Tuning en la banda Theta Hippocampal In Vitro: Metodologías para la grabación del circuito septohippocampal de roedores aislados

Aquí, presentamos un protocolo para la grabación de la red neuronal rítmica teta y oscilaciones gamma de una preparación de hipocampo aislado todo. Describimos los pasos experimentales desde la extracción del hipocampo hasta los detalles de las grabaciones de parches de campo, unitarios y de células enteras, así como la estimulación optogenética del ritmo teta.

El objetivo general de este protocolo es presentar procedimientos para extraer toda la preparación del hipocampo y explorar la generación de redes neuronales rítmicas utilizando registros de campo, unitarios y de patch-clamp, así como estimulación optogenética. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia del aprendizaje y la memoria, facilitando en gran medida el estudio de los mecanismos celulares y sinápticos que subyacen a las oscilaciones rítmicas en el hipocampo. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza una preparación optimizada para investigar los circuitos en oscilaciones detalladas, que juegan un papel crucial en la información de memoria dependiente del hipocampo.

Para comenzar este procedimiento, coloque el cerebro en la placa de disección en posición vertical, retire el cerebelo con una cuchilla de afeitar, luego corte el cerebro por la mitad a lo largo del plano sagital medio y regrese los dos hemisferios aislados a la cámara de espera. A continuación, coloque el cerebro hemiseccionado en posición vertical sobre la placa de disección. Gire la placa hasta que las estructuras sagitales medias estén orientadas hacia el experimentador y el contorno incrustado del complejo septal sea visible como una fina capa de tejido en forma de pera en el interior del tálamo.

Luego, inserte una espátula recubierta debajo del tabique y mueva la punta hacia abajo hasta llegar a la placa de disección, corte cordialmente las fibras que conectan el área septal. Ahora, repita la misma operación a lo largo del borde anterior del tabique y corte las fibras que se conectan con la parte frontal del cerebro. Con la espátula sosteniendo ligeramente la parte interna de la corteza justo por encima del hipocampo en posición vertical, use la microespátula para tirar cuidadosamente hacia abajo de los núcleos tálamo, hipotalámico y del tronco encefálico restante.

Posteriormente, use la espátula para cortar y quitar el tejido arrancado. Después, inserte la espátula recubierta en el ventrículo lateral debajo del extremo rostral del hipocampo dorsal. Sostenga la espátula horizontalmente, alineada con el plano sagital medio del cerebro hemiseccionado y deslícela por el contorno liso de las paredes ventriculares, hasta que la punta emerja cordialmente.

Sostenga la espátula debajo del hipocampo y presiónela ligeramente sobre las fibras conectadas a lo largo de la capa interna donde el hipocampo se une con la corteza suprayacente, luego, aplique la microespátula en el lado externo de esta capa y presiónela contra la espátula recubierta para cortar las fibras conectadas. Para completar la extracción, gire la placa de disección e inserte la espátula recubierta debajo del hipocampo ventral. Sostenga ligeramente el hipocampo con la espátula y corte las conexiones endocrinas con un movimiento de corte contra la espátula.

Una vez que se complete el aislamiento, mantenga el hipocampo descansando en el plato y agregue una gota de solución de sacarosa helada para mantenerlo fresco. Recorta con cuidado cualquier corteza y fibras restantes y separa el hipocampo del tabique aplicando suavemente una cuchilla de afeitar en el fórnix. Después de eso, transfiera la preparación a una solución de sacarosa a temperatura ambiente y deje que se recupere durante 15 a 30 minutos antes de transferirla a la cámara de registro.

En este paso, configure el sistema de perfusión alimentado por gravedad para permitir una alta velocidad continua en el flujo de ACSF oxigenado. A continuación, detenga el flujo de ACSF y transfiera el hipocampo a la cámara de registro, utilizando el extremo ancho de una pipeta de vidrio. Deje que la preparación saturada de sacarosa se hunda y se asiente en el fondo.

Coloque la preparación en el centro de la cámara de registro, con la superficie lisa de CA1 y el subículo en la parte superior. Estabilice el hipocampo con pequeños pesos de las extremidades septales y temporales y reinicie el flujo de ACSF. En este procedimiento, baje el electrodo LFP a la superficie del hipocampo.

Haga avanzar el electrodo LFP a través de la capa de parámetros y observe el aumento de la actividad de aumento extracelular a medida que se detecta la descarga de una sola unidad de las neuronas individuales. Baje el electrodo aún más y observe que la punta comienza a desvanecerse nuevamente a medida que la punta cruza hacia el radioátomo. Observe que una oscilación de red claramente visible en el rango de frecuencia theta, se hace evidente y alcanza la amplitud máxima a medida que la ubicación de grabación se baja a través del radioatomo.

Para probar las propiedades espaciales de las oscilaciones theta espontáneas a través de la región CA1, coloque un segundo electrodo LFP en un sitio CA1 y observe que las oscilaciones theta CA1 se sincronizan a grandes distancias. Para probar las propiedades de las oscilaciones theta a través de las capas del hipocampo, deje un electrodo LFP de referencia en un sitio de radioatomo CA1. Comenzando justo por encima del estrato oriens, baje un segundo electrodo en la capa de la celda de parámetros y a través del radioatomo.

Observe una inversión gradual de la señal LFP a través de la capa de parámetros. Para probar las oscilaciones gamma y el acoplamiento theta gamma en el hipocampo intacto, coloque un electrodo de campo en el borde del subículo CA1 y bájelo hasta que se asiente en la interfaz entre el parámetro y las capas moleculares. A este nivel, se puede registrar un potencial de campo que muestra oscilaciones gamma claras con cambios en la amplitud que bloquean la fase al ritmo theta local.

Luego, ajuste la escala para observar la escala de tiempo lento del acoplamiento theta gamma. Tenga en cuenta que los estallidos gamma ocurren en dos bandas de frecuencia distintas que pueden ser reveladas por banda durante la señal LFP en curso, en el rango gamma lento y rápido. Para el registro de pinzas de parche de células completas durante oscilaciones theta del hipocampo in vitro, utilice la microscopía de video fluorescencia con aumento de baja y alta potencia para visualizar las interneuronas tdTomato positivas ubicadas cerca de la superficie de una preparación del hipocampo de un ratón macho PV.

Bajo una vista de bajo aumento del hipocampo, coloque un electrodo LFP en el subículo CA1 para monitorear las oscilaciones theta mientras se prepara para los experimentos de pinza de parche. A continuación, cambie a un aumento de 40x y sumerja el objetivo sobre la región objetivo. Bájelo hasta que las capas superiores se hagan visibles, bajo la microscopía de fluorescencia, seleccione la célula de tom PV fluorescente y acérquese con una pipeta de parche llena de solución intercelular estándar.

Una vez en la configuración de la célula completa, examine las propiedades fisiológicas de la célula PV identificada durante las oscilaciones espontáneas del hipocampo. Observe el registro del potencial de membrana intecelular de las células PV que se caracterizan por un comportamiento de pico rápido y ráfagas de potenciales de acción sincronizados con el ritmo theta del subículo CA1 en curso. En este procedimiento, se coloca un electrodo LFP en el área del subículo CA1 y se coloca una célula de parámetro cercana en el hipocampo aislado de un ratón, expresando la opcina excitadora sensible a la luz azul, CHR2 en las interneuronas PV.

Coloque una guía de luz de fibra óptica sobre la preparación del hipocampo y céntrela en la región registrada. Utilice la luz azul de una fuente LED para la estimulación genética óptica, que consiste en pulsos de luz de 10 a 20 milisegundos o comandos de voltaje de onda sinicular entregados a frecuencias theta. En pinza amperimétrica, caracterizar la actividad de la célula registrada durante las oscilaciones theta espontáneas.

A continuación, inicie el protocolo de estimulación y registre las respuestas a la luz. Observe que las oscilaciones de campo y la actividad sináptica y la neurona registrada se sincronizan cada vez más durante la estimulación optogenética y que el ritmo rítmico de las células PV da como resultado un control robusto tanto de la frecuencia como de la potencia de las oscilaciones theta. Aquí se muestra la actividad electrofisiológica registrada desde una celda de parámetros durante las oscilaciones theta.

Las trazas de pinza de corriente muestran un disparo espontáneo pero no rítmico en reposo y potenciales postsinápticos inhibidores que no estaban claramente sincronizados con la oscilación LFP que emergía lentamente. Los registros de pinza de voltaje muestran que las corrientes postsinápticas inhibitorias correspondientes tienen el potencial de inversión en alrededor de menos 70 milivoltios. Y aquí, está la actividad electrofisiológica registrada de una interneurona PV fluorescente de pico rápido durante las oscilaciones theta.

En la pinza de corriente, esta célula se disparaba espontáneamente en reposo y era fuertemente impulsada por potenciales postsinápticos excitatorios rítmicos que se bloqueaban en fase con la oscilación LFP estable. En los registros de pinza de voltaje, el potencial de inversión de corriente postsináptica excitatoria fue de aproximadamente cero milivoltios. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres horas, mientras se intenta este procedimiento, es importante recordar oxigenar una solución vigorosamente y usar un sistema de perfusión que permita un flujo constante pero de alta velocidad de ACSF armado sobre la preparación durante los registros electrofisiológicos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la estimulación optogenética o el silenciamiento de poblaciones de tipos celulares específicos, con el fin de responder a preguntas adicionales, como la identificación de los subtipos celulares que forman osciladores theta en el hipocampo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran sistemáticamente la dinámica de las oscilaciones theta a través del eje temporal septal del hipocampo in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer una preparación completa del hipocampo para explorar la función de las redes neuronales rítmicas utilizando registros de campo, unidades y pinzas de parche, así como la estimulación optogenética.