Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales
July 11th, 2017
Este estudio presenta una técnica para el aislamiento de neuronas de ratones neonatales WT. Requiere la cuidadosa disección de la médula espinal del ratón neonatal, seguida de la separación de las neuronas del tejido de la médula espinal mediante escisión mecánica y enzimática.
El objetivo general de este procedimiento es poder aislar repetida y consistentemente las neuronas de la médula espinal que se pueden usar en una variedad de experimentos. Este método puede permitirnos obtener una mejor comprensión de la biología de las neuronas de la médula espinal y, con suerte, comprender su respuesta a una variedad de factores estresantes. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de un número significativo de neuronas, lo que permite que esas neuronas se utilicen en una amplia variedad de experimentos.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que el paso de trituración, en el que las neuronas se aíslan mecánicamente del tejido, requiere algún tiempo para dominarlo, con el fin de garantizar un aislamiento saludable de las neuronas, sin matarlas. Para comenzar este procedimiento, separe la cabeza del cuerpo de las crías de ratón sacrificadas, usando unas tijeras. A continuación, estabilice la cola y los brazos en la mesa de procedimiento con el lado dorsal hacia arriba.
Luego, corta la piel con las tijeras de iris curvo. Después de eso, corte la médula espinal de la región lumbar, justo por encima de las caderas y luego corte ambos lados del tórax para separarlo del cuerpo. Lave las muestras secuencialmente en tres placas de Petri de 10 centímetros, que contienen cinco mililitros de PBS esterilizado durante 10 segundos cada una, para eliminar el exceso de tejido.
Posteriormente, inserte una aguja y una jeringa de calibre 22 llenas de cinco mililitros de PBS esterilizado en el extremo caudal de la columna vertebral y enjuague cranealmente, permitiendo que el cordón salga a una cuarta placa de Petri. Transfiera la médula espinal en un tubo de 15 mililitros con cinco mililitros de HABG en hielo. Evite aplastar la médula espinal y repita los procedimientos para el resto de los cachorros.
Idealmente, este proceso no debería tomar más de 30 minutos para un grupo de cachorros, para garantizar el aislamiento de las neuronas. Para preparar el gradiente de densidad, prepare cada una de las cuatro capas en cuatro tubos de 15 mililitros. Luego, agregue un mililitro de cada capa en un nuevo tubo de 15 mililitros.
Comience con la capa uno en la parte inferior y agregue secuencialmente, hasta llegar a la capa cuatro en la parte superior. Evite alterar las capas mientras agrega y cualquier movimiento vigoroso que pueda causar mezcla. A continuación, agregue el medio de digestión al tejido picado.
Coloque la muestra en una coctelera en el baño de agua a 30 grados centígrados. Después, retira el pañuelo del baño de agua y deja que se asiente durante unos minutos. Para realizar la trituración, aspire el medio de digestión sobrante.
Suspender el tejido en dos mililitros de HABG, utilizando una pipeta de diámetro estrecho, triturar 10 veces en 45 segundos y evitar introducir aire, ya que disminuiría significativamente el rendimiento viable. La trituración es uno de los pasos más críticos del procedimiento, el tejido debe introducirse y vaciarse cuidadosamente de la pipeta pulida al fuego, evitando el exceso de vigor que puede provocar la muerte neuronal o ser demasiado suave, lo que resultaría en un bajo rendimiento. A continuación, aspire los dos mililitros superiores del sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de 15 mililitros etiquetado, colección.
Repita los procedimientos de recolección dos veces más, para obtener seis mililitros de sobrenadante. A continuación, transfiera lentamente el contenido del tubo colector al tubo de gradiente preparado anteriormente. Evitando la interrupción de la pendiente.
Para purificar las neuronas, centrifugar el tubo de gradiente durante 15 minutos a 800 veces G, a 22 grados centígrados. Recoja las capas deseadas y transfiéralas en un nuevo tubo de 15 mililitros. Para obtener el aislamiento de neuronas de mayor pureza, recoja la capa tres.
Para obtener más rendimiento con menos pureza, recoja las capas dos o tres. A continuación, diluya el gradiente de densidad añadiendo cinco mililitros de HABG a las capas recién recolectadas. Centrifugarlo a 200 veces G durante dos minutos a 22 grados centígrados.
Después de dos minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en cinco mililitros de HABG, moviendo el paladar. A continuación, centrifugar la muestra a 200 veces G durante dos minutos a 22 grados centígrados de nuevo. A continuación, desecha el sobrenadante y vuelve a suspender las células en tres mililitros de medio neurobasal, moviendo el paladar.
Después de eso, determine la densidad celular usando un contador de células y luego, diluya la suspensión a 300, 000 células por un mililitro de medio neurobasal. Agite suavemente para distribuir las células y la solución y agregue un mililitro de la muestra a cada pocillo en las placas codificadas de 24 pocillos. Aquí se muestra el curso temporal de las neuronas en cultivo, después de sembrarse en los pozos.
Por lo general, las células comenzarán a adherirse a la superficie dentro de las primeras horas. Los axones comenzarán a brotar dentro de las primeras 24 a 48 horas, las conexiones entre varias neuronas y el cultivo, generalmente alcanzan la madurez a los siete días, momento en el que generalmente se llevan a cabo experimentos en las neuronas. En esta figura, la tinción nuclear se muestra en azul, con la tinción citoplasmática en verde y aquí, se tiñe la proteína neuronal cictosquelética asociada a la proteína microtubular dos de las neuronas, mostrando los contornos y proyecciones axonales de las neuronas después de una semana en cultivo.
Las imágenes de fusión se combinan, mostrando la abundancia relativa de las neuronas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas, si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores, que estudian la fisiología y patología de la médula espinal, exploren el comportamiento de las neuronas de la médula espinal en condiciones normales y en respuesta a agentes farmacológicos o estresores como la privación de oxígeno y glucosa, simplemente imitando nuestros procedimientos quirúrgicos.
Al realizar este procedimiento, es importante evitar retrasar o prolongar cualquiera de los pasos para evitar el aislamiento de neuronas enfermas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neuronas sanas y viables de la médula espinal de ratones neonatos que se pueden cultivar en medios libres de suero.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visión general
Este estudio presenta una técnica para el aislamiento de neuronas de ratones neonatales WT, enfocándose en la disección de la médula espinal y la separación de neuronas mediante métodos mecánicos y enzimáticos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Técnicas de neurobiología
Antecedentes
- El aislamiento de neuronas de la médula espinal es crucial para varias aplicaciones experimentales.
- Entender la biología de las neuronas puede proporcionar información sobre sus respuestas a los factores estresantes.
- El dominio del paso de trituración es esencial para el aislamiento saludable de neuronas.
- Las demostraciones visuales mejoran el aprendizaje de esta técnica compleja.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método confiable para aislar neuronas de la médula espinal.
- Facilitar experimentos que investiguen la biología de las neuronas.
- Mejorar la comprensión de las respuestas neuronales a diferentes factores estresantes.
Métodos utilizados
- Disección de la médula espinal de ratones neonatales.
- Cleavage mecánico y enzimático para separar neuronas.
- Manipulación cuidadosa para garantizar la viabilidad de las neuronas.
- Ayudas visuales para demostrar el proceso de trituración.
Resultados principales
- Se puede aislar un número significativo de neuronas utilizando esta técnica.
- El método permite un aislamiento consistente y repetible de neuronas.
- Se pueden obtener neuronas saludables para varios usos experimentales.
- Las demostraciones visuales ayudan a dominar la técnica.
Conclusiones
- La técnica desarrollada es efectiva para aislar neuronas de la médula espinal.
- Proporciona una base para futuras investigaciones sobre la biología de las neuronas.
- El dominio del método puede conducir a mejores resultados experimentales.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and culture of spinal cord neurons from neonatal mice enables high-fidelity in vitro models for early neurobiology discovery and mechanistic de-risking. This capability supports predictive confidence in target validation and functional screening for neurodegenerative and neuroregenerative research portfolios. Consistent neuron yield and viability underpin scalable assay development and translational continuity across preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal response to pharmacological agents and stressors in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary neuron cultures for pathway analysis.
- Facilitates functional target validation through reproducible neuron isolation and culture.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-yield neuron preparations for quantitative assay development.
- Ensures reproducibility and scalability for compound screening and phenotypic analysis.
- Delivers validated neuronal systems suitable for downstream high-content or functional assays.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of disease-relevant neuronal responses to injury or deprivation in vitro.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo preclinical models for translational biomarker exploration.
- Reduces biological risk by providing continuity from discovery through preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
This neuron isolation protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of neuronal pathways and stress responses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Enables measurement of neuronal viability, maturation, and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights with in vivo preclinical models when aligned with disease context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neurobiology and pharmacology studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible neuron preparations for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in neonatal dissection and trituration for optimal neuron viability.
- Needs access to sterile instrumentation, density gradient materials, and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of isolation and culture steps for reproducibility.
- Adaptation may be necessary for different mouse strains or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to timing and handling, impacting downstream assay reliability.
