Cuantificación de la dinámica infrarroja de la potencia espectral y la frecuencia cardíaca en ratones dormidos

El objetivo general de este procedimiento es describir cómo se coordinan las actividades neuronales y cardíacas durante el sueño no REM del ratón. A través de la monitorización y análisis de señales electroencefalográficas, electromiográficas y electrocardiográficas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del sueño.

Por ejemplo, cómo el sueño reconcilia dos necesidades esenciales y evolutivamente preservadas. Que deben ser a la vez continuas y frágiles. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza la polisomnografía estándar para puntuar el sueño no REM de una forma novedosa que se basa en las respuestas conductuales variables a los estímulos externos.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando observamos que los ratones dormidos mostraban respuestas variables al ruido, como despertarse y dormir. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque combina la habilidad quirúrgica, la experimentación mínima y el análisis avanzado. La demostración visual de este método es fundamental, ya que varios pasos esenciales son nuevos en el campo.

En particular en lo que respecta al diseño conductual y al análisis de datos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de los trastornos del sueño en humanos. Porque identifica los momentos del sueño que son altamente frágiles.

Para comenzar el procedimiento, prepárese para EEG ecogeolectrodes utilizando piezas de alambre de oro de 0,5 centímetros de largo, cada una soldada encima de un tornillo de acero chapado en oro. A continuación, límpialos con etanol al 70%. A continuación, prepare dos electrodos EMG-ECG con hilos de oro de tres a cuatro centímetros de largo.

Dobla los cables en un ángulo de 90 grados, a un centímetro de un extremo y prepara una bobina en el otro extremo. Entre los dos extremos, dobla el alambre para crear una pequeña curvatura que corresponde al perfil de la superficie del hueso entre el cerebelo y la lambda. Después de eso, prepare un conector de cabeza hembra a macho de seis canales cubriendo el conector de los pines hembra y macho en la base con cinta adhesiva.

A continuación, añade a los pasadores de las esquinas un poco de estaño para facilitar el proceso de soldadura. En este paso, coloque un animal anestesiado en el aparato estereotáxico colocando la boca. Esto arreglará la cabeza del mouse.

A continuación, fije la cabeza colocando las barras de las orejas en el cráneo con sus extremos reversos romos. Posteriormente, levante la piel en el centro del cráneo y corte suavemente la parte levantada de la piel a lo largo de la línea media desde la parte superior del cuello hasta el nivel de los ojos. A continuación, retira el cuero cabelludo.

Asegúrese de que la ventana sea lo suficientemente grande como para ver claramente el bregma y las fisuras lambda del cráneo. Fije la piel por ambos lados con serafines de bulldog para asegurar el acceso al hueso. A continuación, retire con cuidado el tejido conjuntivo con un bisturí.

Limpie el área con desinfectante a base de yodo y seque el cráneo con un hisopo antiséptico. Luego, con una hoja de bisturí afilada, rasque el cráneo para obtener una superficie ósea limpia y matificada. Usando solo la punta del bisturí, rasque una cuadrícula como una malla de arboledas con una distancia de uno a dos milímetros entre las ranuras.

Después, realice cuatro craneotomías en el cráneo en lugares específicos con un microtaladro. Mientras perfora, sople el polvo de hueso con una pipeta pasteur y limpie cualquier sangrado con hisopos antisépticos. Si se produce un sangrado, asegúrese de que se detenga por completo antes de reanudar el proceso.

Use una esponja hemostática para acelerar la hemostasia. Fije el tornillo en una abrazadera hemostática. En el hemisferio izquierdo, atornille dos tornillos chapados en oro a través de las craneotomías.

Sostenga la pinza verticalmente por encima de la craneotomía y gire el tornillo sin desviarse de la posición vertical. Abra suavemente la abrazadera hemostática para soltar el tornillo. En el hemisferio derecho enroscar los electrodos previamente preparados a través de las craneotomías.

Agregue una gota de pegamento en la parte media del cráneo para asegurar una adherencia firme del EMG-ECG izquierdo. Levante con cuidado el borde de la piel de los músculos del cuello con pinzas e inserte los cables EMG-ECG con los extremos enrollados en los músculos. Para detectar las señales de ECG cardíaco durante el sueño, asegúrese de que el cable EMG-ECG esté insertado en el músculo a una profundidad de aproximadamente 0,8 a un centímetro.

Coloque el EMG-ECG izquierdo junto al tornillo de anclaje posterior izquierdo. Repita el procedimiento para insertar el EMG-ECG derecho. Coloque el EMG-ECG derecho junto al tornillo de anclaje anterior izquierdo.

Asegúrese de que los extremos del bucle estén colocados lo más lejos posible entre sí. Es importante que los cables EMG-ECG se inserten lo suficientemente profundo en el músculo para que la frecuencia cardíaca se detecte de forma fiable. Con una espátula, aplique el pegamento epoxi de dos componentes a la calavera entre y alrededor de los tornillos.

Déjalo secar a la luz pero protege los ojos del animal de una iluminación excesiva. Intente colocar las clavijas del conector lo más cerca posible para minimizar la altura del implante con una pequeña lámpara de cocodrilo. Suelde los cuatro pines en la esquina del conector a los cuatro cables.

Minimice el tiempo de contacto con la punta de soldadura, ya que esto calienta rápidamente los tornillos. A continuación, rellene el espacio entre el pegamento y el conector con cemento dental y cubra las piezas soldadas. Cree una superficie lisa y evite los bordes afilados que puedan lastimar al animal.

Además, evite tocar la piel, ya que esto provoca picazón. Ahora retira los serafines bulldog. Desinfectar la herida con un desinfectante a base de yodo.

Si es necesario, cierre la herida con puntos de sutura delante y detrás del conector. Después, controle al animal todos los días durante una semana y busque pérdida de peso, actividad reducida o anormal y signos de infección. Cinco o seis días después de la cirugía, conecte el cable de grabación al conector de la cabeza del animal, dejándolo en su jaula de origen.

Espere cuatro o cinco días más antes del inicio de la grabación para que el animal se habitúe a la condición y duerma de forma natural. Con un software polisomnográfico comercial, registre los datos de EEG y EMG-ECG durante 48 horas utilizando configuraciones típicas como 2000 x ganancia, una frecuencia de muestreo de 2000 hercios en la adquisición, muestreada a 200 hercios después de la adquisición. Aplique un filtro de paso alto de 0,7 hercios para todas las trazas de EEG y un filtro de paso alto de 10 hercios para todas las trazas de EMG-ECG.

En esta demostración, el ratón ha estado durmiendo durante más de 40 segundos. Aquí están las señales características de baja frecuencia, alta amplitud en el EEG y el bajo tono muscular en las trazas EMG. Es importante que el ratón duerma de forma estable durante al menos 40 segundos antes de que se reproduzca el ruido para garantizar una línea de base larga para el análisis del sueño, antes de despertarse o dormir.

Ahora se entregará un estímulo acústico, aquí un ruido blanco. En este caso, el ratón se despierta en 10 segundos. Tenga en cuenta que el EEG se desincroniza cuando el mouse se despierta.

En otro caso, el ratón no se despierta, aunque el ruido se haya emitido durante más de 20 segundos. Tenga en cuenta que el EEG no se desincroniza. Aquí se muestran las trazas sin procesar del EEG en negro y las señales EMG-ECG correspondientes en gris, durante 40 segundos antes del inicio del ruido y durante los 20 segundos de ruido.

Este es un evento de sueño. Y este es un ejemplo del evento de despertar. Los datos analizados correspondientes para la dinámica de potencia sigma en la ventana de 40 segundos antes del inicio del ruido se muestran aquí para el sueño y la vigilia.

El resultado clave de este análisis es que la potencia sigma está en su punto más bajo antes del inicio del ruido para un evento de sueño y en su punto máximo para un evento de despertar. En contraste con los eventos de vigilia y sueño presentados anteriormente, descartamos los eventos con una transición temprana al sueño REM. Y también descartamos los eventos con un despertar temprano antes de que comience el ruido.

Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que la señal EMG detecte la frecuencia cardíaca durante el sueño no REM. Además, recuerde que el procedimiento de análisis debe entenderse e implementarse en un script de software para extraer la oscilación infralenta. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como registros electrofisiológicos locales o enfoques de diagnóstico por imágenes para seguir los patrones de actividad en áreas cerebrales definidas.

Después de su redesarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo del sueño humano exploren cómo se organizan las actividades neuronales y cardíacas en las diferentes etapas del sueño en durmientes sanos y en pacientes con trastornos del sueño. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo calificar y analizar el sueño no REM retrospectivamente en función de la reactividad conductual del ratón dormido a un estímulo acústico.