Name: Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprende síntesis quimioenzimática de N-glicanos para perfiles de anticuerpos del VIH usando matrices de glicanos. Este método modular detecta uniones débiles y mejora diagnósticos virales.

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Los autores agradecen a la división de tecnología de película delgada, centro de investigación de tecnología de instrumento (ITRC) y nacional laboratorios de investigación aplicada, parque científico de Hsinchu, Taiwán. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de ciencia (no de la concesión. La mayoría 105-0210-01-13-01) y Academia Sinica.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una clase de bNAb de VIH-1 incluyendo PG9, PG16 y PGTs 128, 141-145 reportaron ser muy potente en la neutralización de 70-80% de los aislados de VIH-1 que circulan. Los epitopos de los bNAb están muy conservados entre las variantes de todo el grupo de VIH-1 M, por lo tanto puede orientar el diseño del inmunógeno eficaz para una vacuna contra el VIH generar anticuerpos neutralizantes23,24,25 . Como parte de nuestros continuos esf...

N- glicanos de las glicoproteínas son covalente a la asparragina (Asn) residuos de la sequon de Asn-Xxx-Ser/Thr de consenso, que afectan varios procesos biológicos tales como el reconocimiento de lectinas, conformación, antigenicidad y solubilidad de proteína 1 , 2. la síntesis química de N-oligosacáridos vinculados representa un desafío sintético importante debido a su enorme heterogeneidad micro estructural y arquitectura muy ramificado. Cuidadosa selección de la protección de grupos para ajustar la reactividad de bloques de construcción, consecución de selectividad en centros de anomérico y uso adecuado de promotor / activator(s) son elementos clave en la síntesis de los oligosacáridos complejos. Para resolver este problema de la complejidad, una gran cantidad de trabajo para avanzar en síntesis de N- glicanos informó recientemente de3,4. A pesar de estos enfoques robustos, encontrar un método eficaz para la preparación de una amplia gama de los N- glicanos (~ 20.000) sigue siendo un gran desafío.
La tasa de mutación rápida del VIH-1 para alcanzar la amplia diversidad genética y su capacidad de neutralizar la respuesta de anticuerpos, es uno de los mayores desafíos para el desarrollo de una vacuna segura y profiláctica contra el VIH-15,6 , 7. una táctica eficaz que VIH utiliza para evitar la respuesta inmune del huésped es la glicosilación poste-de translación de la glicoproteína gp120 con diversos N-ligado glycans derivados desde el host glicosilación maquinaria8, 9. Un reciente informe sobre el análisis preciso de recombinante monomérica HIV-1 gp120 glicosilación de células 293T de riñón embrionario humano (HEK) sugiere la ocurrencia de microheterogeneity estructural con un patrón característico de la célula-específica10 , 11 , 12. por lo tanto, comprensión requiere de las particularidades de glicanos de bNAb de HIV-1 gp120 bien caracterizado relacionadas con N- glycan estructuras en una cantidad suficiente para el análisis.
El descubrimiento de la tecnología de microarrays de glicanos proporciona alto rendimiento-exploración de las especificidades de una amplia gama de proteínas de unión a carbohidratos, bacteriana virus adhesinas, toxinas, anticuerpos y lectines13,14 . El arreglo de glycans sistemática en un formato basado en chip vestido podría determinar interacciones proteína-glicanos de problemática baja afinidad presentación multivalente15,16,17,18. Este arreglo basado en el chip de glicanos convenientemente parece imitar eficazmente interfaces de la célula. Para enriquecer la tecnología y superar la cuestión irregular asociada con formatos de matriz convencional, nuestro grupo recientemente desarrollado una variedad de glicanos en un portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de aluminio (ACG) con glycans terminó de ácido fosfónico para mejorar la intensidad de la señal, homogeneidad y sensibilidad19,20.
Para mejorar la comprensión actual acerca de glicanos epitopos del recién aislados VIH-1 anticuerpos (bNAb) ampliamente neutralizantes, hemos desarrollado una estrategia modular altamente eficiente para la preparación de un amplio arsenal de N-ligado glycans21 ,22 al imprimir en una ACG slide (ver figura 1). Especificidad estudios perfiles de bNAb de VIH-1 en una matriz ACG ofrecen la detección inusual de comportamiento hetero-glicanos del enlace de bNAb altamente potente PG9 que fue aislado del VIH infectados individuos23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75058</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108247</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio anhidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7487889</td><td></td></tr><tr><td>Teerato de etilo de trifluoruro de boro</td><td>Sigma Aldrich 109637</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048468</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P2 poliacrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>1504118</td><td></td></tr><tr><td>Dicloruro de bis(ciclopentadienil)hafnio (IV)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12116664</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-1, 4 galactosiltransferasas de leche bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48279</td><td></td></tr><tr><td>BioDot Tecnología de cartesion con pin robótico SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)</td><td>Arrayit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerio amonio Molibdato</td><td>TCI</td><td>C1794</td><td></td></tr><tr><td>Cerio nitrato de amonio Cerio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16774213</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio limpio&nbsp;</td><td>Schott&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citidina-5&prime;-monofosfo-N-acetilneuramínico</td><td>ácido Sigma Aldrich</td><td>3063716</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo deuterado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>865496</td><td></td></tr><tr><td>burro Anti-humano IgG (Alexa Fluor647 conjugado</td><td>Jackson Immuno Research, EE. UU.</td><td>709605098</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75092</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoruro de dietilaminoazufre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38078090</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68122</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>141786</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol</td><td>Acros Organic 107211</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FAST Cámaras de incubación de portaobjetos con marco Sigma</td><td>Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanosina 5'- sal disódica difosfo-b-L-fucosa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15839700</td><td></td></tr><tr><td>Lab tracer 2.0 software&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Sección 4 del Protocolo</td></tr><tr><td>Lector GenePix Pro 4300A (análisis de imágenes de microarrays)</td><td>dispositivos moleculares</td><td></td><td>www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software (procesamiento de imágenes)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td>http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/</td></tr> <tr><td>Hidróxido de litio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310652</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7773015</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67561</td><td></td></tr><tr><td>N-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71363</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oxálico</td><td>Acros Orgánico</td><td>144627</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de paladio Sigma</td><td>Aldrich</td><td>12135227</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Solución salina tamponada</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Piridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>110861</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfónico P-Tolueno monohidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>773476</td><td></td></tr><tr><td>Triflato de plata</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> 2923286 <td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich 144558</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich 7647145</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio carbonato de hidrógeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>Metóxido de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>124414</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7757826</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108883</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>N/A</td><td>Grado ultrapuro</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Amresco</td><td>9005645</td><td></td></tr><tr><td>Uridina difosfato galactosa (UDP-galactosa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137868521</td><td></td></tr></tbody></table>

chemo-enzimático síntesis de n- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del vih perfiles

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Presentamos una forma muy eficiente para la preparación rápida de una amplia gama de N-ligado oligosacáridos (estimados para exceder 20.000 estructuras) que se encuentran comúnmente en glicoproteínas humanas. Para lograr la deseada diversidad estructural, la estrategia comenzó con la síntesis enzimática de quimioterapia de tres tipos de módulos de fluoruro de oligosaccharyl, seguidos por su progresivo glycosylations selectivo de α en el 3-O y 6O posiciones de la residuos de manosa de la común trisacárido de base tener un vínculo crucial β-manosida. Más lejos atamos los N- glicanos en la superficie de un portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de aluminio (ACG) para crear un conjunto mixto covalente para el análisis de la interacción ligando-hetero con un anticuerpo de VIH. En particular, el comportamiento del enlace de un recién aislados VIH-1 ampliamente anticuerpo de neutralización (bNAb), PG9, a la mezcla de hombre espaciados5GlcNAc2 (Man5) y el complejo bi-antennary 2, 6-di-sialylated tipo N- glicanos (SCT ) en una matriz ACG, se abre una nueva vía para guiar el diseño del inmunógeno eficaz para el desarrollo de vacuna contra el VIH. Además, nuestra gama ACG incorpora una potente herramienta para estudiar otros anticuerpos anti-VIH para el comportamiento hetero-ligando.

Una estrategia modular de chemo-enzimática para la síntesis de una amplia gama de los N -glicanos se presenta en la figura 1. La estrategia está basado en el hecho de que la diversidad puede crearse en principio por la quimio-enzimático síntesis de los tres módulos importantes, seguido por el mannosylation de α-específicas en el 3-O o 6O posición de los residuos de manosa de la común trisacárido de N- glicanos de la base. T...

Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.

Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

El objetivo general de esta metodología es desarrollar un enfoque modular quimioenzimático para la síntesis de N-glicanos mediante la construcción de una nueva micromatriz de glicanos sobre un portaobjetos de vidrio recubierto con óxido de aluminio, para detectar la unión de heteroglicanos a anticuerpos contra el VIH. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en glicobiología para la identificación de glicanos específicos de virus celulares en muchos desarrollos. La ventaja principal de este método es la capacidad de detectar uniones débiles e identificar una mezcla de azúcares que se unen a una proteína, como por ejemplo un anticuerpo procedente de un paciente con VIH.Las implicaciones de esta técnica se extienden al diagnóstico de infecciones por influenza, porque los catabolistas de ácido siálico se expresan en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas y los tejidos son comunes mientras persisten los síntomas. Por lo tanto, la glicomicroarreglo será una herramienta ideal para determinar la especificidad de subtipos salvajes. Aunque este método puede proporcionar información sobre las especificidades de glicanos de los anticuerpos contra el VIH, también puede aplicarse a otros sistemas, como el diagnóstico de diversos tipos de cáncer basado en el patrón de unión de los anticuerpos séricos humanos frente a antígenos séricos específicos humanos impresos en la superficie.Para comenzar este procedimiento, agregue 2-5 micromoles de glicano previamente preparado y colóquelos en un matraz redondo de cinco mililitros. Agregue una barra de agitación magnética al matraz y tápelo con un septum de goma. Añada 400 microlitros de DMF recién secado y 10-25 micromoles del conector de ácido fosfónico al matraz.A continuación, agite la mezcla de reacción a 800 rpm durante cinco horas. Una vez completada la reacción, evapore el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a una presión de vacío de cinco a 10 milibares y 40 grados Celsius. A continuación, disuelva la mezcla de reacción seca en 0,5 mililitros de agua y cargue encima de una columna de gel de poliacrilamida.Eluir los productos utilizando agua y recolectar fracciones de uno a dos mililitros. Para comprobar las fracciones recolectadas mediante CCF, aplicar una muestra de cada fracción en una placa de CCF y sumergir la placa en molibdato de cerio y amonio 0,25 molares. Calentar la placa teñida con una placa calefactora para visualizar el producto.Después de combinar las fracciones que contienen el producto y congelar la solución, se liofiliza para obtener el producto deseado como un polvo blanco. A continuación, disuelva el producto seco en dos mililitros de agua y agregue hidróxido de paladio. Coloque un globo que contenga hidrógeno en el matraz y agite la mezcla de reacción a 800 rpm durante 15 horas bajo atmósfera de hidrógeno.Una vez finalizada la reacción, filtre la mezcla a través de un lecho de Celite y lávelo con dos mililitros de metanol y dos mililitros de agua destilada desionizada. A continuación, evapore el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a una presión de vacío de 300 milibares y 40 grados Celsius. Después de esto, disuelva la mezcla cruda en aproximadamente un mililitro de agua y colóquela en la parte superior de un lecho de gel de poliacrilamida.Eluir el producto con agua y recoger fracciones de uno a dos mililitros. Después de combinar las fracciones que contienen el producto y congelar la solución, liofilizar para obtener el producto deseado como un polvo blanco. Una vez que el producto esté seco, caracterícelo mediante RMN y espectroscopía de masas utilizando óxido de deuterio como disolvente.Para la anodización superficial, ajuste un incubador con control de temperatura a cuatro grados Celsius. Luego, transfiera una solución acuosa de ácido oxálico 0,3 molar previamente preparada a un vaso de precipitados de 500 mililitros que contenga una barra magnética de agitación. Coloque una varilla de platino de 10 centímetros de longitud como cátodo en la solución.Mantenga la agitación del ácido oxálico a 300 rpm durante todo el proceso de anodizado. En el software del registrador de laboratorio, haga clic en el botón de configuración y luego haga clic en la opción de función Voltaje de barrido. Establezca el voltaje inicial y final en 25,8 voltios.El número de puntos a 100, la conformidad a uno y el retraso de barrido a 1200 milisegundos. Luego, haga clic en aceptar. Sujete una placa de vidrio recubierta con aluminio orientada hacia el cátodo.Haga clic en el botón de ejecutar prueba y observe la medición de corriente. Después de la anodización de la superficie, lave la portaobjetos con agua doblemente destilada y seque con gas nitrógeno. Almacene la portaobjetos en una cámara con 30% de humedad relativa hasta su uso posterior.Para la fabricación, prepare soluciones de 100 microlitros de todos los glicanos monovalentes en etilenglicol a una concentración de 10 milimolar. Diluya las soluciones de glicanos con tampón de impresión para obtener soluciones de 100 micromolar. Para el estudio heteroligando, agregue cinco microlitros del glicano MAN-5 a cinco microlitros de cada solución de glicano.Transfiera los glicanos preparados al microplaca de 384 pocillos para el paso de impresión de microarreglos. Después de insertar una microplaca en la matriz de impresión array tech, imprima microarreglos mediante un pin robótico depositando 0,6 nanolitros de las soluciones de glicanos sobre cada portaobjetos de vidrio recubierto con aluminio. A continuación, prepare 70 microlitros de anticuerpo primario PG-9 y tampón PTSB que contenga 3 % de BSA.Luego, prepare 120 microlitros de anticuerpo secundario con marca fluorescente de asno anti-inmunoglobulina G humana y tampón PBST que contenga 3 % BSA en la oscuridad. Mezcle PG9 y el anticuerpo secundario con marca fluorescente en una proporción 1:1. A continuación, incube los anticuerpos premezclados durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.Después de la incubación, coloque un portaobjetos de vidrio recubierto de aluminio en la cámara de incubación para portaobjetos, que está dividida en 16 pocillos. Transfiera 100 microlitros de los anticuerpos previamente mezclados al arreglo de glicanos. Después de incubar a cuatro grados Celsius durante 16 horas, retire con una pipeta los anticuerpos previamente mezclados del arreglo de glicanos y luego retire la cámara de incubación para portaobjetos.Lave la lámina de vidrio con tampón PBST y agua desionizada. Luego, seque la lámina de vidrio por centrifugación a 2000 veces la gravedad. A continuación, abra el software de análisis de imágenes de microarreglos.Inserte el portaobjetos de vidrio seco en el escáner de matrices con las características dispuestas hacia abajo. Haga clic en el menú de configuración. Establezca la resolución de la imagen en cinco micrómetros por píxel.Y ajuste la longitud de onda a 635 nanómetros con PMT 450 y potencia al 100 %. Haga clic en el botón de escaneo para comenzar la imagen de la muestra. Finalmente, haga clic en el icono de archivo para guardar la imagen escaneada en formato TIF para el análisis de imágenes. En este estudio, se sintetizaron una amplia variedad de N-glucanos utilizando una estrategia quimioenzimática modular.Para demostrar la eficacia de la estrategia, se sintetizó una estructura isométrica biantenaria mediante métodos químicos y enzimáticos. La galactosilación enzimática del disacárido 1, seguida de la fucosilación del trisacárido 2, produjo el tetrasacárido deseado 3. La peracilación y las modificaciones en el extremo reductor de los bloques de construcción dos y tres dieron lugar a las moléculas deseadas cuatro y cinco.La trifuncionalización O-glicosilación estereoselectiva del módulo cuatro del trisacárido seis proporcionó el hexasacárido siete. La desprotección y reacción previa al módulo cinco produjeron el dodecasacárido nueve. La desprotección global proporcionó el glicano 10, que fue caracterizado mediante NMR y espectrometría de masas.Los glicanos que contienen una cola de pentilamina en el extremo reductor se modificaron con enlazadores de ácido fosfónico y se unieron a la superficie recubierta de vidrio con aluminio mediante química fosfinida. Se analizó el anticuerpo neutralizante amplio contra el VIH-1, PG9, para determinar su especificidad por glicanos utilizando matrices homoglicanas y heteroglicanas, demostrando por primera vez su interacción con heteroglicanos adyacentes en el bucle V1/V2 de la superficie PG120 del VIH-1. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 24 horas, desde la inmovilización de los glicanos hasta el análisis beta, si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar el uso de portaobjetos de vidrio recubiertos con aluminio anodizado fresco para Glycan 10. Para llevar a cabo este procedimiento se utilizan los portaobjetos de los técnicos médicos. Se puede realizar la determinación de la constante corporal con el fin de cuantificar las interacciones de unión entre el carbohidrato y la proteína de interés.Después del desarrollo de esta técnica, se allanó el camino para que los investigadores comprendieran mejor el papel de los carbohidratos en las enfermedades infecciosas en Kenia y ayudaran a desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades. No olvide que trabajar con agentes tóxicos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de ropa, gafas y mascarillas, al realizar experimentos.

chemo-enzymatic-synthesis-n-glycans-for-array-development-hiv

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

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