Name: Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a realizar tomografía de coherencia óptica de dominio espectral para imaginar células ganglionares de la retina en ratones. Este método no invasivo permite evaluar el grosor retiniano con precisión y seguridad.

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Este trabajo fue apoyado por el Inserm, Universidad de Montpellier, Francia de Retina, Unión Nacional des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Asociación de síndrome de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France y el laboratorio de excelencia Programa de EpiGenMed.

el protocolo experimental fue aprobado por el Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, Francia), es consistente con las directivas europeas y cumple con la declaración de ARVO para el uso de animales en investigación oftálmica. Se llevó a cabo bajo el acuerdo del Languedoc Rosellón Comité de ética en animales de experimentación (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).
 1. configuración del equipo y preparación antes de la proyección de imagen Nota: aquí, OCT fue realizada en la retina de ratón usando el sistema de proyección de imagen oftálmica de dominio espectral (SD) ( figura 1A). El aparato de la SD-OCT consiste en una base y un montaje de imágenes animal (AIM) con un escenario de alineación roedores (RAS) ( figura 1B). La base incluye la computadora, el motor de la OCT, la sonda de la SD-OCT y el objetivo específico de ratón. La sonda está montada en el objetivo, que incluye el Z-traductor. El RAS se utiliza para el posicionamiento gracias a la mesa con el traductor X y Y, el casete que puede girar y girar, de ratón y la barra de mordedura desprendible con la banda de la nariz. El software proporcionado por el fabricante permite la adquisición y análisis de archivos de la OCT, aunque este último también se puede hacer con un programa de procesamiento de imagen de la abrir-fuente.
<ol><li>Firmemente Coloque la sonda en el objetivo.</li>
	<li>Conectar el objetivo específico de ratón a la sonda.</li>
	<li>Ajustar el brazo de referencia para el objetivo específico (aquí, poder en 086 y posición en el 964).</li>
	<li>Asegurándose que el ratón específico de la lente es lo suficientemente distante del cassette, fijar la barra de mordedura con la banda de la nariz en la cinta de. 
	Nota: La distancia entre la lente y el casete puede ajustarse con el tornillo Z-traductor, situado en la parte posterior del objetivo. La venda de la nariz es una venda de elástico disponible en el mercado, y su tensión se debe ajustar dependiendo del tamaño del ratón.</li>
	<li>Encender la fuente de alimentación (esquina inferior derecha de la cesta) y luego el ordenador.</li>
	<li>Para poner en marcha el programa de imagen, haga doble clic en el acceso directo correspondiente en la pantalla. 
	Nota: Esto depende del tipo de lente; aquí, ratón Retina.</li>
	<li>Crea un nuevo estudio clínico y agrega los protocolos deseados. De lo contrario, utilice el estudio clínico existente ni protocolos.
	<ol><li>Agregar un nuevo estudio eligiendo la &#34; estudio NameŔ &#34; IDŔ &#34; especificaciones del brazo de tratamiento &#34; (aquí, &#34; Uncategorized &#34;); y predefinidos &#34; protocolos de exploración &#34;, si existen.</li>
	</ol></li> <li>Elegir un &#34; forense &#34; en la &#34; estudio clínico &#34; sección. 
	Nota: para un nuevo &#34; examinador &#34;, ir a &#34; Setup examinadores &#38; médicos &#34; para definir lo</li>
	Sección <li>Agregar un nuevo paciente en el examen de paciente por haga clic en agregar paciente, entrando en el &#34; ID &#34;, &#34; nombre &#34;, &#34; Apellido &#34;, &#34; sexo &#34;, y &#34; fecha de nacimiento &#34; (opcional). 
	Nota: Hacer esto justo antes de probar cada ratón, si es más conveniente. Asegúrese de que el ID es no más de 10 caracteres. Para el ratón, el error refractivo de ambos ojos es 0 y la longitud axial es 23.0.</li>
	<li>Haga clic en &#34; examen agregar &#34; y seleccione el deseado &#34; protocolo &#34; agregando &#34; Preset analiza &#34; de la lista, empezando con el ojo que se medirá en primer lugar (aquí, el ojo derecho), o mediante la personalización de las exploraciones de.</li>
	<li>Para personalizar un análisis, utilizar un escaneo existente como una plantilla y editarla o crear desde cero a través de la &#34; Añadir Custom Scan &#34; opción. Después de agregar todas las exploraciones a la lista, definir un nuevo protocolo que usa la &#34; Enter &#34; nuevo nombre protocolo &#34; opción (OS: oculus ojo siniestro, izquierdo; OD: oculus dexter, derecho de ojo). 
	Nota: Aquí, el protocolo consiste en tres análisis: (i) una exploración radial, con un diámetro de 1.4 mm, desplazamientos horizontales y verticales de 0 mm, 1.000 líneas de A-exploraciones/B-scan, B 100, exploraciones y volumen, 1 marco/B-scan, 80 líneas de inactivo A exploraciones/B-scan, volumen 1; (ii) una exploración rectangular, con una longitud de 1,4 mm y ancho, ángulo de 0°, 0 mm desplazamientos horizontales y verticales, 1.000 líneas de A-exploraciones/B-scan, B-100 Scan, 1 marco/B-scan, 80 líneas de inactivo A exploraciones/B-scan, volumen 1; y (iii) un anular, con 0.4 mm mínimo y 0.6 mm diámetro máximo, desplazamientos horizontales y verticales de 0 mm, 1.000 líneas de A-exploraciones/B-scan, B-análisis/volumen 3, 48 Marcos/B-scan, 80 líneas de inactivo A exploraciones/B-scan, volumen 1.</li>
</ol> 2. Preparación de mouse <ol><li>inmovilización y la dilatación del ojo <ol><li>por lo menos 15 min antes de adquisición de datos, instilar gotas de fenilefrina 10% en los ojos de ratón, retirar el exceso y tropicamida 0.5% gotas. 
		Nota: La primera dilatación se puede hacer a la vez para todos los ratones que se probará en la sesión. Asegúrese de que los líquidos están a temperatura ambiente.</li>
		<li>Inmediatamente después induce anestesia general (paso 2.2), administrar 0,4% oxybuprocaine clorhidrato gotas, mantener en lugar de 3 s para anestesiar e inmovilizar los ojos. Luego, limpie las gotas y repetir la instilación de tropicamida fenilefrina y el 0.5% de 10% para comprobar que los ojos se dilatan bien. 
		Nota: Asegúrese de que los líquidos están a temperatura ambiente y que el ratón no se traguen el oxybuprocaine.</li>
	</ol></li> <li>Anestesia general <ol><li>preparar una solución anestésica de ketamina (20 mg/mL) y xilacina (1,17 mg/mL) en solución salina. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.</li>
		<li>Unos 5 min antes de la prueba, inyectar por vía intraperitoneal 5-10 μl de la solución anestésica por 1 g de masa corporal, dependiendo de la edad y el tamaño del ratón. 
		Nota: Jóvenes o ratones delgados necesidad menos anestesia, toma menos tiempo para anestesiar, pero también despertar más rápido. Aquí, 8 μl/g (160 mg/kg de ketamina, 9,33 mg/kg de xilacina).</li>
		<li>Opcionalmente lubricar los ojos con gotas viscosas o un gel oftálmico para evitar la sequedad corneal.</li>
	</ol></li></ol> 3. Posicionamiento de ratón <ol><li>lubricar los ojos con ojos viscosos basados en glicol de gotas para proporcionar hidratación corneal. 
	Nota: Si los ojos parecen secos durante el examen, vuelva a aplicar las gotas de ojo.</li>
	<li>Envolver el ratón en una hoja de Gasa quirúrgica para mantener caliente.</li>
	<li>Usando una mecha de esponja o un algodón, aplicar una fina capa de un gel oftálmico con hipromelosa 0,3% en cada ojo, para minimizar la refracción de la luz, evitar opacidad y segura hidratación corneal. Al hacerlo, mover las pestañas y los bigotes a un lado.</li>
	<li>Coloque el ratón en el cassette, con el cabeza hacia adelante recta y señalando.</li>
	<li>Suavemente Abra la abrazadera de la barra de mordedura y coloque la barra en la boca, use la banda de la nariz para asegurar la posición. 
	Nota: Asegúrese de que la barra de mordedura está en el centro el cartucho de.</li>
	<li>Lugar un algodón rodar debajo de la derecha (izquierda) si se está probando el ojo derecho (izquierdo).</li>
	<li>Manteniendo la punta con el objetivo con clip en el objetivo específico de ratón, llevarlo hacia el ojo girando el tornillo Z-traductor izquierdo.</li>
	<li>Por rotación y girar el cassette y girando la barra de mordedura y los tornillos X-traductor, ajuste la posición del ratón, el objetivo es tener la mirada ojo derecho directamente en la lente y así alinear los ejes ópticos de los ojos y la lente. 
	Nota: Si el ratón es demasiado alta o demasiado baja, el tornillo Y traductor debe usarse primero.</li>
	<li>Elegir la primera exploración en la &#34; examen &#34;, haga clic en &#34; con el objetivo de empezar a &#34; y hacer cualquier ajuste adicional manual para la proyección de imagen retiniana.
	<ol><li>Con el tornillo Z-traductor, mover la retina verticalmente en el panel de la izquierda ( figura 2, alineación Horizontal B-scan) y horizontalmente en la rpanel de abajo ( figura 2, la alineación Vertical de B-scan).</li>
		<li>Gire el cassette para el HNO en el panel de la derecha moviendo el HNO hacia arriba o hacia abajo. Use el tornillo de la barra de mordedura para enderezar la retina en el panel derecho. Girar el cassette para el HNO en el panel de la izquierda.</li>
		<li>Utilice el tornillo X-traductor a nivel de la retina en el panel izquierdo. Más teniendo en cuenta la función principal de cada modulador, ajustar la posición de la retina para centralizar el Hno. 
		Nota: Utilice el tornillo Y traductor para mover el HNO arriba y abajo en el panel derecho, si es necesario. La posición puede ser refinada en cualquier momento entre exploraciones.</li>
	</ol></li></ol> 4. SD-OCT la proyección de imagen del HNO y Retina <ol><li>una vez que contenido con los ajustes, haga clic en &#34; instantánea de inicio &#34; para empezar a escanear la SD-OCT.
	<ol><li>Si la proyección de una imagen 3D no es necesaria, desactive la opción OCU.</li>
	</ol></li> <li>Guardar la exploración y el informe.</li>
	<li>Continuar con el análisis siguiente.</li>
	<li>Para el segundo ojo de la imagen, después de retraer el lente, gire el cartucho de forma y repetir pasos 3.6-4.3.</li>
</ol> 5. Terminación de adquisición <ol><li>cuando es completa la adquisición, quitar el mouse del cassette, aplicar gel oftálmico con hipromelosa 0,3% para cada ojo y coloque el mouse sobre una placa de calefacción para arriba</li>
	<li>Después de la última adquisición, cierre el programa y apague el ordenador y la máquina de OCT (botón de suministro de energía).</li>
	<li>Limpiar el casete con desinfectante.</li>
</ol> 6. Análisis <ol><li>para la medición de espesor de la capa retiniana, utilice el software de segmentación automatizada proporcionado por el fabricante.
	<ol><li>Haga clic en el &#34; paciente &#34;, elija el deseado &#34; examen &#34; desde entonces la lista y haga clic en el &#34; de examen &#34; opción.</li>
		<li>Cargar los datos deseados de OCT en el software OCT haciendo clic derecho en el icono de la carpeta de exploración deseada.</li>
		<li>Derecho haga clic en el B-scan; configurar las pinzas permitiendo hasta 10 medición Calibradores; y escriba sus nombres, ángulos y colores.</li>
		<li>Elegir el calibre deseado haciendo un clic derecho en el B-scan; lugar por consiguiente a la retina para la medición de. 
		Nota: Para el análisis centrados en el HNO, establecer 5 pinzas en cada lado de ella, equidistantes unos de otros. Para el análisis de pepipapilar, asegúrese de que la pinza no esté demasiado lejos del Hno. Para el escaneo radial, analizar 10 imágenes por exploración que fueron elegidos por el software de OCT. Su número puede encontrarse en la &#34; informes &#34; carpeta.</li>
		<li>Guardar los resultados para el análisis en un programa de hoja de cálculo haciendo clic en el B-scan y haga clic en &#34; guardar los resultados de &#34;. 
		Nota: Los resultados pueden encontrarse en la misma carpeta como el análisis de datos.</li>
	</ol></li> <li>Alternativamente, utilice la macro calibrador casero, &#34; MRI Retina herramienta &#34;, desarrollado para un programa de procesamiento de imágenes de código abierto (véase la tabla de materiales).
	<ol><li>Asegúrese de que el &#34; MRI Retina herramienta &#34; y la &#34; modificar polígono sección herramienta &#34; macros están activas. Cargar la imagen. Haga clic en el botón m para iniciar la medición. 
		Nota: La macro crea automáticamente un 0,2 mm de longitud medición de cinta a ambos lados del Hno. Cada cassette contiene 5 puntos de medición que funcionan como pinzas. Su posición lateral es inmutable y modificado para requisitos particulares para la peripapilla en las exploraciones radiales. La posición horizontal de las cintas está predefinida para medir el grosor de la RNFL/GCL, pero es fácilmente modificable para medir la capa compleja de la GC en su lugar. Si la calidad del escaneo es pobre, la posición horizontal debe ajustarse o la imagen debe ser excluidos del análisis.</li>
		<li>Para ajuste horizontal, haga clic en el botón e. En el recién inaugurado &#34; ROI Manager &#34; ventana, elija el primer cassette.</li>
		<li>En el polígono azul, haga clic en el botón y ajuste la posición del primer cassette haciendo clic en los bordes de la capa, medido en la imagen.</li>
		<li>Repetir para el segundo cassette de primera elección en la &#34; ROI Manager &#34; ventana y luego haciendo clic en la imagen correspondiente. Haga clic en el botón r para volver a medir. Ver los resultados en la &#34; medidas &#34; ventana. 
		Nota: Los resultados pueden copiarse a un programa de hoja de cálculo en cualquier momento. Contienen los siguientes valores para el total, cassette izquierdo (l) y derecha cassette (r): Intden - densidad integrado en el cartucho; : Área de la medición en mm 2; Len: longitud de la pinza en el cassette, en mm; Significa: significa la intensidad de la señal dentro de la cinta; y enfermedades de transmisión sexual: error estándar de la media intensidad de la señal de.</li>
		<li>Proceder con la siguiente imagen.</li>
		<li>Más analiza los datos en un programa de hoja de cálculo. 
		Nota: Para encontrar el espesor promedio de la capa, tomar el Len de diez valores.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Drexler, W., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+retinal+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art retinal optical coherence tomography.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).</li>
<li>Grenier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WFS1+in+Optic+Neuropathies%3A+Mutation+Findings+in+Nonsyndromic+Optic+Atrophy+and+Assessment+of+Clinical+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity.</a> Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).</li>
<li>Zmyslowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+thinning+as+a+marker+of+disease+progression+in+patients+with+Wolfram+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome.</a> Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).</li>
<li>Fischer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive%2C+in+vivo+assessment+of+mouse+retinal+structure+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography.</a> PLoS One. 4 (10), e7507(2009).</li>
<li>Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+the+Retina+With+Full-Field+Optical+Coherence+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).</li>
<li>Mustafa, S., Pandit, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+diagnosis+and+management+of+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+India%22%5BJournal%5D)">Approach to diagnosis and management of optic neuropathy.</a> Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).</li>
<li>Sarzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+OPA1delTTAG+mutation+induces+premature+age-related+systemic+neurodegeneration+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse.</a> Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).</li>
<li>Sarzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+steroidogenesis+promotes+early-onset+and+severe+vision+loss+in+females+with+OPA1+dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy.</a> Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).</li>
<li>Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1248/">Gene Reviews</a>. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).</li>
<li>Lenaers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Dominant optic atrophy.</a> Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).</li>
<li>Delettre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+gene+OPA1%2C+encoding+a+mitochondrial+dynamin-related+protein%2C+is+mutated+in+dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy.</a> Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+retinal+morphologic+and+functional+changes+in+mice+following+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El sistema OCT, un no-invasivo en vivo imagen método, proporciona alta resolución exploraciones de Cruz-section-como retinales. Por lo tanto, su principal ventaja es su potencial para un análisis detallado, con la maravillosa oportunidad de incorporar protocolos habitualmente aplicados a los seres humanos a modelos de ratón.
En el ejemplo de Opa1delTTAG ratones mutantes, SD-OCT resultados mostraron un aumento de espesor de capa compleja de RNFL y GC, que permite ma...

OCT es una herramienta de diagnóstico que facilita la examinación de estructuras retinianas1, incluyendo la cabeza del nervio óptico (HNO). Con los años se ha convertido en un indicador confiable de la progresión de la enfermedad en los seres humanos2,3, así como en roedores4,5. Utiliza la interferometría para crear imágenes transversales de las capas retinales con una resolución axial de 2 μm. La capa más interna es la capa de fibras nerviosas retinianas (RNFL), que contiene axones RGC, que es seguida por la capa de células ganglionares (GCL), que contienen en su mayoría grave. El siguiente es la capa plexiforme interna (IPL), encuentro de dendritas RGC axones de células bipolares, horizontales y amacrinas. Éstos, junto con las células horizontales, forman la capa nuclear interna (INL), y sus salientes se conectan con axones de fotorreceptor en la capa plexiforme externa (OPL). Esto es seguido por la capa nuclear externa (ONL), con cuerpos de la célula del fotorreceptor y está separada de la capa del fotorreceptor por la membrana limitante externa (OLM), también llamada segmento segmento interno/externo (IS / OS) capa. Finalmente, las últimas capas observables en la retina de ratón son el epitelio retiniano del pigmento (RPE) y la coroides (C). El RNFL solo normalmente es demasiado fina para medirse en ratones; así, analizando la RNFL/GCL es preferible4,5. Otra posibilidad es la capa compleja de GC, que contiene el último además de la IPL, lo que es más grueso y así aún más fácil medir en OCT explora4. En consecuencia, OCT permiten comprender mejor la situación patológica de la retina, como en OPNs.
Por otra parte, el espesor de la retina de ratón se analiza a menudo con la histología post mortem . Sin embargo, esta técnica enfrenta limitaciones relacionadas con la colección de tejidos, fijación, corte, coloración, montaje, etc. por lo tanto, algunos defectos, tales como cambios de espesor sutil, no pueden ser detectado. Por último, porque el mismo ratón no puede ser probado en tiempo varios puntos, el número de animales por estudiar mucho aumento, a diferencia de OCT. Todo, la no invasividad, alta resolución, posibilidad de repetición, control de tiempo en tiempo y facilidad de uso de la tecnología OCT hacen el método de elección en los estudios de la enfermedad retiniana.
Modelos de ratón se utilizan para identificar defectos del gene y para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes de retinopatías6. OPN es una forma de retinopatía con considerable daño al nervio óptico (en), que se compone de axones RGC aproximadamente 1,2 millones. OPN se puede centrar en el o puede ser secundaria a otros trastornos congénitos o no7, llevando a la pérdida de campo visual y más tarde, ceguera. Rasgos característicos de OPN son leve pérdida y daño, que pueden observarse en humano OCT RNFL y GCL adelgazamiento2,3. Mientras tanto, la fisiopatología de la OPN es todavía mal entendida, y por lo tanto, permanece la necesidad de probar la retina de ratón.
Este manuscrito describe la proyección de imagen y cuantificación del espesor de la capa retiniana, usando el ejemplo del Opa1delTTAG ratón línea8,9, un modelo de la atrofia óptica dominante (DOA)10. Evaluar la patofisiología RGC, se cuantificaron exploraciones radiales, rectangulares y anulares. Esto fue hecha con pinzas estándar proporcionadas por el software de OCT o con una macro casera desarrollado para un programa de procesamiento de imágenes de código abierto. Las pinzas estándar son difíciles de manipular y a menudo más grueso que el RNFL/GCL, mientras que las pinzas caseras son más precisos, reproducibles y fáciles de usar. La macro realiza una medición de una capa automáticamente detectada, en 5 puntos y en posiciones fijas, en ambos lados del HNO en la región de pepipapilar. El objetivo del protocolo presentado es describir adquisición de exploración de OCT para especificar posición retiniana, con un enfoque en RGCs.

<table><tbody><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opa1delTTAG ratón</td><td>Instituto de Neurociencias de Montpellier, INSERM UMR 1051,</td><td></td> <td>France-Opa1 knock-in ratones portadores&nbsp; Mutación c.2708_2711delTTAG OPA1 en C57Bl6/J antecedentes</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System</td><td>Bioptigen, Leica Microsystems, Alemania</td><td>-</td><td>Sistema de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral</td></tr><tr><td>EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software</td><td>Bioptigen, Leica Microsystems,</td> <td>Alemania-Software</td> <td>para la adquisición y análisis de OCT</td></tr><tr><td>ImageJ 1.48v</td><td>Wayne Rasband, Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.</td><td>-</td><td>Software para análisis, requiere descargar e instalar dos macros caseras: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool</td></tr><tr><td>Placa calefactora autorregulable</td><td>Bioseb, Francia</td><td>BIO-062</td><td>Protección contra la hipotermia</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Suministros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banda nasal</td><td>-</td><td>-</td><td>Banda elástica</td></tr><tr><td>Almohadillas de gasa 3" x 3"</td> <td>Curad, EE. UU</td>. <td>CUR20434ERB</td><td>Protección contra la hipotermia</td></tr><tr><td>Aplicador de punta de algodón de doble punta</td><td>Essence of Beauty, CVS Health Corporation, EE. UU.-</td>Aplicación <td>de</td> <td>gel</td></tr><tr><td>Cotton Twists</td><td>CentraVet, Francia</td><td>T.7979C.CS</td><td>Posicionamiento del ratón</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Reactivos y Medicamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N&eacute; osyn&eacute; phrine Faure 10%</td><td>Laboratoires Europhtha,</td> <td>Monaco-Eye</td> <td>dilatation</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0.5%</td><td>Laboratoires Th&eacute; a, Francia</td><td>3397908</td><td>Dilatación ocular</td></tr><tr><td>Cebesina 0,4%</td><td>Laboratoire Chauvin, Bausch& Lomb, Francia</td><td>3192342</td><td>Anestesia local</td></tr><tr><td>Imalgene 1000</td><td>Merial, Francia/CentraVet, Francia</td><td>IMA004</td><td>Anestesia general</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer Healthcare, Alemania/CentraVet, Francia</td><td>ROM001</td><td>Anestesia general, analgesia, relajación muscular</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%</td><td>Laboratoire Osalia, Francia&nbsp;</td><td>103697114</td><td>Suero fisiológico</td></tr><tr><td>Systene Ultra</td><td>Alcon, Novartis, EE. UU.</td><td>-</td><td>Hidratación de los ojos</td></tr><tr><td>GenTeal'Alcon</td><td>, Novartis, EE. UU</td><td>.-</td><td>Gel oftálmico para minimizar la refracción de la luz y las opacidades</td></tr><tr><td>Aniospray Surf 29</td><td>Laboratoires Anios, Francia</td><td>59844</td><td>Desinfectante</td></tr></tbody></table>

tomografía de coherencia óptica: proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células in vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Cambios estructurales en la retina son manifestaciones comunes de enfermedades oftálmicas. Tomografía de coherencia óptica (OCT) que permite su identificación en vivo— rápidamente, repetidor y con una alta resolución. Este protocolo describe OCT la proyección de imagen en la retina de ratón como una poderosa herramienta para el estudio de neuropatías ópticas (OPN). El sistema de OCT es una alternativa no invasiva, basada en la interferometría a común análisis histológico post mortem . Proporciona una evaluación rápida y precisa del grueso retiniano, lo que permite la posibilidad de cambios, tales como adelgazamiento o engrosamiento retiniano. Presentamos el proceso de proyección de imagen y análisis con el ejemplo de la línea de ratón Opa1delTTAG . Se proponen tres tipos de análisis, con dos métodos de cuantificación: calibradores estándar y caseros. Este último es mejor para el uso en la retina pepipapilar durante exploraciones radiales; siendo más precisos, es preferible para el análisis de las estructuras más finas. Todos los enfoques descritos aquí están diseñados para que las células ganglionares de la retina (RGC), pero son fácilmente adaptables a otras poblaciones de la célula. En conclusión, la OCT es eficiente en fenotipado de modelo ratón y tiene el potencial de ser utilizado para la evaluación confiable de las intervenciones terapéuticas.

La tecnología de la SD-OCT permite imaginar retiniana y análisis de espesor que es comparable a la histología, pero es más rápida y más detallada (figura 3). Tal como se presenta con los ratones de tipo salvaje C57Bl/6, aunque la calidad de una exploración de la SD-OCT (Figura 3A, derecha) no es tan buena como la de una imagen de sección retiniana (Figura 3A, izquierda), visualiza más capas (por ...

Este manuscrito describe un protocolo para la proyección de imagen en vivo de la retina de ratón con tomografía de coherencia óptica de alta resolución de dominio espectral (SD-OCT). Se centra en las células ganglionares de la retina (RGC) en la región de pepipapilar, con varios análisis y cuantificación de enfoques descritos.

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

El objetivo general de este experimento es utilizar la tomografía de coherencia óptica o OCT para obtener rápidamente una evaluación precisa del grosor retiniano. La OCT puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como la neuropatía óptica. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un método no invasivo para detectar cambios estructurales en las células ganglionares de la retina del ratón.Esta técnica es realmente interesante porque es un método no invasivo, seguro y reputado para evaluar el efecto del tratamiento en la neuropatía óptica. Para comenzar, primero ajuste la configuración del brazo de referencia adecuada para el lente. A continuación, encienda la fuente de alimentación y la computadora.Cuando la computadora esté lista, inicie el programa de imagen. Cree un nuevo estudio clínico y agregue los protocolos deseados. Vaya a la sección de examen del paciente y configure los valores predeterminados del examen.Haga clic, agregue un paciente en la sección de examen del paciente para añadir un nuevo paciente e ingrese la información relevante del paciente. Luego haga clic en agregar examen, iniciar examen y agregar escaneos preestablecidos de la lista para seleccionar el protocolo deseado, comenzando con el ojo que se medirá primero. Al menos 15 minutos antes de la adquisición de datos, instile gotas a temperatura ambiente de fenilefrina al 10 % en cada ojo de todos los ratones que se probarán.Luego elimine el reactivo en exceso e instile gotas de tropicamida al 0,5 % a temperatura ambiente. Aproximadamente cinco minutos antes de la adquisición, induzca anestesia general. Inmediatamente después, administre hidrocloruro de oxibuprocaina al 0,4 % en cada ojo, dejando la solución durante tres segundos para anestesiar e inmovilizar los ojos.A continuación, retire las gotas y repita la instilación de fenilefrina al 10% y tropicamida al 0,5%. Cuando los ojos estén suficientemente dilatados para la imagenología, lubrique los ojos con gotas oftálmicas viscosas a base de glicol para proporcionar hidratación corneal, y envuelva al ratón en una gasa quirúrgica para mantenerlo caliente. Mediante una esponja o torunda de algodón, aplique una capa fina de gel oftálmico suplementado con hipromelosa al 0,3% sobre cada ojo.Mientras lo hace, separe las pestañas y los bigotes. Coloque al ratón en la cassette con la cabeza recta y orientada hacia adelante, y coloque cuidadosamente la barra de mordida en su boca. Coloque un rodillo de algodón debajo del costado del animal, en el lado del ojo que se está examinando.A continuación, manteniendo la punta de mira del clip sobre la lente específica del ratón, gire el tornillo del traductor z en sentido antihorario para acercar la lente hacia el ojo. Ajuste previamente la posición del ratón girando y pivotando el casete y ajustando la barra de mordida y los tornillos del traductor x hasta que el ojo experimental esté posicionado para mirar directamente hacia la lente. Cuando el eje óptico de los ojos y la lente estén alineados, seleccione el primer escaneo en el examen.Haga clic en iniciar la alineación y use el tornillo del traductor z para mover la retina verticalmente en el panel izquierdo y horizontalmente en el panel derecho. Al girar la cinta, mueva el cabezal del nervio óptico hacia arriba o hacia abajo para colocarlo en el centro del panel derecho. Use el tornillo del barra para morder para enderezar la retina dentro del panel derecho y gire la cinta para posicionar el cabezal del nervio óptico en el centro del panel izquierdo.Luego, utilice el tornillo x-translator para nivelar la retina dentro del panel izquierdo y, teniendo en cuenta la función principal de cada modulador, ajuste aún más la posición de la retina para lograr una centralización perfecta sobre la cabeza del nervio óptico. Cuando la retina esté en posición, haga clic en iniciar captura para comenzar el escaneo de tomografía de coherencia óptica en dominio espectral. No olvide guardar el escaneo y el informe.Ajuste la centralización si es necesario. Cuando finalice el escaneo, retraiga la lente y coloque el segundo ojo tal como se acaba de demostrar. Después de escanear el segundo ojo, retire al ratón del casete, aplique gel oftálmico con hipromelosa al 0,3 % en cada ojo y coloque al ratón sobre una placa calefactora con monitoreo hasta su recuperación completa.Para enfocarse en las células ganglionares de la retina, utilice la macro de herramienta de retina MRI creada para ImageJ. Abra la herramienta de retina MRI y modifique la herramienta de selección de polígono y cargue la imagen de interés. Haga clic en M para comenzar la medición, luego haga clic en E para ajustar la posición horizontal. Seleccione el primer casete en la ventana recién abierta del administrador de regiones de interés.Haga clic en el polígono azul y luego haga clic en los bordes de la capa medida en la imagen para ajustar la posición del primer casete. Seleccione el segundo casete en la ventana del administrador de regiones de interés y ajuste el segundo casete. A continuación, pulse R para volver a medir la retina y ver los resultados en la ventana de mediciones.Aunque la calidad de una tomografía de coherencia óptica (OCT) en dominio espectral no es tan buena como la de una imagen de una sección transversal de la retina, la OCT permite visualizar más capas. Las capas de la retina se miden fácilmente en una exploración con OCT e incluyen la capa de fibras nerviosas, la capa de células ganglionares, la capa nuclear interna, la capa plexiforme externa, la capa nuclear externa, las capas de segmentos internos y externos, el epitelio pigmentario de la retina y la coroides, lo que permite un estudio complejo de toda la retina. La medición mediante OCT del grosor retiniano acaba de demostrarse e indica que ratones hembras OPA1 mutantes genéticamente con discapacidad visual presentan un engrosamiento progresivo del complejo de células ganglionares y de las capas de fibras nerviosas retinianas peripapilares.Una comparación de la fibra nerviosa de la retina en el grosor de la capa de células ganglionares mediante el uso de calibradores estándar y caseros demuestra que los calibradores estándar miden un grosor significativamente menor que los calibradores caseros, ya que los calibradores estándar son mucho más gruesos y más difíciles de colocar en un borde de capa delgada. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 15 minutos si se lleva a cabo correctamente. Tras su desarrollo, la OCT allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oftalmología analizaran los cambios estructurales en la retina de ratón.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar y analizar imágenes de OCT para células ganglionares de la retina en ratones.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra una técnica de imagen in vivo para detectar y cuantificar la inflamación ocular en un modelo de ratón de uveítis postinfecciosa. La técnica, conocida como tomografía de coherencia óptica (OCT, por sus siglas en inglés), genera imágenes transversales de alta resolución del ojo para evaluar la progresión de la enfermedad.

Tomografía de coherencia óptica para evaluar la uveítis en un modelo de ratón

Fuente: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2021).Este video muestra una técnica para obtener imágenes de la retina in vivo utilizando microscopía de dos fotones. Los ratones anestesiados se preparan para la obtención de imágenes asegurando sus cabezas, aplicando lubricante ocular y colocando un cubreobjetos sobre el ojo. Las células ganglionares de la retina (CGR) que expresan proteínas fluorescentes se visualizan primero mediante...

Imágenes in vivo de dos fotones de la retina del ratón

Source: Jagodzinska, J., et. al., Tomografía de Coherencia Óptica: Imágenes de las Células Gangliales de la Retina del Ratón In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  En este video, demostramos el uso de la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para obtener imágenes de las capas de la retina y evaluar los cambios estructurales en un modelo de ratón modificado genéticamente con neuropatía óptica.

Obtención de imágenes in vivo de la retina del ratón mediante tomografía de coherencia óptica

Este protocolo describe cómo alta resolución técnicas imagenológicas como una tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser puede ser utilizada en pequeños roedores, utilizando un sistema de plataforma imagen oftálmica, para obtener información sobre espesor retiniano y microglía células distribución, respectivamente.

En Vivo Proyección de imagen de ratones de reportero Cx3cr1gfp/gfp con tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser

Se presenta un protocolo detallado para la evaluación de lecturas visuales y estructurales en roedores por coherencia óptica tomografía y optoquinéticas respuesta. Los resultados proporcionan información valiosa para la investigación oftalmológica y neurológica.

Utilizando tomografía de coherencia óptica y respuesta Optokinetic como lecturas de sistema Visual estructural y funcional en ratones y ratas

Aquí, describimos el uso de la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para visualizar estructuras retinianas y oculares in vivo en modelos de degeneración retiniana, glaucoma, retinopatía diabética y miopía.

Evaluaciones estructurales in vivo de enfermedades oculares en modelos de roedores mediante tomografía de coherencia óptica

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

Aquí, describimos una técnica de imagen in vivo utilizando tomografía de coherencia óptica para facilitar el diagnóstico y la medición cuantitativa de la retinopatía en ratones.

Aplicación de la tomografía de coherencia óptica a un modelo de retinopatía en ratones

El presente protocolo describe los pasos para alinear las imágenes de fibragrafía de tomografía de coherencia óptica en luz visible (vis-OCTF) in vivo con imágenes confocales ex vivo de la misma retina de ratón con el fin de verificar la morfología del haz de axones de las células ganglionares de la retina observada en las imágenes in vivo .

Alineación de figramas de tomografía de coherencia óptica en luz visible con imágenes confocales de la misma retina de ratón

Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

Aprende a realizar tomografía de coherencia óptica de dominio espectral para imaginar células ganglionares de la retina en ratones. Este método no invasivo permite evaluar el grosor retiniano con precisión y seguridad.

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

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