven en azul. Este mayor aumento del haz permite la visualización de la citoarquitectura de los astrocitos dentro de las microcolumnas. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de fabricar andamios vivos que consisten en haces astrocíticos alineados longitudinalmente con una citoarquitectura inspirada biológicamente dentro de un revestimiento de biomaterial.

Después de este procedimiento, se puede diseñar una estrategia de trasplante para administrar los haces astrocíticos con o sin el revestimiento de biomaterial al tejido cerebral lesionado para promover la migración celular dirigida desde las regiones neurogénicas y actuar sobre la guía del microambiente limitante del SNC. Además, esta técnica puede ampliarse como plataforma de modelado biofidélico de fenómenos neurobiológicos mediados por glía beneficiados por el mimetismo del entorno tridimensional nativo y el control experimental inherente de los sistemas in vitro.