Proteína película infrarroja electroquímica demostrada para el estudio de la oxidación de2 H de una hidrogenasa [NiFe]

El objetivo general de este protocolo es sondear la química del lado activo de una enzima redox de hidrogenasa de níquel-hierro en condiciones de recambio electrocatalítico de estado estacionario y sin recambio utilizando electroquímica infrarroja de película de proteínas o PFIRE. La principal ventaja de la técnica PFIRE es que permite simultáneamente un control electroquímico preciso y un muestreo espectroscópico infrarrojo de proteínas redox inmovilizadas en un electrodo de carbono. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biofísica y la bioelectroquímica sobre qué estados de la proteína redox están presentes durante el recambio catalítico en estado estacionario.

Para comenzar el procedimiento, en una guantera anaeróbica húmeda suspenda 20 miligramos de partículas de negro de humo de alta superficie en un mililitro de agua ultrapura. Sonicar la suspensión a menor potencia durante al menos 15 minutos o hasta que las partículas se dispersen uniformemente y no se formen sedimentos en una hora en reposo. A continuación, cargue 15 microlitros de una solución de aproximadamente siete miligramos por mililitro de E. Coli hidrogenasa uno en una unidad de filtro centrífugo de 50 kilodalton.

Diluir la solución con 450 microlitros de un tampón de intercambio de baja fuerza iónica con un pH cercano al punto isoeléctrico de la hidrogenasa. Concentrar la mezcla a 50 microlitros por centrifugación a 27.000 veces g. Vuelva a concentrar la mezcla cuatro veces más para completar el intercambio de tampones.

A continuación, combine cinco microlitros de la dispersión de negro de humo de 20 miligramos por mililitro con la hidrogenasa intercambiada por tampón. Almacene la mezcla a cero grados centígrados durante la noche para permitir que la hidrogenasa absorba las partículas de negro de humo. Revise periódicamente la mezcla para mantener la dispersión de partículas.

Centrifugar las partículas modificadas a 27.000 veces g y verificar que el sobrenadante es casi incoloro, lo que indica una buena absorción de la hidrogenasa a las partículas. Lograr un alto nivel de absorción es fundamental para el éxito del experimento. Optimizamos el tampón de absorción utilizando el tampón de baja fuerza iónica a pH cercano al punto isoeléctrico de la proteína como punto de partida.

Lave las partículas con tres a cinco ciclos de centrifugación y resuspensión en tampón de intercambio fresco. Concentre la mezcla de partículas en aproximadamente cinco microlitros para lograr una carga de partículas de 20 miligramos por mililitro. Para empezar a prepararse para tomar las mediciones de PFIRE, limpie un elemento de reflexión interna de silicona mediante sonicación de baja potencia en ácido sulfúrico durante 15 minutos.

Seguido de ácido nítrico durante una hora. Luego enjuague el elemento en agua ultrapura y séquelo bajo un chorro de gas nitrógeno seco. Utilice sellador de silicona de grado eléctrico para fijar el IRE en la placa base de un accesorio ATR de cinco reflexiones, teniendo cuidado de mantener el sellador en los bordes del IRE.

Deje que el sellador se seque por completo. A continuación, coloque la placa base en una guantera anaeróbica seca con una ventana transparente a los infrarrojos junto a un espectrofotómetro FTIR. Monte la placa base en el accesorio ATR.

Adquiera un espectro de fondo en el modo de escaneo rápido. A continuación, desconecte la placa base de accesorios ATR y transfiérala a la guantera anaeróbica húmeda. Lanza un microlitro de las partículas de negro de humo modificado con enzimas de manera uniforme sobre la superficie de IRE sin permitir que las partículas se sequen por completo.

Es importante que la mezcla de partículas modificadas con enzimas se haya concentrado hasta una carga lo más cercana posible a los 20 miligramos por mililitro. De lo contrario, puede ser difícil lograr una película de partículas bien conectada cuando se lanzan las partículas en este paso. Coloque suavemente un trozo de papel carbón empapado en agua ultrapura sobre la superficie de IRE, asegurándose de que la película de partículas esté cubierta sin permitir que el papel entre en contacto con el sellador de silicona.

Monte una celda espectroelectroquímica personalizada sobre el IRE. Agregue 200 microlitros de tampón de experimento a través de la entrada de la solución para mantener la enzima hidratada durante la preparación del sistema. Conecte la entrada y salida de la solución a un vial de tampón de experimento a través de un tubo de bomba peristáltica.

A continuación, transfiera la celda ensamblada a la guantera seca. Monte el conjunto de celdas en el accesorio ATR y conecte el tubo a la bomba peristáltica. Adquiera un espectro absorbente utilizando el espectro previamente adquirido como fondo.

Verificar que las bandas MI2 sean fuertemente visibles a 1.540 centímetros recíprocos y que los picos del sitio activo de hidrogenasa sean detectables en la región de 1.850 a 2.150. Para prepararse para el experimento, aplique un potencial reductor de menos 0,8 voltios frente a un electrodo de referencia de calomel saturado a la película de partículas. Sature el tampón del experimento con gas hidrógeno anaeróbico.

Luego comience a hacer fluir el tampón a través de la celda espectroelectroquímica a aproximadamente 12 mililitros por minuto. Deje la muestra bajo el flujo de tampón de experimento saturado de hidrógeno durante la noche para activar la hidrogenasa. Adquiera un espectro absorbente de la muestra activada y verifique que las bandas de CO y CN del sitio activo muestren múltiples estados reducidos.

A continuación, sature el tampón del experimento con gas nitrógeno anaeróbico y haga fluir el tampón a través de la celda. Aplique un potencial oxidante de cero voltios frente a un electrodo de referencia de calomel saturado durante 30 minutos y adquiera un espectro absorbente. A continuación, aplique un potencial reductor durante 30 minutos y adquiera otro espectro.

Verifique que la enzima se oxidó por completo y luego se redujo. De lo contrario, verifique las conexiones eléctricas de la celda. Utilizando un tampón anaeróbico saturado de hidrógeno, adquiera una serie de voltampogramas cíclicos a caudales crecientes para determinar el caudal óptimo para el experimento.

Usando este caudal, adquiera espectros en un rango de potenciales y condiciones de solución. Las mediciones de PFIRE de E. coli hidrogenasa uno se obtuvieron a varios potenciales en una atmósfera inerte y en presencia de gas hidrógeno. Los espectros adquiridos bajo una atmósfera de hidrógeno representan las distribuciones en estado estacionario de los estados de sitio activo presentes durante la oxidación catalítica de hidrógeno.

A continuación, se investigó la oxidación anaeróbica y la activación de la hidrogenasa a través de la formación del estado de níquel-B a partir del níquel-Si mediante la adquisición de espectros en varios puntos de tiempo durante la posible aplicación y la preparación de diferentes espectros en relación con el primer espectro. La conversión gradual observada de níquel-Si a níquel-B fue consistente con la disminución monótona de la corriente. También se adquirieron espectros en un rango de pH de la solución para investigar los pasos de transferencia de protones del ciclo catalítico de la hidrogenasa.

A pH bajo, el estado de níquel-C fue más prevalente, mientras que el estado de níquel-L fue más prevalente a pH alto. La dependencia del pH de las concentraciones relativas de níquel-C y níquel-L se determinó a partir de los valores máximos de absorbentes en los picos respectivos en cada pH evaluado en el experimento. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la bioelectroquímica exploren la cinética de estado estacionario de la activación del hidrógeno por hidrogénesis.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de un experimento PFIRE típico. La técnica es adecuada para cualquier proteína redox que pueda ser estudiada por electroquímica de película de proteínas y añade una visión química directa a la medición electroquímica.