Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

El objetivo general de este experimento es utilizar la tomografía de coherencia óptica (OCT) para obtener rápidamente una evaluación precisa del grosor de la retina. La OCT puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como la neuropatía óptica. La principal ventaja de esta técnica es que es un método no invasivo para detectar cambios estructurales en las células ganglionares de la retina del ratón.

Esta técnica es realmente interesante porque es un método no invasivo, seguro y de buena reputación para probar el efecto del tratamiento en la neuropatía óptica. Para comenzar, primero ajuste la configuración del brazo de referencia apropiada para la lente. A continuación, encienda la fuente de alimentación y la computadora.

Cuando la computadora esté lista, inicie el programa de imágenes. Cree un nuevo estudio clínico y agregue los protocolos deseados. Vaya a la sección de examen del paciente y establezca los valores predeterminados del examen.

Haga clic en agregar paciente en la sección de examen del paciente para agregar un nuevo paciente e ingrese la información relevante del paciente. A continuación, haga clic en Agregar examen, Iniciar examen y agregue escaneos preestablecidos de la lista para seleccionar el protocolo deseado comenzando con el ojo que se medirá primero. Al menos 15 minutos antes de la adquisición de datos, instilar gotas de fenilefrina al 10% a temperatura ambiente en cada ojo de todos los ratones que se van a probar.

A continuación, retire el exceso de reactivo y instilar gotas de tropicamida al 0,5% a temperatura ambiente. Aproximadamente cinco minutos antes de la adquisición, inducir anestesia general. Inmediatamente después, administre clorhidrato de oxibuprocaína al 0,4% en cada ojo, dejando la solución en su lugar durante tres segundos para anestesiar e inmovilizar los ojos.

A continuación, retire las gotas y repita la instalación con fenilefrina al 10% y tropicamida al 0,5%. Cuando los ojos estén lo suficientemente dilatados para la toma de imágenes, lubrique los ojos con gotas oftálmicas a base de glicol viscoso para proporcionar hidratación corneal y envuelva al ratón en una hoja de gasa quirúrgica para mantenerlo caliente. Con una esponja o una mecha de algodón, aplique una fina capa de gel oftálmico suplementado con un 0,3% de hipromelosa en cada ojo.

Mientras lo haces, deja las pestañas y los bigotes a un lado. Coloque el ratón en el casete con la cabeza recta y apuntando hacia adelante y coloque con cuidado la barra de mordida en su boca. Coloque un rollo de algodón debajo del costado del animal para el ojo que se está examinando.

Luego, manteniendo el clip en la punta de apuntamiento de la lente específica del mouse, gire el tornillo traductor z en sentido contrario a las agujas del reloj para llevar la lente hacia el ojo. Preajuste la posición del ratón girando y girando el casete y girando la barra de mordida y los tornillos del traductor x hasta que el ojo experimental se posicione para mirar directamente a la lente. Cuando el eje óptico de los ojos y el cristalino estén alineados, seleccione la primera exploración del examen.

Haga clic en comenzar a apuntar y use el tornillo traductor z para mover la retina verticalmente en el panel izquierdo y horizontalmente en el panel derecho. Al girar el casete, mueva la cabeza del nervio óptico hacia arriba o hacia abajo para llevarla al centro del panel derecho. Use el tornillo de la barra de mordida para enderezar la retina dentro del panel derecho y gire el casete para colocar la cabeza del nervio óptico en el centro del panel izquierdo.

A continuación, utilice el tornillo traductor X para nivelar la retina dentro del panel izquierdo y, teniendo en cuenta la función principal de cada modulador, ajuste aún más la posición de la retina para la perfecta centralización en la cabeza del nervio óptico. Cuando la retina esté en posición, haga clic en iniciar instantánea para comenzar la exploración de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral. No olvide guardar el escaneo y el informe.

Ajuste la centralización si es necesario. Una vez finalizado el escaneo, retraiga la lente y coloque el segundo ojo como se acaba de demostrar. Una vez que se haya escaneado el segundo ojo, retire el mouse del casete, aplique un gel oftálmico con 0,3% de hipromelosa en cada ojo y coloque el mouse en una placa calefactora con monitoreo hasta la recuperación completa.

Para centrarse en las células ganglionares de la retina, utilice la macro de la herramienta de retina de resonancia magnética creada para la imagen J.Abra la herramienta de retina de resonancia magnética y modifique la herramienta de selección de polígonos y cargue la imagen de interés. Haga clic en M para comenzar la medición y, a continuación, haga clic en E para ajustar la posición horizontal. Seleccione el primer casete en la ventana del administrador de regiones de interés recién abierta.

Haga clic en el polígono azul y haga clic en los bordes de la capa medida en la imagen para ajustar la posición del primer casete. Seleccione el segundo casete en la ventana del administrador de regiones de interés y ajuste el segundo casete. A continuación, haga clic en R para volver a medir la retina y ver los resultados en la ventana de mediciones.

A pesar de que la calidad de una OCT de dominio espectral no es tan buena como la de una imagen de una sección transversal de la retina, la OCT permite visualizar más capas. Las capas de la retina se miden fácilmente en una OCT y abarcan la fibra nerviosa de la retina en las capas de células ganglionares, la capa nuclear interna, la capa plexiforme externa, la capa nuclear externa, las capas del segmento interno y externo, el epitelio pigmentario de la retina y la coroides, lo que permite un estudio complejo de toda la retina. La medición de la OCT del grosor de la retina acaba de demostrarse, indica que los ratones hembra OPA1 genéticamente mutantes con discapacidad visual exhiben un engrosamiento progresivo del complejo de células ganglionares y de las capas de fibras nerviosas de la retina peripapilar.

Una comparación de la fibra nerviosa de la retina en el grosor de la capa de células ganglionares utilizando calibradores estándar y caseros, demuestra que los calibradores estándar miden un grosor significativamente menor que los calibradores caseros, ya que los calibradores estándar son mucho más gruesos y más difíciles de colocar en un borde de capa delgada. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 15 minutos si se realiza correctamente. Tras su desarrollo, la OCT allanó el camino para que los investigadores del campo de la oftalmología analizaran los cambios estructurales en la retina del ratón.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar y analizar imágenes OCT para las células ganglionares de la retina en ratones.