Nuevos Métodos para Estudiar la Codificación Gustatoria

El objetivo general de estos métodos es estudiar la codificación del gusto en un animal sencillo, mandi-casecsta, mediante el registro de la actividad de múltiples neuronas receptoras in vivo, mientras se administran y monitorean pulsos de sustancias sapídicas con una temporización precisa. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la gustación, como la forma en que los sabores son codificados por poblaciones de neuronas receptoras gustativas. La principal ventaja de esta técnica es que permite realizar grabaciones in vivo de múltiples neuronas gustativas antes, durante y después de la administración precisa de estímulos sapídicos.

Las personas nuevas en este método podrían encontrarlo desafiante porque el procedimiento de disección es complejo. Debido a esto, esperamos que la demostración visual del método sea útil. Estas técnicas fueron desarrolladas por Sam Writer cuando era estudiante de posgrado en mi laboratorio, junto con Alejandra; Kui Sun demostrará estos procedimientos.

Tres días después de la eclosión, elija una polilla de cualquier sexo que tenga un aspecto generalmente saludable. Las alas deben estar completamente extendidas, y la probóscide y las antenas deben estar bien formadas e intactas. En una campana extractora, introduzca la polilla seleccionada en un tubo de sujeción hasta que quede expuesta la cabeza.

Luego, inmovilice la polilla insertando papel de tissue en el otro extremo del tubo. Ahora, utilizando aire comprimido suministrado desde una jeringa, retire el vello de la cabeza expuesta. A continuación, coloque el tubo sobre una plataforma de arcilla en una placa de Petri.

Oriente la cabeza con el lado dorsal hacia arriba. A continuación, proteja las antenas y el probóscide. Primero, haga cubiertas para cada estructura a partir de puntas de pipeta de 200 microlitros cortadas en longitudes de medio centímetro.

Para manipular el probóscide, prepare un gancho a partir de un trozo de alambre. Extienda el probóscide dentro de una de las cubiertas hasta que la parte más proximal del probóscide quede protegida. Fije el tubo a la parte dorsal de la cápsula cefálica utilizando cera batik firme.

A continuación, retire cuidadosamente las antenas y asegure los tubos con cera para batik. Ahora, estabilice el cerebro cortando el músculo compresor del cierre. Bajo el microscopio de disección, use herramientas de microdisección para abrir la cápsula cefálica realizando un pequeño corte justo debajo de la probóscide.

Para confirmar que el músculo ha sido cortado, ofrezca una solución de sacarosa al tercio distal del probóscide y asegúrese durante cinco minutos de que el probóscide no se extienda. Luego, cierre la cápsula cefálica utilizando una capa de cera batik derretida. Para perfundir el cerebro con solución salina, construya una copa de cera alrededor del lado ventral de la cabeza.

Utilizando un aparato eléctrico para cera, comience a formar una copa de cera a lo largo de la parte frontal de la cabeza, avanzando hacia la parte posterior. Mantenga los tubos del probóscide y de las antenas dentro de la copa. Continúe extendiendo la copa hacia afuera y hacia arriba hasta que alcance el nivel de los ojos.

Utilizando pinzas, tome las palpas labiales y fíjelas al vaso de cera mediante cera derretida. A continuación, selle cualquier abertura en el vaso de cera y en los tubos usando una capa fina de epoxi binario. Mezcle el epoxi utilizando un palillo.

Primero, cubra las superficies externa e interna del vaso. Segundo, rellene la parte del tubo de sujeción que rodea el cuello para que la cabeza quede más firmemente sujeta. Después de 20 minutos, revise el vaso en busca de fugas.

Para comenzar la cirugía cerebral, primero corte los palpos labiales. Para abrir el lado ventral de la cápsula cefálica, corte la cutícula a lo largo de la parte posterior y anterior de la cabeza y alrededor de los ojos. Luego, corte a lo largo de la parte posterior de la cabeza y realice más cortes a lo largo de la parte anterior de la cabeza cerca del probóscide.

Luego, levante suavemente la solapa de la cutícula con pinzas para exponer el cerebro. Ahora, realice el paso más crítico: exponer la ZSE y los nervios maxilares. Retire lentamente y con cuidado el tejido adiposo y la tráquea.

Lave el cerebro frecuentemente con solución salina fresca. Tenga mucho cuidado, porque es muy fácil aplastar los nervios maxilares. Cuando finalmente sean visibles la ZES y los nervios maxilares, estarán cubiertos por una fina vaina.

Para eliminar esta vaina, drene cualquier exceso de solución salina y luego debilite la vaina aplicando una solución de colagenasa-dispasa al 10 %. Después de remojar durante cinco minutos, enjuague la solución varias veces con solución salina. A continuación, tras varios enjuagues con solución salina, retire suavemente la vaina utilizando pinzas de microdisección ultrafinas.

Por último, asegure una línea de goteo salino en la copa de perfusión. Esta sección describe cómo construir y utilizar un sistema de administración de sustancias sapídicas. El sistema consta de un tubo de prueba con varias aberturas.

Las aberturas permiten la entrada del proboscis del animal, el múltiplo de sustancias de sabor, un sensor de color y permiten el flujo de agua. Para construir este sistema, primero prepare un tubo de prueba para el proboscis. Haga un orificio del tamaño del proboscis utilizando un soldador.

Luego, construya una sección tamizada dentro del tubo para mantener la probóscide en su lugar. Corte cinco milímetros por encima del orificio, coloque la malla allí con cera y reconecte los tubos utilizando cera y epóxico. Utilice un sistema de perfusión presurizado para entregar los sustancias gustativas.

Conecte tantos tubos de estímulo gustativo como sean necesarios a un múltiple. Para conectar el tubo de salida del estímulo gustativo, haga un orificio aproximadamente un centímetro por encima de la malla y luego asegure el tubo de salida con epoxi. En cada estímulo gustativo, incluya un colorante artificial que pueda ser detectado por un sensor de color.

Sujete un sensor de color al aparato en un orificio a medio centímetro por encima de la malla y fíjelo en su lugar utilizando epoxi. Utilice una bomba peristáltica para suministrar agua destilada al sistema mediante tubos de silicona. Recopile el agua residual en un recipiente grande.

Utilice una bomba neumática para administrar los sustancias sapídicas con ráfagas de aire. Ahora, comience a bombear agua limpia a través del tubo y administre pulsos de sustancia sapídica para probar el sensor de color. A continuación, cargue los dos tercios destilados del probóscide de la polilla en el tubo de prueba.

Con ayuda de pinzas, extienda la probóscide y empuje suavemente dentro del orificio. A continuación, selle la probóscide en su lugar con cera dental blanda y una capa de epóxico. Ahora, conecte la línea de perfusión salina y ajuste el flujo de perfusión.

Luego, sumerja el electrodo de tierra del tetrodo de alambre trenzado en el baño de solución salina. A continuación, utilizando un micromanipulador, coloque el tetrodo junto al nervio maxilar y avance lentamente dentro del nervio. Después de detectar señales de potenciales de acción, deje que la preparación se estabilice durante al menos 10 minutos antes de comenzar las grabaciones.

Se realizaron grabaciones de neuronas sensoriales del gusto antes, durante y después de la administración del gustante utilizando el protocolo descrito. El inicio y finalización de un pulso de un segundo de cada sustancia gustativa se monitorearon mediante el sensor de color. Los compuestos gustativos provocaron picos que fueron detectados por cada uno de los cuatro canales.

Dentro de las series de potenciales de acción, se pudieron observar potenciales de acción individuales. Se utilizó un software de clasificación de picos para asignar estos picos a neuronas únicas. La respuesta de tres neuronas receptoras gustativas diferentes a seis sustancias con sabor administradas en secuencia revela diferentes niveles de actividad basal y selectividad hacia las sustancias con sabor.

Además, las respuestas tenían diferentes tiempos. Algunas están sincronizadas con la duración del estímulo, mientras que otras persisten más allá del estímulo. También se podían realizar grabaciones intracelulares de los axones de los receptores del gusto utilizando electrodos de vidrio afilados convencionales.

Los registros intracelulares fueron muy similares a las respuestas observadas mediante la técnica de tetrodo descrita, pero los registros con tetrodo fueron más fáciles de realizar, tuvieron mayor duración y fueron más robustos. Después de ver este video, usted debería ser capaz de exponer los nervios maxilares y la zona subesofágica en mandi-casecsta, y poder construir un sistema de entrega de sustancias sapidas con control temporal preciso. Al realizar este protocolo, use guantes de seguridad de laboratorio y una mascarilla facial, ya que el polvo fino en escamas que desprende mandi-casecsta puede ser alergénico.

Una vez dominado, este procedimiento puede completarse en tres horas y media. Tras seguir este procedimiento, también se pueden realizar grabaciones simultáneas de múltiples áreas cerebrales para responder preguntas adicionales, como, cómo se transforman las respuestas de las neuronas receptoras del gusto a los sustancias sapídicas cuando se transmiten a las neuronas diana postsinápticas.