Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles
5 de febrero de 2018
Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.
El objetivo general de esta metodología es desarrollar un enfoque quimioenzimático modular para la síntesis de N-glicanos mediante la construcción de un nuevo microarray de glicanos en un portaobjetos de vidrio recubierto de óxido de aluminio para detectar la unión de heteroglicanos de anticuerpos contra el VIH. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en glicobiología para la identificación de glicanos específicos de virus celulares para gran parte del desarrollo. La principal ventaja de este método es detectar la unión débil e identificar una mezcla de azúcares que se unen a una proteína, como el anticuerpo de un paciente con VIH.
Las implicaciones de esta técnica se extienden al diagnóstico de infecciones por influenza porque las células epiteliales y los problemas de catabol siálico se expresan en las vías respiratorias humanas y los problemas son comunes mientras que los síntomas. Por lo tanto, el glicoarray será una herramienta ideal para determinar la especificidad de los subtipos silvestres. Aunque este método puede proporcionar información sobre las especificidades de los glicanos de los anticuerpos contra el VIH, también se puede aplicar a otros sistemas, como el diagnóstico de varios cánceres basado en el patrón de unión de los anticuerpos séricos humanos hacia los antígenos séricos específicos humanos impresos en la superficie.
Para comenzar este procedimiento, agregue 2-5 micromoles de glicano previamente preparado y un matraz de fondo redondo de cinco mililitros. Agregue una barra agitadora magnética al matraz y cúbralo con un tabique de goma. Añada al matraz 400 microlitros de DMF recién secado y 10-25 micromoles del enlazador de ácido fosfónico.
Luego, agite la mezcla de reacción a 800 rpm durante cinco horas. Una vez completada la reacción, evapore el disolvente utilizando un evaporador rotativo a una presión de vacío de cinco a 10 milibares y 40 grados centígrados. A continuación, disuelva la mezcla de reacción seca y 0,5 mililitros de agua y cárguela sobre el lecho de gel de poliacrilamida.
Eluir los productos con agua y recoger fracciones de uno a dos mililitros. Para verificar las fracciones recolectadas por TLC, localice cada fracción en una placa de TLC y sumerja la placa en 0.25 molares de cerio y molibdato de amonio. Calentar la placa manchada con una placa caliente para visualizar el producto.
Después de combinar el producto que contiene fracciones y congelar la solución, biofolie para obtener el producto deseado en forma de polvo blanco. A continuación, disuelva el producto seco en dos mililitros de agua y agregue Hidróxido de Paladio. Coloque un globo que contenga hidrógeno en el matraz y agite la mezcla de reacción a 800 rpm durante 15 horas bajo atmósfera de hidrógeno.
Una vez completada la reacción, filtrar la mezcla a través de un lecho Celite y lavar con dos mililitros de metanol y dos mililitros de agua destilada desionizada. A continuación, evapore el disolvente utilizando un evaporador rotativo a una presión de vacío de 300 milibares y 40 grados centígrados. Después de esto, disuelva la mezcla de basura en aproximadamente un mililitro de agua y cárguela sobre un lecho de gel de poliacrilamida.
Eluir el producto con agua y recoger fracciones de uno a dos mililitros. Después de combinar el producto que contiene fracciones y congelar la solución, biofolie para obtener el producto deseado en forma de polvo blanco. Una vez seco el producto, caracterizarlo por enimar y espectroscopía de masas utilizando óxido de deuterio como disolvente.
Para la anodización de superficies, ajuste una incubadora con control de temperatura a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera una solución acuosa de ácido oxálico de 0,3 molares previamente preparada a un vaso de precipitados de 500 mililitros que contenga una barra agitadora magnética. Coloque una varilla de platino de 10 centímetros de largo como cátodo en la solución.
Siga agitando el ácido oxálico a 300 rpm durante todo el proceso de anodización. En el software de rastreo de laboratorio, haga clic en el botón de configuración y luego haga clic en la elección de función Voltaje de barrido. Ajuste el voltaje de inicio y parada a 25,8 voltios.
El número de puntos a 100, el cumplimiento a uno y el retraso de barrido a 1200 milisegundos. A continuación, haga clic en Aceptar. Sujete una corredera de vidrio recubierta de aluminio mirando hacia el cátodo.
Haga clic en el botón ejecutar prueba y observe la medición actual. Después de la anodización de la superficie, lave bien el portaobjetos de vidrio con agua destilada doble y purgue con gas nitrógeno. Guarde el portaobjetos de vidrio en una cámara de humedad relativa del 30% hasta su uso posterior.
Para la fabricación, prepare soluciones de 100 microlitros de todos los glicanos monovalentes en etanol glicol a una concentración de 10 milimolares. Diluya las soluciones de glicanos con tampón de impresión para hacer soluciones de 100 micromolares. Para el estudio de heteroligandos, agregue cinco microlitros de glicano MAN-5 a cinco microlitros de cada solución de glicano.
Transfiera los glicanos preparados a la microplaca de 384 pocillos para el paso de impresión de microarrays. Después de insertar una microplaca en la tecnología de matriz de la impresora, imprima micromatrices con un pin robótico depositando 0,6 nanolitros de las soluciones de glicanos en cada portaobjetos de vidrio recubierto de aluminio. A continuación, prepare 70 microlitros de anticuerpo primario PG-9 y tampón PTSB que contenga 3% de BSA.
A continuación, prepare 120 microlitros de anticuerpo de marca fluorescente secundario Burro y anti-inmunoglobulina humana G y tampón PBST que contenga un 3% de BSA en la oscuridad. Mezcle PG9 y el anticuerpo fluorescente secundario en una proporción de 1:1. A continuación, incubar los anticuerpos premezclados durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, cargue un portaobjetos de vidrio recubierto de aluminio en la cámara de incubación de portaobjetos, que está dividida en 16 pocillos. Transfiera 100 microlitros de los anticuerpos premezclados a la matriz de glicanos. Después de incubar a cuatro grados centígrados durante 16 horas, retire los anticuerpos premezclados de la matriz de glicanos con una pipeta y luego retire la cámara de incubación de portaobjetos.
Lave el portaobjetos de vidrio en tampón PBST y agua desionizada. A continuación, seque el portaobjetos de vidrio a 2000 veces la gravedad. A continuación, abra el software de análisis de imágenes de microarrays.
Inserte el portaobjetos de vidrio seco en el escáner de matriz con las características de la matriz hacia abajo. Haga clic en el menú de configuración. Establezca la resolución de la imagen en cinco micrómetros por píxel.
Y configure la longitud de onda en 635 nanómetros con PMT 450 y la potencia al 100%Haga clic en el botón de escaneo para comenzar a obtener imágenes de la diapositiva. Finalmente, haga clic en el icono de archivo para guardar la imagen escaneada en formato TIF para el análisis de imágenes. En este estudio, se sintetizó una amplia gama de N-glicanos utilizando una estrategia quimioenzimática modular.
Para demostrar la efectividad de la estrategia, se sintetizó una estructura isométrica biantennaria por métodos quimioenzimáticos. La galactosilación enzimática del disacárido 1 seguida de la fucosilación del trisacárido 2 proporcionó el deseado tetrasacárido 3. La por sacilatación y las modificaciones finales reductoras de los bloques de construcción dos y tres, permitidas para desear las moléculas cuatro y cinco.
La O-glicosalalinización estereoselectiva tres del módulo cuatro del trisacárido seis proporcionó el hexasacárido siete. La desprotección y la reacción antes del módulo cinco produjeron dedecasacárido nueve. La detección global proporcionó el glicano 10, que se caracterizó por espectroscopía de masas y enimar.
Los glicanos que contenían una cola de pentilamina en el extremo reductor se modificaron con enlazadores de ácido fosfónico y se unieron a la superficie recubierta de vidrio de aluminio mediante química de fosfinida. El anticuerpo ampliamente neutralizante PG9 contra el VIH-1 se examinó para determinar su especificidad de glicanos utilizando matrices de homo y heteroglicanos para demostrar por primera vez su ineteracción con heteroglicanos adyacentes en el bucle V1/V2 de la superficie de VIH1 PG120. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 24 horas desde la inmovilización de glicanos hasta el análisis beta si se realizó correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar un portaobjetos de vidrio recubierto de aluminio recién anodizado para Glycan 10. Para la colocación de este procedimiento se encuentran los portaobjetos de los técnicos médicos. La determinación de la constante corporal se puede realizar con el fin de cuantificar las interacciones de unión entre el carbohidrato y la proteína de interés.
Tras el desarrollo de esta técnica, allanó el camino para que los investigadores comprendieran mejor el papel de los carbohidratos en las enfermedades infecciosas en Kenia y ayudaran a desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades. No olvide que trabajar con agentes tóxicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de ropa, anteojos y máscaras al realizar experimentos.
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Visión general
Este estudio presenta un enfoque químico-enzimático modular para sintetizar N-glicanos en diapositivas de vidrio recubiertas con óxido de aluminio, facilitando aplicaciones de micromatrices de glicanos. La metodología se demuestra a través del perfil de un anticuerpo ampliamente neutralizante del VIH, mostrando su potencial en glicobiología.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Glicobiología
- Inmunología
- Tecnología de micromatrices
Antecedentes
- Los N-glicanos juegan un papel crucial en las interacciones célula-virus.
- Comprender los patrones de unión de glicanos puede ayudar a diagnosticar infecciones virales.
- Los métodos actuales pueden no detectar eficazmente interacciones de unión débiles.
- Las micromatrices de glicanos pueden proporcionar información sobre la especificidad de los anticuerpos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un nuevo método para sintetizar N-glicanos.
- Crear una micromatriz de glicanos para detectar interacciones de anticuerpos del VIH.
- Explorar las implicaciones para el diagnóstico de otras infecciones virales y cánceres.
Métodos utilizados
- Síntesis químico-enzimática de N-glicanos.
- Construcción de micromatrices de glicanos en diapositivas ACG.
- Perfil de anticuerpos ampliamente neutralizantes del VIH.
- Análisis de patrones de unión de glicanos.
Principales resultados
- Síntesis exitosa de N-glicanos para aplicaciones en micromatrices.
- Detección demostrada de interacciones de unión débiles.
- Identificación de patrones específicos de glicanos asociados con anticuerpos del VIH.
- Aplicaciones potenciales para diagnosticar influenza y cánceres.
Conclusiones
- El enfoque modular mejora la síntesis de N-glicanos.
- Esta técnica puede mejorar la comprensión de la especificidad de los glicanos.
- Tiene promesa para aplicaciones más amplias en diagnósticos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This chemo-enzymatic N-glycan synthesis method enables rapid generation of diverse glycan libraries for microarray-based antibody profiling, addressing a critical gap in detecting weak and heterogeneous glycan-protein interactions relevant to HIV vaccine design. By facilitating the analysis of hetero-ligand binding behaviors of broadly neutralizing antibodies like PG9, the approach supports mechanistic de-risking in early immunogen discovery and improves predictive confidence in antigen selection. The modular strategy provides a scalable, reusable platform for epitope mapping and target validation across infectious disease and oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping glycan-specific antibody interactions that inform target relevance and mechanism of action.
- Operational Value: Supports biological de-risking through systematic profiling of hetero-ligand binding patterns on defined glycan arrays.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying glycan motifs associated with potent neutralizing activity, guiding immunogen design decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces covalently attached, structurally diverse N-glycans on aluminum oxide-coated glass slides, creating standardized microarrays for reliable compound and antibody screening.
- Quantitative Output: Enables detection of weak binding interactions through fluorescent readouts, providing measurable affinity and specificity data for hit validation.
- Platform Reuse: The modular synthesis strategy allows rapid regeneration of glycan libraries, supporting iterative screening campaigns and cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly supports translational biomarker discovery by linking specific glycan structures (e.g., Man5GlcNAc2 and di-sialylated bi-antennary N-glycans) to HIV antibody binding phenotypes.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a defined glycan system to assess antibody efficacy and specificity prior to in vivo testing.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing off-target or weak-binding glycan interactions that may indicate reduced therapeutic potential or safety concerns.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from early target validation through lead identification, enabling glycan-dependent antibody characterization that informs downstream preclinical development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by defining glycan epitopes recognized by HIV broadly neutralizing antibodies, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Screening: Delivers assay-ready glycan microarrays with high reproducibility and quantitative readouts, enabling reliable evaluation of antibody-glycan interactions across large libraries.
- Analytics: Generates binding signal data (e.g., fluorescence intensity) that allows comparative analysis of homo- and hetero-glycan binding, facilitating structure-activity relationship mapping.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying glycan-specific antibody profiles that can be correlated with functional neutralization and used to guide immunogen optimization.
- Enterprise Reuse: The chemo-enzymatic modular approach is adaptable across targets, allowing reuse of the synthesis and array fabrication workflow for multiple antibody discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycan-dependent antibody recognition.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through covalent glycan attachment and controlled array fabrication on ACG slides.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid glycan library generation and reducing reliance on external synthesis or fragmented screening efforts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycan-binding phenotypes linked to potent neutralization, informing advancement decisions in vaccine and therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate chemistry, enzymatic synthesis, and microarray handling to ensure proper glycan modification and array quality.
- Depends on instrumentation for rotary evaporation, polyacrylamide gel electrophoresis, and array scanning with specific wavelength and PMT settings.
- Necessitates cross-team standardization of glycan solution preparation, printing concentrations, and antibody incubation protocols to maintain inter-assay consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different glycan targets or antibody classes, particularly in linker chemistry and surface immobilization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for freshly anodized slides and careful handling of toxic reagents during phosphonate linker coupling and hydrogenation steps.
