Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Este protocolo tiene como objetivo guiar la fabricación de agregados tridimensionales autoensamblados, compuestos por somas y prolongaciones astrocíticas alineados longitudinalmente dentro de una microcolumna de hidrogel de tamaño micrométrico, para su uso como modelo neurobiológico in vitro o como terapia neuroregenerativa. El trauma y las enfermedades neurodegenerativas son particularmente perjudiciales para los pacientes debido a la limitada capacidad neurogénica en un entorno inhibitorio que restringe la regeneración en el sistema nervioso central. Los agregados astrocíticos diseñados abordan las limitaciones de las estrategias terapéuticas actuales al intentar replicar características neuroanatómicas clave y mecanismos de desarrollo mediados por la glía, con el fin de promover la migración celular dirigida y el crecimiento axonal guiado.

La arquitectura de estos andamios astrocíticos está inspirada principalmente en los procesos astrocíticos alineados dentro de los tubos gliales del flujo migratorio rostral. Comience preparando una solución de agarosa al 3% peso por volumen y DPBS en un vaso de precipitados estéril. Mantenga el calentamiento y la agitación para evitar que la solución se solidifique prematuramente.

Inserte una aguja de acupuntura en la abertura inferior del dispensador de pera. Coloque un tubo capilar sobre la aguja expuesta y asegure ambos introduciendo parte del tubo en la sección de goma del cilindro del dispensador de pera. Coloque la tapa en el cilindro para completar el ensamblaje.

Transfiera un mililitro de agarosa líquida a la superficie de una placa de Petri vacía. Mientras presiona la tapa de goma del dispensador de pera, inserte un extremo del tubo capilar en la agarosa y libere la presión sobre la tapa para aspirar agarosa dentro del tubo. Coloque los conjuntos de pera, tubo y aguja sobre una placa de Petri y deje que la agarosa se solidifique dentro de los tubos capilares durante 5 minutos.

Luego, retire la aguja del tubo capilar, dejando que la microcolumna permanezca aún rodeando la aguja. Utilice las puntas de la pinza para empujar suavemente la microcolumna hasta el extremo de la aguja, luego sostenga la aguja sobre una placa de Petri abierta que contenga DPBS y empuje la microcolumna dentro del DPBS. Para fabricar botes de microcolumna, que facilitan el manejo posterior de estos constructos, comience preparando una solución de agarosa al 4% peso por volumen, y mantenga la solución calentada y agitada.

Utilice pinzas para mover una microcolumna a una placa de Petri vacía. Luego, trabajando bajo un estereoscopio, use un escalpelo micro para recortar las microcolumnas a la longitud deseada, cortando los extremos en un ángulo de 45 grados. Después de recortar tres microcolumnas más, alinee las cuatro columnas en paralelo.

Cargue una pipeta con 50 microlitros de solución de agarosa al 4 %, y desprenda una línea de líquido sobre el arreglo de microcolumnas para conectar y agrupar los constructos en una embarcación. Deje enfriar durante 1 a 2 minutos para permitir la gelificación de la agarosa al 4 %. Luego, use pinzas finas para levantar la embarcación de microcolumnas por el puente de agarosa que las conecta.

Y trasládela a una placa de Petri que contenga DPBS. Transfiera el bote de microcolumna a una cabina de seguridad biológica y esterilice mediante exposición a luz ultravioleta durante treinta minutos. Dentro de una cabina de seguridad biológica, prepare una solución de 1 miligramo por mililitro de colágeno tipo 1 de cola de rata en medio de co-cultivo.

Luego colóquelo en hielo. Ajuste el pH de la solución de ECM con ácido o base según sea necesario hasta que el pH sea estable en el rango de 7,2 a 7,4. Transfiera el bote de microcolumna a una placa de Petri de 35 o 60 mL con pinzas.

Utilizando el estereoscopio como guía, coloque la punta de 10 mL de una micropipeta en un extremo de cada microcolumna y aspire para vaciar la luz de PBS-D y las burbujas de aire. Cargue una micropipeta P10 con la solución de colágeno. Coloque la punta de 10 mL en un extremo de cada microcolumna y agregue suficiente solución para llenar la luz.

Luego, pipetee un depósito de matriz celular extracelular (ECM) en cada extremo del microcolumna. Una vez que todas las columnas hayan sido llenadas, agregue medio de cocultivo en forma de anillo alrededor de la placa de Petri para evitar que las columnas se sequen. Incube la placa que contiene las microcolumnas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante al menos una hora para favorecer la polimerización del colágeno antes de añadir las células.

Posteriormente, coloque la punta de una micropipeta P10 en uno de los extremos de una microcolumna y transfiera aproximadamente 5 mL de solución celular al lumen para llenarlo. Después de colocar todas las microcolumnas en una plataforma, incúbelas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 1 hora para favorecer la adhesión de los astrocitos a la MEC. Tras el período de incubación, llene cuidadosamente los recipientes que contienen las microcolumnas colocadas con 3 o 6 mL de medio de cocultivo, para placas de Petri de 35 o 60 mL respectivamente.

Mantenga las microcolumnas sembradas y cultive a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono para promover la autoensamblaje de los haces astrocíticos alineados, que deberían formar una estructura compacta semejante a un cable entre seis y diez horas. Una hora después del siembra, los astrocitos tienen forma esférica y se dispersan a lo largo del constructo. A las cinco horas después del siembra, los astrocitos inician la extensión y contracción de sus prolongaciones.

Ocho horas después de la siembra, los astrocitos se han alineado y contraído. A las 24 horas después de la siembra, en este ejemplo se ha formado un haz denso de prolongaciones astrocitarias. Este haz astrocitario completamente formado, 24 horas después de la siembra, muestra el efecto de cierre, en el que los extremos del cable se adhieren a extremos distintos de la pared del lumen.

Este video muestra la formación de haces en acción, entre 3 y 10 horas después de la siembra. La inmunomarcación de los andamios astrocíticos demuestra el alineamiento longitudinal de los procesos astrocíticos. En esta imagen confocal de un haz astrocítico, se observa el marcador astrocítico GFAP.

Y los núcleos se observan en azul. Esta mayor magnificación del haz permite la visualización de la arquitectura citoplasmática de los astrocitos dentro de las microcolumnas. Después de ver este video, usted debería ser capaz de fabricar andamios vivos compuestos por haces de astrocitos alineados longitudinalmente con una arquitectura citoplasmática inspirada biológicamente dentro de un recubrimiento de biomaterial.

Tras seguir este procedimiento, puede diseñarse una estrategia de trasplante para administrar los haces astrocíticos con o sin el encapsulado de biomaterial a tejido cerebral lesionado, con el fin de promover la migración celular dirigida desde regiones neurogénicas y actuar como guía en el microentorno limitante del SNC. Además, esta técnica puede ampliarse como una plataforma de modelado biofídela para fenómenos neurobiológicos mediados por la glía, beneficiados por la imitación del entorno tridimensional nativo y el control experimental inherente de los sistemas in vitro.