Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles

El objetivo general de esta metodología es desarrollar un enfoque modular quimioenzimático para la síntesis de N-glicanos mediante la construcción de una nueva micromatriz de glicanos sobre un portaobjetos de vidrio recubierto con óxido de aluminio, para detectar la unión de heteroglicanos a anticuerpos contra el VIH. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en glicobiología para la identificación de glicanos específicos de virus celulares en muchos desarrollos. La ventaja principal de este método es la capacidad de detectar uniones débiles e identificar una mezcla de azúcares que se unen a una proteína, como por ejemplo un anticuerpo procedente de un paciente con VIH.

Las implicaciones de esta técnica se extienden al diagnóstico de infecciones por influenza, porque los catabolistas de ácido siálico se expresan en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas y los tejidos son comunes mientras persisten los síntomas. Por lo tanto, la glicomicroarreglo será una herramienta ideal para determinar la especificidad de subtipos salvajes. Aunque este método puede proporcionar información sobre las especificidades de glicanos de los anticuerpos contra el VIH, también puede aplicarse a otros sistemas, como el diagnóstico de diversos tipos de cáncer basado en el patrón de unión de los anticuerpos séricos humanos frente a antígenos séricos específicos humanos impresos en la superficie.

Para comenzar este procedimiento, agregue 2-5 micromoles de glicano previamente preparado y colóquelos en un matraz redondo de cinco mililitros. Agregue una barra de agitación magnética al matraz y tápelo con un septum de goma. Añada 400 microlitros de DMF recién secado y 10-25 micromoles del conector de ácido fosfónico al matraz.

A continuación, agite la mezcla de reacción a 800 rpm durante cinco horas. Una vez completada la reacción, evapore el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a una presión de vacío de cinco a 10 milibares y 40 grados Celsius. A continuación, disuelva la mezcla de reacción seca en 0,5 mililitros de agua y cargue encima de una columna de gel de poliacrilamida.

Eluir los productos utilizando agua y recolectar fracciones de uno a dos mililitros. Para comprobar las fracciones recolectadas mediante CCF, aplicar una muestra de cada fracción en una placa de CCF y sumergir la placa en molibdato de cerio y amonio 0,25 molares. Calentar la placa teñida con una placa calefactora para visualizar el producto.

Después de combinar las fracciones que contienen el producto y congelar la solución, se liofiliza para obtener el producto deseado como un polvo blanco. A continuación, disuelva el producto seco en dos mililitros de agua y agregue hidróxido de paladio. Coloque un globo que contenga hidrógeno en el matraz y agite la mezcla de reacción a 800 rpm durante 15 horas bajo atmósfera de hidrógeno.

Una vez finalizada la reacción, filtre la mezcla a través de un lecho de Celite y lávelo con dos mililitros de metanol y dos mililitros de agua destilada desionizada. A continuación, evapore el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a una presión de vacío de 300 milibares y 40 grados Celsius. Después de esto, disuelva la mezcla cruda en aproximadamente un mililitro de agua y colóquela en la parte superior de un lecho de gel de poliacrilamida.

Eluir el producto con agua y recoger fracciones de uno a dos mililitros. Después de combinar las fracciones que contienen el producto y congelar la solución, liofilizar para obtener el producto deseado como un polvo blanco. Una vez que el producto esté seco, caracterícelo mediante RMN y espectroscopía de masas utilizando óxido de deuterio como disolvente.

Para la anodización superficial, ajuste un incubador con control de temperatura a cuatro grados Celsius. Luego, transfiera una solución acuosa de ácido oxálico 0,3 molar previamente preparada a un vaso de precipitados de 500 mililitros que contenga una barra magnética de agitación. Coloque una varilla de platino de 10 centímetros de longitud como cátodo en la solución.

Mantenga la agitación del ácido oxálico a 300 rpm durante todo el proceso de anodizado. En el software del registrador de laboratorio, haga clic en el botón de configuración y luego haga clic en la opción de función Voltaje de barrido. Establezca el voltaje inicial y final en 25,8 voltios.

El número de puntos a 100, la conformidad a uno y el retraso de barrido a 1200 milisegundos. Luego, haga clic en aceptar. Sujete una placa de vidrio recubierta con aluminio orientada hacia el cátodo.

Haga clic en el botón de ejecutar prueba y observe la medición de corriente. Después de la anodización de la superficie, lave la portaobjetos con agua doblemente destilada y seque con gas nitrógeno. Almacene la portaobjetos en una cámara con 30% de humedad relativa hasta su uso posterior.

Para la fabricación, prepare soluciones de 100 microlitros de todos los glicanos monovalentes en etilenglicol a una concentración de 10 milimolar. Diluya las soluciones de glicanos con tampón de impresión para obtener soluciones de 100 micromolar. Para el estudio heteroligando, agregue cinco microlitros del glicano MAN-5 a cinco microlitros de cada solución de glicano.

Transfiera los glicanos preparados al microplaca de 384 pocillos para el paso de impresión de microarreglos. Después de insertar una microplaca en la matriz de impresión array tech, imprima microarreglos mediante un pin robótico depositando 0,6 nanolitros de las soluciones de glicanos sobre cada portaobjetos de vidrio recubierto con aluminio. A continuación, prepare 70 microlitros de anticuerpo primario PG-9 y tampón PTSB que contenga 3 % de BSA.

Luego, prepare 120 microlitros de anticuerpo secundario con marca fluorescente de asno anti-inmunoglobulina G humana y tampón PBST que contenga 3 % BSA en la oscuridad. Mezcle PG9 y el anticuerpo secundario con marca fluorescente en una proporción 1:1. A continuación, incube los anticuerpos premezclados durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.

Después de la incubación, coloque un portaobjetos de vidrio recubierto de aluminio en la cámara de incubación para portaobjetos, que está dividida en 16 pocillos. Transfiera 100 microlitros de los anticuerpos previamente mezclados al arreglo de glicanos. Después de incubar a cuatro grados Celsius durante 16 horas, retire con una pipeta los anticuerpos previamente mezclados del arreglo de glicanos y luego retire la cámara de incubación para portaobjetos.

Lave la lámina de vidrio con tampón PBST y agua desionizada. Luego, seque la lámina de vidrio por centrifugación a 2000 veces la gravedad. A continuación, abra el software de análisis de imágenes de microarreglos.

Inserte el portaobjetos de vidrio seco en el escáner de matrices con las características dispuestas hacia abajo. Haga clic en el menú de configuración. Establezca la resolución de la imagen en cinco micrómetros por píxel.

Y ajuste la longitud de onda a 635 nanómetros con PMT 450 y potencia al 100 %. Haga clic en el botón de escaneo para comenzar la imagen de la muestra. Finalmente, haga clic en el icono de archivo para guardar la imagen escaneada en formato TIF para el análisis de imágenes. En este estudio, se sintetizaron una amplia variedad de N-glucanos utilizando una estrategia quimioenzimática modular.

Para demostrar la eficacia de la estrategia, se sintetizó una estructura isométrica biantenaria mediante métodos químicos y enzimáticos. La galactosilación enzimática del disacárido 1, seguida de la fucosilación del trisacárido 2, produjo el tetrasacárido deseado 3. La peracilación y las modificaciones en el extremo reductor de los bloques de construcción dos y tres dieron lugar a las moléculas deseadas cuatro y cinco.

La trifuncionalización O-glicosilación estereoselectiva del módulo cuatro del trisacárido seis proporcionó el hexasacárido siete. La desprotección y reacción previa al módulo cinco produjeron el dodecasacárido nueve. La desprotección global proporcionó el glicano 10, que fue caracterizado mediante NMR y espectrometría de masas.

Los glicanos que contienen una cola de pentilamina en el extremo reductor se modificaron con enlazadores de ácido fosfónico y se unieron a la superficie recubierta de vidrio con aluminio mediante química fosfinida. Se analizó el anticuerpo neutralizante amplio contra el VIH-1, PG9, para determinar su especificidad por glicanos utilizando matrices homoglicanas y heteroglicanas, demostrando por primera vez su interacción con heteroglicanos adyacentes en el bucle V1/V2 de la superficie PG120 del VIH-1. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 24 horas, desde la inmovilización de los glicanos hasta el análisis beta, si se realiza adecuadamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar el uso de portaobjetos de vidrio recubiertos con aluminio anodizado fresco para Glycan 10. Para llevar a cabo este procedimiento se utilizan los portaobjetos de los técnicos médicos. Se puede realizar la determinación de la constante corporal con el fin de cuantificar las interacciones de unión entre el carbohidrato y la proteína de interés.

Después del desarrollo de esta técnica, se allanó el camino para que los investigadores comprendieran mejor el papel de los carbohidratos en las enfermedades infecciosas en Kenia y ayudaran a desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades. No olvide que trabajar con agentes tóxicos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de ropa, gafas y mascarillas, al realizar experimentos.