Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo
22 de septiembre de 2017
Este manuscrito describe un protocolo para la proyección de imagen en vivo de la retina de ratón con tomografía de coherencia óptica de alta resolución de dominio espectral (SD-OCT). Se centra en las células ganglionares de la retina (RGC) en la región de pepipapilar, con varios análisis y cuantificación de enfoques descritos.
El objetivo general de este experimento es utilizar la tomografía de coherencia óptica o OCT para obtener rápidamente una evaluación precisa del grosor retiniano. La OCT puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como la neuropatía óptica. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un método no invasivo para detectar cambios estructurales en las células ganglionares de la retina del ratón.
Esta técnica es realmente interesante porque es un método no invasivo, seguro y reputado para evaluar el efecto del tratamiento en la neuropatía óptica. Para comenzar, primero ajuste la configuración del brazo de referencia adecuada para el lente. A continuación, encienda la fuente de alimentación y la computadora.
Cuando la computadora esté lista, inicie el programa de imagen. Cree un nuevo estudio clínico y agregue los protocolos deseados. Vaya a la sección de examen del paciente y configure los valores predeterminados del examen.
Haga clic, agregue un paciente en la sección de examen del paciente para añadir un nuevo paciente e ingrese la información relevante del paciente. Luego haga clic en agregar examen, iniciar examen y agregar escaneos preestablecidos de la lista para seleccionar el protocolo deseado, comenzando con el ojo que se medirá primero. Al menos 15 minutos antes de la adquisición de datos, instile gotas a temperatura ambiente de fenilefrina al 10 % en cada ojo de todos los ratones que se probarán.
Luego elimine el reactivo en exceso e instile gotas de tropicamida al 0,5 % a temperatura ambiente. Aproximadamente cinco minutos antes de la adquisición, induzca anestesia general. Inmediatamente después, administre hidrocloruro de oxibuprocaina al 0,4 % en cada ojo, dejando la solución durante tres segundos para anestesiar e inmovilizar los ojos.
A continuación, retire las gotas y repita la instilación de fenilefrina al 10% y tropicamida al 0,5%. Cuando los ojos estén suficientemente dilatados para la imagenología, lubrique los ojos con gotas oftálmicas viscosas a base de glicol para proporcionar hidratación corneal, y envuelva al ratón en una gasa quirúrgica para mantenerlo caliente. Mediante una esponja o torunda de algodón, aplique una capa fina de gel oftálmico suplementado con hipromelosa al 0,3% sobre cada ojo.
Mientras lo hace, separe las pestañas y los bigotes. Coloque al ratón en la cassette con la cabeza recta y orientada hacia adelante, y coloque cuidadosamente la barra de mordida en su boca. Coloque un rodillo de algodón debajo del costado del animal, en el lado del ojo que se está examinando.
A continuación, manteniendo la punta de mira del clip sobre la lente específica del ratón, gire el tornillo del traductor z en sentido antihorario para acercar la lente hacia el ojo. Ajuste previamente la posición del ratón girando y pivotando el casete y ajustando la barra de mordida y los tornillos del traductor x hasta que el ojo experimental esté posicionado para mirar directamente hacia la lente. Cuando el eje óptico de los ojos y la lente estén alineados, seleccione el primer escaneo en el examen.
Haga clic en iniciar la alineación y use el tornillo del traductor z para mover la retina verticalmente en el panel izquierdo y horizontalmente en el panel derecho. Al girar la cinta, mueva el cabezal del nervio óptico hacia arriba o hacia abajo para colocarlo en el centro del panel derecho. Use el tornillo del barra para morder para enderezar la retina dentro del panel derecho y gire la cinta para posicionar el cabezal del nervio óptico en el centro del panel izquierdo.
Luego, utilice el tornillo x-translator para nivelar la retina dentro del panel izquierdo y, teniendo en cuenta la función principal de cada modulador, ajuste aún más la posición de la retina para lograr una centralización perfecta sobre la cabeza del nervio óptico. Cuando la retina esté en posición, haga clic en iniciar captura para comenzar el escaneo de tomografía de coherencia óptica en dominio espectral. No olvide guardar el escaneo y el informe.
Ajuste la centralización si es necesario. Cuando finalice el escaneo, retraiga la lente y coloque el segundo ojo tal como se acaba de demostrar. Después de escanear el segundo ojo, retire al ratón del casete, aplique gel oftálmico con hipromelosa al 0,3 % en cada ojo y coloque al ratón sobre una placa calefactora con monitoreo hasta su recuperación completa.
Para enfocarse en las células ganglionares de la retina, utilice la macro de herramienta de retina MRI creada para ImageJ. Abra la herramienta de retina MRI y modifique la herramienta de selección de polígono y cargue la imagen de interés. Haga clic en M para comenzar la medición, luego haga clic en E para ajustar la posición horizontal. Seleccione el primer casete en la ventana recién abierta del administrador de regiones de interés.
Haga clic en el polígono azul y luego haga clic en los bordes de la capa medida en la imagen para ajustar la posición del primer casete. Seleccione el segundo casete en la ventana del administrador de regiones de interés y ajuste el segundo casete. A continuación, pulse R para volver a medir la retina y ver los resultados en la ventana de mediciones.
Aunque la calidad de una tomografía de coherencia óptica (OCT) en dominio espectral no es tan buena como la de una imagen de una sección transversal de la retina, la OCT permite visualizar más capas. Las capas de la retina se miden fácilmente en una exploración con OCT e incluyen la capa de fibras nerviosas, la capa de células ganglionares, la capa nuclear interna, la capa plexiforme externa, la capa nuclear externa, las capas de segmentos internos y externos, el epitelio pigmentario de la retina y la coroides, lo que permite un estudio complejo de toda la retina. La medición mediante OCT del grosor retiniano acaba de demostrarse e indica que ratones hembras OPA1 mutantes genéticamente con discapacidad visual presentan un engrosamiento progresivo del complejo de células ganglionares y de las capas de fibras nerviosas retinianas peripapilares.
Una comparación de la fibra nerviosa de la retina en el grosor de la capa de células ganglionares mediante el uso de calibradores estándar y caseros demuestra que los calibradores estándar miden un grosor significativamente menor que los calibradores caseros, ya que los calibradores estándar son mucho más gruesos y más difíciles de colocar en un borde de capa delgada. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 15 minutos si se lleva a cabo correctamente. Tras su desarrollo, la OCT allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oftalmología analizaran los cambios estructurales en la retina de ratón.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar y analizar imágenes de OCT para células ganglionares de la retina en ratones.
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Descripción general
Este manuscrito describe un protocolo para la obtención de imágenes in vivo de la retina de ratón mediante tomografía de coherencia óptica de dominio espectral de alta resolución (SD-OCT). El enfoque se centra en las células ganglionares de la retina (RGC) en la región peripapilar, empleando diversos enfoques de escaneo y cuantificación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Oftalmología
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- La tomografía de coherencia óptica (OCT) es una técnica de imagen no invasiva.
- Permite evaluar el grosor retiniano y los cambios estructurales.
- Las células ganglionares de la retina son fundamentales para comprender la neuropatía óptica.
- Este método es seguro y confiable para evaluar los efectos del tratamiento.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo para la obtención de imágenes de las células ganglionares de la retina de ratón.
- Evaluar con precisión y rapidez el grosor retiniano.
- Explorar las implicaciones para la investigación de la neuropatía óptica.
Métodos Utilizados
- Ajuste de la configuración del brazo de referencia para la lente.
- Uso de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral de alta resolución.
- Escaneo de la región peripapilar de la retina.
- Cuantificación de las características de las células ganglionares retinianas.
Resultados principales
- Imágenes exitosas de células ganglionares de la retina in vivo.
- Se demostró la eficacia de la OCT-SD para evaluar el grosor retiniano.
- Proporcionó información sobre los cambios estructurales asociados con la neuropatía óptica.
- Se validó el carácter no invasivo de la técnica.
Conclusiones
- El protocolo ofrece un método confiable para la obtención de imágenes de la retina.
- Mejora la comprensión del estado de salud de las células ganglionares de la retina.
- Esta técnica puede ayudar en la evaluación de tratamientos para la neuropatía óptica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La tomografía de coherencia óptica (OCT) proporciona un método no invasivo y de alta resolución para la evaluación longitudinal de la integridad de las células ganglionares de la retina (RGC) in vivo, lo que permite la detección temprana de cambios estructurales en modelos de neuropatía óptica. Esta capacidad apoya la reducción de riesgos mecanicistas en programas preclínicos de oftalmología al permitir un monitoreo cuantitativo repetido de intervenciones terapéuticas sin necesidad de histología terminal. La técnica mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al proporcionar puntos finales basados en imágenes que se pueden trasladar y que se correlacionan con la supervivencia de las células ganglionares de la retina y la integridad axonal.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación del grosor de la capa de células ganglionares retinianas y los cambios en la capa de fibras nerviosas peripapilares en modelos genéticos de neuropatía óptica.
- Valor operativo: Proporciona imágenes in vivo rápidas y repetibles que reducen la dependencia de la histología terminal y aceleran los plazos de cribado fenotípico.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras mediante lecturas objetivas y longitudinales de la neurodegeneración estructural o su protección.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Genera mediciones cuantitativas estandarizadas del grosor retiniano adecuadas para cribado de alto contenido de compuestos dirigidos a la supervivencia de las células ganglionares retinianas.
- Reproducibilidad: La cuantificación con calibrador casero mejora la precisión en capas retinianas delgadas, aumentando la sensibilidad del ensayo y la consistencia entre experimentos.
- Escalabilidad: El breve tiempo de adquisición (~15 minutos por ratón) permite el cribado de rendimiento moderado en flujos de trabajo de descubrimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad traslacional: Permite la comparación directa de los resultados estructurales entre modelos preclínicos y evaluaciones clínicas mediante OCT en ensayos de neuropatía óptica.
- Alineación de biomarcadores: El grosor de la capa de fibras nerviosas retinianas y del complejo células ganglionares sirve como biomarcadores cuantificables, basados en imágenes, de la salud de las células ganglionares retinianas (RGC).
- Avance ajustado al riesgo: Los datos longitudinales de OCT orientan las decisiones de continuar o no continuar al demostrar el acoplamiento al objetivo y el efecto biológico a lo largo del tiempo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La imagenología OCT se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y las pruebas preclínicas de eficacia, proporcionando una lectura cuantitativa no terminal para estudios de neurodegeneración y protección retinianas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las vías de supervivencia de las células ganglionares de la retina al permitir la fenotipificación estructural in vivo de modelos mutantes y tratados.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles (grosor retiniano, métricas específicas por capa) que facilitan la comparación de compuestos y la validación de resultados positivos.
- Análisis: Genera puntos finales medibles y estadísticos (grosor de capas mediante calibradores estándar o caseros) que permiten la comparación entre grupos y el cálculo del tamaño del efecto.
- Investigación Traducional: Conecta cambios estructurales preclínicos con biomarcadores clínicos de tomografía de coherencia óptica (OCT), apoyando la modelización predictiva de la eficacia terapéutica.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma de imagenología reutilizable aplicable a múltiples modelos de enfermedades oftálmicas y modalidades terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la visualización directa y longitudinal de la integridad de la capa de células ganglionares de la retina (RGC).
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios mediante protocolos de escaneo definidos y métodos de análisis cuantificables.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la interrupción temprana de candidatos ineficaces basándose en puntos finales estructurales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos objetivos sobre la modificación de la enfermedad o la neuroprotección.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes oftálmicas, manejo de animales y operación del sistema de OCT.
- Depende de instrumentación de OCT de dominio espectral con lentes y software compatibles con ratones.
- Necesita la estandarización de los procedimientos de anestesia, dilatación pupilar y preparación ocular entre diferentes usuarios.
- Las consideraciones de adaptación incluyen el ajuste de los protocolos de escaneo y los métodos de cuantificación para distintas regiones retinianas o capas celulares.
- Las limitaciones prácticas incluyen la curva de aprendizaje necesaria para la segmentación precisa de la retina y la necesidad de una cuidadosa calibración al analizar estructuras delgadas como la capa de fibras nerviosas.
