Name: Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprende a recuperar virus Zika infeccioso a partir de un clon de ADN bicistrónico. Este método estable permite estudiar flavivirología, desarrollo de vacunas y patogénesis viral en sistemas difíciles de clonar.

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Los autores desean agradecer a Kristen Bullard-Feibelman, a Milena Veselinovic ya Claudia Rückert por su ayuda en la caracterización del virus derivado de clones. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, NIH bajo las concesiones AI114675 (BJG) y AI067380 (GDE).

1. Transformación y recuperación de plásmidos de clones infecciosos <ol><li> Transformar ambos plásmidos (por separado) utilizando un protocolo de transformación comercial ( por ejemplo , NEB 5 Minute Transformation Protocol) con algunas modificaciones. Ambos plásmidos contienen un gen que codifica la resistencia a ampicilina, por lo tanto, usan ampicilina o carbenicilina para la selección. Se prefiere la carbenicilina, ya que es más estable. <ol><li> Retirar las células (ver tabla de materiales) de -80 ° C congelador y descongelar en hielo durante 5-10 min. Caldo de lysogénesis pre-calcinado (LB) (conteniendo 10 g / L de NaCl y 25 μg / mL de carbenicilina, llamado LB-carb) y el caldo con catabolita (SOC (sin antibióticos) - a 37 ° C. </li><li> Añadir entre 100 pg-10 ng en 1 μl de ADN plasmídico a un tubo que contenga 50 μl de células competentes; Mezcle suavemente haciendo chasquear el tubo. </li><li> Incubar los tubos en hielo durante 5 min. </li><li> Tubos de choque térmico a 42 ° C durante 30 sEn un baño de agua. Regrese al hielo por 2 minutos inmediatamente después del choque térmico. </li><li> Pipetee 950 μL de temperatura ambiente en cada tubo y mezcle por pipeteado. Se disemina 100 μL de la mezcla bacteriana sobre una placa de LB-carb e incuba durante la noche a 37 ° C (aproximadamente 12-14 h). </li></ol></li><li> Quitar las placas de 37 ° C incubadora después de 12-14 h de incubación. Colocar las placas en un cajón oscuro a temperatura ambiente para permitir que las colonias continúen creciendo (aproximadamente 8-9 h). </li><li> Utilizando 5 mL de Caldo Terrific (TB, que contiene 25 μg / mL de carbenicilina, llamado TB-carb), crecen 5-10 pequeñas colonias para cada plásmido durante la noche a 30 ° C en un agitador bacteriano (aproximadamente 14-16 h). NOTA: Las colonias pequeñas son un indicador de que el plásmido está intacto; Las colonias con plásmidos que contienen delecciones, reordenamientos o mutaciones (en lo sucesivo denominados eventos de inestabilidad) crecerán más rápidamente y, por tanto, serán más grandes. Por lo tanto, uno debe tratar de recoger las colonias más pequeñas en la placa, específicamente noT seleccionando las colonias más grandes presentes. También se pueden seleccionar algunas colonias de tamaño medio para que sean completas. La temperatura más baja utilizada reduce la probabilidad de que las células crezcan demasiado (DO 600 de más de 0,6-0,8). Como la mayoría de los investigadores realizan crecimiento durante la noche, permite más control y menor probabilidad de crecimiento excesivo. </li><li> Compruebe si hay turbidez en los cultivos líquidos (aproximadamente DO 600 de 0,6-0,8). Coloque los tubos turbios a 4 ° C y permita que otros tubos se vuelvan turbios creciendo por más tiempo. NOTA: No cultivar bacterias a valores de DO 600 mayores de lo recomendado, ya que pueden ocurrir eventos de inestabilidad plasmídica. </li><li> Extraer el ADN del plásmido de las bacterias con un kit comercial de miniprep de plásmido (Ver Tabla de Materiales). Eluir en 15 μL de tampón de elución precalentado (hasta 70 ° C en un bloque de calentamiento). Dejar que el tampón de elución se incube en la columna durante 5 minutos antes de la centrifugación. NOTA: Preserve al menos 1 mL de este cultivo de arranque a 4 ° C paraUso adicional en la siguiente etapa. </li><li> Digerir 10 μL de los plásmidos recuperados para evaluar si los eventos de inestabilidad del plásmido se produjeron durante el cultivo. NOTA: Digerir p1 con SalI / NheI y p2 con BamHI / HindIII a 37 ° C durante 1 h. Confirme la presencia de las bandas correctas después de la digestión ( Figura 2a ) por electroforesis en gel y continúe con el paso 2. Si se prepara ADN de plásmido mediante amplificación en círculo rodante (RCA), reserve parte del eluido de miniprep para servir como molde. </li></ol> 2. Preparación de ADN plasmídico suficiente para la ligadura NOTA: La ligadura y la electroporación subsecuente requieren una cantidad suficiente de ADN plasmídico que debe generarse a través de maxiprep o RCA. Mientras que el maxiprep es el enfoque tradicionalmente utilizado, RCA ofrece la ventaja de no requerir bacterias, eliminando así el potencial de toxicidad inducida por plásmidos en bacterias que pueden dar lugar a eventos de inestabilidad. <ol><li><stRong&gt; Realice el siguiente procedimiento maxiprep. <ol><li> Para cada plásmido que demostró el patrón de digestión de la enzima de restricción correcto en la sección anterior, añadir 500 μl de cultivo de arranque a 1 L de caldo de TB-Carb (25 μg / mL de carbenicilina) y agitar durante la noche a 30 ° C (aproximadamente 14-16 h , Aproximadamente OD $ _ $ de 0,6-0,8). NOTA: No permita que el cultivo crezca sobre este valor de OD 600 . Esto resultará potencialmente en eventos de inestabilidad dentro de los plásmidos. </li><li> Coseche las bacterias y realice maxipreps por el protocolo del fabricante (véase la tabla de materiales). </li></ol></li><li> Utilizando el miniprep guardado desde el paso 1.6, realice lo siguiente para el procedimiento RCA. <ol><li> Transferir 1 μl de ADN plasmídico a un tubo que contenga 50 μl de tampón de muestra. </li><li> Desnaturalizar por calor la muestra a 95 ° C durante 3 min, e incubar después a 4 ° C hasta que esté listo para usar. </li><li> Preparar la amplificación comercialPremezcla (ver tabla de materiales ). Se combinan 50 μl de tampón de reacción con 2 μl de mezcla enzimática en un conjunto de tubos sobre hielo. NOTA: La premezcla de amplificación debe mantenerse en hielo hasta que esté lista para su uso. Es conveniente preparar una mezcla maestra combinando reactivos suficientes para el número requerido de reacciones de amplificación. Cualquier premezcla no utilizada debe desecharse. </li><li> Transferir 50 μl de premezcla de amplificación preparada a la muestra desnaturalizada. </li><li> Incubar los tubos de reacción a 30 ° C durante 18 h. </li><li> Incubar los tubos a 65 ° C durante 10 min para inactivar la DNA polimerasa ø29. </li><li> Guarde los tubos de reacción a 4 ° C o -20 ° C hasta que estén listos para su uso. NOTA: En este punto, se debe cuantificar el ADN plasmídico preparado a través de ambos métodos (utilizando absorbancia a 260 nm) y el genoma ZIKV debe ser secuenciado completamente por Sanger para confirmar que no ocurrieron eventos de inestabilidad (deleciones y reordenamientos) durante la preparación. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Primer Nombre </td><td> Secuencia (5 &#39;- 3&#39;) </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1Para. </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 632Para. </td><td> GCCCTATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 692Rev. </td><td> GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 1313Rev. </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 1201Para. </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV conservado 1663For. </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 2008For. </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 2350Rev. </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV conservado 2605 para. </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 3499Rev. </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 3961Rev. </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 4132Para. </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 4561Rev. </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV conservado 4665For. </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 5189Rev. </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV conservado 5219For. </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 6086Rev. </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 6119Para. </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 6721Rev. </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 6769Para. </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 7209Rev. </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 7343Para. </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV conservado 8243Para. </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev. </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV conservado 9133For. </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev. </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 9686Para. </td><td> GATGATAGGTTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 10321Rev. </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 10455Para. </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 10621Rev. </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> TABLA 1: Cebadores para la secuenciación de clones de cDNA. Los plásmidos pueden secuenciarse completamente con los cebadores enumerados. Primers marcados como &quot;conservados&quot; indiQue son capaces de secuenciar / amplificar todos los genotipos de ZIKV. Primers etiquetados como &quot;PRVABC59&quot; son específicos de esta cepa, pero también puede trabajar para otras cepas de genotipo asiático y, posiblemente, otros genotipos. 3. Preparación del ARN transcrito in vitro <ol><li> Establecer la reacción de digestión de maxiprep o RCA preparado ADN. <ol><li> Para la digestión con p1, mezclar 10 μl de tampón de reacción 10x, 3 μl de ApaLI, 3 μl de BamHI-HF, 3 μl de rSAP o CIP y 3,3 μg de ADN p1. Añadir ddH $ ₂ $ O a 100 μl. </li><li> Para la digestión con p2, mezclar 10 μl de tampón de reacción 10x, 3 μl de ApaLI, 3 μl de EcoRI-HF y 13,3 μg de ADN p2. Añadir ddH $ ₂ $ O a 100 μl. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 1-2 h. </li><li> Purificar usando un gel comercial y un kit de limpieza de PCR (Ver Tabla de Materiales). Eluir en 30 μl de tampón de elución precalentado a 70 ° C en un bloque de calentamiento (incubar elColumna durante 5 min antes de hilar). NOTA: Mantenga 1 μL para que funcione en un gel más tarde. </li></ol></li><li> Preparar la reacción de ligadura. <ol><li> Se combinan 10 μl de tampón de reacción de ligación de ADN T4 10x, 3 μl de ADN ligasa T4 (400 U / μl), 29 μL de p1 purificado y 29 μL de p2 purificado. Añadir ddH $ ₂ $ O a 100 μl. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 2 h o 16 ° C durante la noche. </li><li> Purificar usando un gel comercial y un kit de limpieza de PCR (Ver Tabla de Materiales). Eluir en 10 μl de tampón de elución precalentado a 70 ° C en un bloque de calentamiento (incubar la columna durante 5 minutos antes de centrifugar). NOTA: Mantenga 1 μL para que funcione en un gel más tarde. </li></ol></li><li> Ejecutar plásmidos no digeridos, plásmidos digeridos y ligación en un gel de agarosa. El producto de ligación debe tener una banda de mayor peso molecular (alrededor de 11 kb) que cualquiera de los plásmidos digeridos solo, lo que indica que la ligación fue exitosa ( Figura 2b ).</li><li> Establecer T7 reacción de transcripción in vitro . <ol><li> Combinar 10 μL 2x ARCA / NTP Mix, 2 μL de T7 RNA polimerasa y 8 μL de la reacción de ligación purificada para un volumen final de 20 μL. NOTA: El ARCA incluido en la mezcla es un análogo de tapa que se incorpora exclusivamente en la orientación correcta. Los análogos de tapa estándar pueden dar como resultado que sólo ~ 50% de los transcritos tengan una tapa en la orientación correcta. </li><li> Incubar durante 4 h a 37 ° C. </li><li> Medir la concentración de ARN a través de un espectrofotómetro UV. Opcionalmente, ejecute un gel de agarosa desnaturalizante para confirmar la longitud del transcrito de ARN. </li></ol></li></ol> 4. Rescate del Virus Infeccioso por Electroporación <ol><li> Días antes de la electroporación, se prepara un matraz T182 de células Vero (entre T150 y T182 es aceptable, se desarrolla en DMEM + suero bovino fetal al 10% (FBS)) por constructo que se va a recuperar. Incluir 1 T182 como un control de transfección simulada. CeLls debe utilizarse en un 70-80% de confluencia. </li><li> Cuando las células estén listas, coloque 12 ml / reacción de DMEM + 15% de FBS + 10 mM de HEPES en un baño de agua calentado a 37 ° C. </li><li> Se separan las células por tripsinización con un protocolo estándar y se recuperan las células en medio con FBS al 10% para inactivar tripsina; Centrifugar las células a 150 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), sedimentar las células a 150 xg durante 5 min a 4 ° C. Repita este paso dos veces para un total de tres lavados. </li><li> Resuspender las células en 200 μ l de RPMI 1640 + 10 mM HEPES (estéril) por # de muestras. Transferir 200 μl de suspensión celular a un tubo estéril. Las células deben ser ~ 0,5 x 10 7 células / mL. </li><li> Añadir 20 μl de agua (control negativo simulador) o 20 μL de ARN (preferiblemente 5-10 μg) producido en la etapa 3.4 a cada conjunto de células. Mezclar suavemente golpeando el tubo y transferir el contenido del tubo a una cubeta de electroporación de espacio de 2 mm. </li><li> Establecer una electrOporator a 170 V LV, omega (resistencia) a 0 y 950 μF (aproximadamente 625 V / cm y 20 ms de constante de tiempo para otras máquinas). Ajuste la resistencia al valor más bajo disponible, ya sea 0 o ∞ si está disponible. </li><li> Pulse una vez e inmediatamente añada 600 μL de DMEM + 15% de FBS + 10 mM de HEPES que se calentó en el paso 4.2. Enjuague el interior de la cubeta a fondo para eliminar todas las células. Se añaden células a un matraz de cultivo de tejido T75 que contiene 10 ml de medio precalentado. Retire los medios adicionales de la cubeta usando el cuentagotas que se incluye con la cubeta. Tenga cuidado de mantener la esterilidad. </li><li> Frasco de remolino para mezclar los medios y las células y colocar en incubadora a 37 ° C. </li><li> Compruebe el día siguiente para la viabilidad celular, y hacerlo todos los días hasta 50-75% de muerte celular se observa. La muerte celular se observa comparando con el control electroporado simulado. NOTA: El efecto citopático ZIKV (CPE) es bastante pronunciado en células Vero, dando lugar a células redondeadas que se separan y flotan en el medio de cultivo. TenemosObservó un rango de 8-10 días como ideal para la cosecha. </li><li> Colocar el sobrenadante en un tubo cónico y centrifugar para eliminar los desechos celulares a&gt; 3.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante clarificado a un nuevo tubo y completar con una concentración final de FBS al 20% (a partir de 100% de stock). Adicionalmente, se añade HEPES estéril a una concentración final de 10 mM como agente tamponador para preservar la infectividad del virus mientras se congela (a partir de un stock estéril 1 M). </li><li> Mezcle el virus agitando vórtice y alícuota en viales de tapa roscada. Almacenar a -80 ° C para uso futuro. </li></ol> 5. Titulación del virus recuperado <ol><li> Sembrar el número apropiado de placas de 6 o 12 pocillos de células Vero el día antes de la titulación. </li><li> Eliminar el virus del congelador y hacer diluciones en serie de 10 veces en DMEM + 2% de FBS en tubos o placas de 96 pocillos. NOTA: El título esperado de clones recuperados está entre 1 x 10 6 y 5 x 10 7 PFU / mL. </li><li> Añadir 200 oR 400 μl de cada dilución en duplicado a un pocillo de una placa de 12 ó 6 pocillos, respectivamente. </li><li> Coloque las placas en una incubadora a 37 ° C y roca cada 15 min, durante un período de adsorción total de ~ 1-1,5 h. </li><li> Elimine el inóculo viral y añada 1 mL de recubrimiento de DMEM-Tragacanto de (12 pocillos) o 2 mL (6 pocillos) a cada pocillo. NOTA: Es posible utilizar agarosa, agar, metilcelulosa u otros medios de recubrimiento aquí. </li><li> Incubar las células en un incubador a 37 ° C durante 5 días. El tiempo para la formación adecuada de placa variará dependiendo de la superposición utilizada. </li><li> Para fijar las células, retire las placas de la incubadora y decántela suavemente en desinfectante. </li><li> Añadir suficiente 20% de etanol / 0,1% de violeta de cristal (CV) a cada pocillo para cubrir y remolinar para mezclar. NOTA: Existen muchos otros fijadores y se pueden utilizar aquí. Además, si se utiliza una capa de agarosa o agar, puede utilizarse una segunda capa de recubrimiento junto con un rojo neutro para visualizar las placas sin fijación. El 20% de etanol ha demostrado serEficaces en la inactivación de virus envueltos en estudios previos; No utilice esta cantidad para los virus no envueltos ya que no serán inactivados 19 . </li><li> Incubar las placas durante 30-60 min a temperatura ambiente (en un gabinete de bioseguridad de clase II); Desechar el CV (según las regulaciones locales) y lavar los platos con agua del grifo. </li><li> Permita que las placas se sequen y cuente manualmente las placas. NOTA: La referencia 20 puede usarse como una referencia adicional para realizar ensayos de placa. </li></ol>

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<li>Chang, A. C., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li>
<li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065(2014).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un método para la recuperación de un sistema de clonación de ADNc infeccioso bipartito para ZIKV. Los clones descritos anteriormente para ZIKV sufren de atenuación o requieren la adición de intrones, lo que hace que los plásmidos sean más grandes y evita el rescate en las células de insectos. El virus infeccioso se puede recuperar utilizando el sistema de clones de dos plásmidos en células de mamíferos o insectos (datos no mostrados). Además, el virus recuperado de este sistema se comporta de manera simi...

El virus Zika (ZIKV, Familia Flaviviridae : Género Flavivirus ) es un flavivirus transmitido por mosquitos que llegó a Brasil en 2013-14 y posteriormente se asoció con un brote masivo de enfermedad febril que se extendió a través de las Américas 1 . Además, ZIKV se ha relacionado con graves resultados de la enfermedad, como el síndrome de Guillain-Barré en adultos y microcefalia en fetos y neonatos [ 2] . Poco se sabía acerca de ZIKV antes de su rápida propagación en el hemisferio occidental. Esto incluyó la falta de herramientas moleculares, dificultando así la investigación mecanicista. Las herramientas moleculares para los virus, como los clones de cDNA infecciosos, facilitan el desarrollo terapéutico de las vacunas y antivirales y permiten la evaluación de factores genéticos virales relacionados con la patogénesis viral diferencial, la respuesta inmune y la evolución viral. Se sabe que los clones infecciosos de flavivirus son altamente inestables en bacterias debido a crY promotores prokaryotic yptic presentes en sus genomas 3 . Se han utilizado varios enfoques para mitigar este problema; Incluyendo la inserción de repeticiones en tándem aguas arriba de las secuencias víricas 4 , mutación de las secuencias putativas del promotor procariótico 5 , división del genoma en múltiples plásmidos 6 , vectores de bajo número de copias (incluidos los cromosomas artificiales bacterianos) 7 , 8 e inserción de intrones en el genoma viral 9 . Se ha descrito un sistema de longitud completa sin modificaciones para ZIKV; Sin embargo, este clon parecía estar atenuado en cultivo celular y en ratones 10 . Otros grupos han introducido intrones en el genoma ZIKV, permitiendo la interrupción de secuencias inestables en bacterias que pueden ser empalmadas en células de mamíferos in vitro para la producción de virus infeccioso 11, 12 . Además, se ha utilizado con éxito un sistema basado en PCR denominado Infectious Subgenomic-Amplicons para rescatar la cepa MR766 de ZIKV 13 . El enfoque aquí descrito no requiere secuencias foráneas, sino que altera el genoma en la región de alta inestabilidad mediante el uso de múltiples plásmidos, que se ha utilizado previamente con éxito con la fiebre amarilla 6 , dengue 14 , 15 y virus del Nilo Occidental 16 . Además, la adición de la secuencia de ribozima de hepatitis D en los extremos genómicos víricos facilita la creación de un extremo 3 &#39;auténtico sin la necesidad de la adición de un sitio de linealización. Además, ambos plásmidos se construyen en un vector de número de copias bajas (pACYC177, ~ 15 copias por célula) para mitigar cualquier toxicidad residual 17 . El virus recuperado muestra un perfil de crecimiento comparable alParental en curvas de crecimiento in vitro en 8 líneas celulares que comprenden una variedad de tipos de células derivadas de mamíferos e insectos, y ha exhibido perfiles patógenos idénticos en ratones y tasas de infección, diseminación y transmisión en mosquitos 18 . En el presente documento, detallamos un protocolo que describe cómo cultivar los plásmidos de clones infecciosos, genera ARN viral de longitud completa (el genoma viral) in vitro y recupera el virus infeccioso en cultivo celular. En primer lugar, se describe la propagación de los plásmidos en bacterias o sin bacterias de amplificación mediante amplificación de círculo de rodadura (RCA). A continuación, se muestra cómo se digieren los dos plásmidos y luego se ligan entre sí para generar el virus de longitud completa. Por último, se describe la producción de ARN transcrito y su posterior electroporación en células Vero, seguido de la valoración del virus recuperado ( Figura 1 ]. El enfoque descrito es rápido,R recuperación de las poblaciones de virus infecciosos en 1-2 semanas.

<table><tbody><tr><td>NEB Stable CompetentE. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina, Sal Disódica</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Minipreparación de Plásmidos Zyppy</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20,000 unidades/ml</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 Kit de amplificación</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel y limpieza de PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Camarones Fosfatasa alcalina (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina, ternera intestinal (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>ADN T4 Ligasa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400,000 unidades/mL</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>Células Vero</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 Sistema de electroporación de alto rendimiento</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>Se aceptan otras máquinas.</td></tr><tr><td>LB Caldo con agar (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>También se puede hacer en casa.</td></tr><tr><td>Excelente caldo</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>También se puede hacer en casa.</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>tubos de cultivo VWR</td><td>International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Matraces T75</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>Matraces T182</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-glutamina</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con L-glutamina y 4,5 g/L de glucosa</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Tragacantth Powder</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Desnaturalizado</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td> <td>de 6 pocillosCelltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>Secuenciación Oligos</td><td>IDT</td><td>, consulte la tabla 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>otros métodos son aceptables.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher</td><td></td><td>Q32850</td><td>otros métodos son aceptables.</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit ThermoFisher</td><td></td><td>Q32852</td><td>otros métodos son aceptables.</td></tr><tr><td>El gabinete de bioseguridad de clase II</td><td>varía</td><td>N/A</td><td>Esto es necesario para el trabajo con virus vivos.</td></tr></tbody></table>

rescate y caracterización del virus recombinante de un nuevo mundo zika virus infectious clone

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Los clones de cDNA infecciosos permiten la manipulación genética de un virus, facilitando así el trabajo sobre vacunas, patogénesis, replicación, transmisión y evolución viral. Aquí se describe la construcción de un clon infeccioso para el virus Zika (ZIKV), que actualmente está causando un brote explosivo en las Américas. Para evitar la toxicidad a las bacterias que se observa comúnmente con los plásmidos derivados de flavivirus, se generó un sistema de dos plásmidos que separa el genoma en el gen NS1 y es más estable que las construcciones de longitud completa que no pudo ser recuperado con éxito sin mutaciones. Después de la digestión y la ligación para unir los dos fragmentos, ARN viral de longitud completa puede ser generado por transcripción in vitro con ARN polimerasa T7. Tras la electroporación del ARN transcrito en las células, se recuperó el virus que exhibía cinética de crecimiento in vitro similar y fenotipos de virulencia e infección in vivo en ratones y mosquitos, respectivamente.

El protocolo descrito aquí permite la recuperación de virus Zika derivados de clones infecciosos. Manipular el sistema de clones infecciosos de dos plásmidos es sencillo cuando se realiza con cuidado, en comparación con las versiones de longitud completa que son altamente inestables (datos no mostrados). Después de la digestión y la ligación de las dos piezas distintas, ARN tapado se produce utilizando la transcripción in vitro con T7 polimerasa que luego se electropora...

Este protocolo describe la recuperación del virus Zika infeccioso a partir de un clon de ADNc infeccioso de dos plásmidos.

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

El objetivo general de este procedimiento es recuperar virus infecciosos a partir de un clon de ADN-Z del virus del Zika en dos partes. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la flavivirología, como estrategias de vacunación, patogénesis, transmisión y evolución viral. La principal ventaja de esta técnica es que el sistema en dos partes es más estable que los enfoques de longitud completa. Aunque este método puede proporcionar información sobre el virus del Zika, también puede aplicarse a otros sistemas virales que han resultado difíciles de clonar debido a la inestabilidad del plásmido. El procedimiento será demostrado por James Weger, un postdoctorado de mi laboratorio. Comience preparando reacciones de digestión para ambos plásmidos que codifican el genoma del virus del Zika, P1 y P2. Digiera 3,3 microgramos de P1 con ApaL1 y BamH1 High Fidelity en presencia de una fosfatasa competente en un volumen final de 100 microlitros.Para P2, digiera 13,3 microgramos de ADN P2 con ApaL1 y EcoR1 High Fidelity en un volumen final de 100 microlitros. Incube ambas reacciones a 37 grados Celsius durante 1,2 horas. Después de purificar los plásmidos digeridos utilizando un kit comercial de purificación de geles y PCR, agregue 30 microlitros de tampón de elución precalentado a 70 grados Celsius a la columna e incube durante cinco minutos.Después de centrifugar los plásmidos digeridos purificados, prepare la reacción de ligación combinando 29 microlitros del P1 purificado y 29 microlitros del P2 purificado con tampón de reacción de ligasa T4 ADN y ligasa T4 ADN en agua doblemente destilada hasta un volumen final de 100 microlitros. Incube la reacción de ligación a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la incubación, purifique el plásmido ligado como antes.Esta vez, utilice 10 microlitros de tampón de elución precalentado. A continuación, corra los plásmidos no digeridos, los plásmidos digeridos y la ligación en un gel de agarosa. Una ligación exitosa debe generar un producto de ligación de aproximadamente 11 Kb.Después de confirmar que los plásmidos migran al peso molecular correcto, prepare una reacción de transcripción in vitro con T7 utilizando ocho microlitros de la reacción de ligación purificada e incube durante cuatro horas a 37 grados Celsius. Después de la incubación, mida la concentración de ARN mediante un espectrofotómetro UV. Uno o dos días antes de la electrotransferencia, prepare un frasco T182 con células Vero por cada constructo que deba recuperarse.Incluya un frasco T182 para usarlo como control simulado de electrotransferencia. Cuando las células alcancen una confluencia del 70 al 80 %, caliente el DMEM que contiene 15 % de FBS y 10 milimolar de HEPES en un baño de agua calentado a 37 °C. Desprenda las células mediante tripsinización según métodos estándar y recolecte las células y el medio que contiene 10 % de FBS para inactivar la tripsina.Luego, centrifugue las células a 150 × g durante cinco minutos a cuatro grados celsius. Después de lavar las células tres veces con PBS, suspendemos cada pellet celular en RPMI 1640 más 10 milimolares de HEPES hasta una concentración de aproximadamente 0,5 × 10⁷ células por mililitro. Transfiera 200 microlitros de la suspensión celular a un tubo estéril.A continuación, agregue 20 microlitros de agua como control simulado o 20 microlitros de ARN a cada conjunto de células. Mezcle suavemente las células agitando ligeramente el tubo y luego transfiera el contenido del tubo a una cubeta de electroforesis con una separación de dos milímetros. Configure el electroforador a 170 voltios, resistencia cero Omega y 950 microfaradios.Aplicar un pulso a las células una vez e inmediatamente añadir 600 microlitros del medio precalentado. Añadir las células a un frasco de cultivo de tejidos T75 que contiene 10 mililitros del medio precalentado. Eliminar cualquier medio restante del cubeta utilizando la pipeta incluida con el cubeta.Agite el frasco para mezclar el medio y las células, y luego colóquelo en la incubadora a 37 grados celsius. Al día siguiente y cada día posterior, revise las células para evaluar su viabilidad hasta observar una muerte celular del 50 al 75 % en comparación con el control electroporado simulado. Cuando se observe una muerte celular del 50 al 75 %, recopile el sobrenadante en un tubo cónico y luego centrifugue a más de 3.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados celsius para eliminar los restos celulares.Tras la centrifugación, transfiera el sobrenadante clarificado a un nuevo tubo y agregue SFB hasta una concentración final del 20 %. Además, agregue heparina estéril hasta una concentr游戏副本Esta imagen muestra el efecto similar del virus Zika de tipo salvaje PRVABC59 y el derivado del clon infeccioso sobre la cinética de crecimiento de la línea celular de primate no humano Vero. Esta imagen muestra el efecto de ambos virus sobre células placentarias humanas. Se observa una cinética de crecimiento similar en una línea derivada de mosquito C6/36.Esta curva de supervivencia muestra datos obtenidos de ratones de cuatro semanas de edad, deficientes en los receptores para interferón alfa, beta y gamma, que fueron inoculados con 1.000 PFU de PRVABC59 o con el virus derivado de un clon infeccioso. Aedes aegypti fueron diseccionados 14 días después de una comida sanguínea que contenía el virus Zika. Se utilizaron ensayos de placas para evaluar la infección en el cuerpo de los mosquitos, en las patas para medir la diseminación, o en las secreciones salivales para medir la transmisión del virus infeccioso.Las tasas se presentan como el porcentaje del total de mosquitos que fueron analizados. Al realizar este procedimiento, es importante recordar secuenciar completamente el virus. También es importante recordar cosechar el virus al 50-75% de CPE para minimizar los ciclos de replicación viral.Esta técnica es importante para las investigaciones en el campo de la flavivirología para explorar vacunas, patogénesis y evolución viral en el virus del Zika.

rescue-characterization-recombinant-virus-from-new-world-zika-virus

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Este video muestra un procedimiento para infectar células madre neurales fetales humanas con el virus del Zika. Las células infectadas se pueden utilizar para estudios posteriores.

Infección por el virus del Zika de células madre neurales fetales

Rescate de arenavirus recombinantes a partir de ADNc clonado, un enfoque conocido como la genética inversa, permite a los investigadores estudiar la función de los productos específicos de genes virales, así como la contribución de los diferentes dominios y residuos específicos, a diferentes aspectos de la biología de los arenavirus . Del mismo modo, las técnicas de genética inversa en líneas celulares aprobados por la FDA (Vero) para el desarrollo de vacunas ofrece nuevas posibilidades para la...

Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

El virus del Zika (ZIKV), un patógeno emergente, está relacionado con anomalías del desarrollo fetal y microcefalia. El establecimiento de un sistema eficaz de cultivo de células infecciosas es crucial para los estudios de replicación del ZIKV, así como para el desarrollo de vacunas y fármacos. En este estudio, se ilustran y discuten varios ensayos virológicos relacionados con el ZIKV.

Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Aquí se describe un método para el establecimiento de un modelo de microcefalia inducida por virus Zika en ratón. Este protocolo incluye métodos para embrionario, neonatal y adulto etapa inoculación intracerebral del virus Zika.

Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

Se describe un protocolo para evaluar las respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1- / - modelo murino para la infección del virus (ZIKV) Zika. Este método es fundamental para la investigación de los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis de las vacunas ZIKV y también es valiosa para la evaluación de su eficacia.

Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

Se describe un método para evaluar el efecto de la inmunidad preexistente contra el virus del dengue en la infección del virus Zika mediante el uso de suero humano, las células humanas primarias y cuantificación de la infección por reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real.

Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias

La reciente epidemia del virus del Zika pone de relieve la importancia de establecer enfoques genéticos inversos para desarrollar vacunas y/o estrategias terapéuticas. Aquí, describimos el protocolo para rescatar un virus del Zika recombinante infeccioso de un clon de ADNc de longitud completa ensamblado en un cromosoma artificial bacteriano bajo el control del promotor inmediato-temprano del citomegalovirus humano.

Rescate del virus del Zika recombinante de un clon de ADNc cromosómico artificial bacteriano

El objetivo del protocolo es demostrar las técnicas utilizadas para investigar la enfermedad viral aislándose y cuantificando el virus del Zika, a partir de múltiples órganos en un ratón después de la infección.

Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón

El protocolo presentado puede determinar la competencia vectorial de las poblaciones de mosquitos Aedes aegypti para un virus determinado, como el Zika, en un entorno de contención.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

En este trabajo, describimos los protocolos utilizados en los ensayos basados en replicon y en enzimas virales para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika en un formato de detección de alto rendimiento.

Ensayos antivirales de alto rendimiento para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika

Aprende a recuperar virus Zika infeccioso a partir de un clon de ADN bicistrónico. Este método estable permite estudiar flavivirología, desarrollo de vacunas y patogénesis viral en sistemas difíciles de clonar.

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

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