Nuevos Métodos para Estudiar la Codificación Gustatoria

El objetivo general de estos métodos es estudiar la codificación gustativa en un animal simple mediante el registro de la actividad de múltiples neuronas receptoras in vivo, mientras se administran y monitorean pulsos de sabores cronometrados con precisión. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la sabor, como la forma en que las poblaciones de neuronas receptoras gustativas codifican los catadores. La principal ventaja de esta técnica es que permite el registro in vivo de múltiples neuronas gustativas antes, durante y después de estímulos gustativos administrados con precisión.

Las personas nuevas en este método pueden encontrarlo desafiante porque el procedimiento de disección es intrincado. Debido a esto, esperamos que la demostración visual del método sea útil. Estas técnicas fueron desarrolladas por Sam Writer cuando era estudiante de posgrado en mi laboratorio, junto con Alejandra, Kui Sun demostrará estos procedimientos.

Tres días después de la eclosión, elija una polilla de cualquiera de los sexos que tenga una apariencia generalmente saludable. Las alas deben estar completamente extendidas, y la probóscide y las antenas deben estar bien formadas e intactas. En una campana extractora, inserte la polilla seleccionada en un tubo de restricción hasta que la cabeza quede expuesta.

Luego, inmoviliza la polilla insertando papel de seda en el otro extremo del tubo. Ahora, usando aire presurizado suministrado por una jeringa, retire el cabello de la cabeza expuesta. Luego, coloque el tubo en una plataforma de arcilla en una placa de Petri.

Orienta la cabeza con el lado dorsal hacia arriba. A continuación, proteja las antenas y la probóscide. En primer lugar, haga cubiertas para cada estructura con puntas de pipeta de 200 microlitros cortadas en longitudes de medio centímetro.

Para manipular la probóscide, prepare un gancho con un trozo de alambre. Extienda la probóscide en una de las cubiertas hasta que la parte más proximal de la probóscide esté protegida. Asegure el tubo a la parte dorsal de la cápsula de la cabeza con cera batik firme.

A continuación, cubra con cuidado las antenas y asegure los tubos con cera batik. Ahora, estabilice el cerebro cortando el músculo del compresor de la hebilla. Bajo el microscopio de disección, use herramientas de microdisección para abrir la cápsula de la cabeza haciendo un pequeño corte justo debajo de la probóscide.

Para confirmar que el músculo está cortado, ofrezca solución de sacarosa a los dos tercios distales de la probóscide y durante cinco minutos asegúrese de que la probóscide no se extienda. Luego, cierre la cápsula de la cabeza con una capa de cera de batik derretida. Para perfundir el cerebro con solución salina, construya una copa de cera alrededor del lado ventral de la cabeza.

Con una cerera eléctrica, comienza a construir una taza de cera a lo largo de la parte delantera de la cabeza moviéndola hacia atrás. Mantenga los tubos de probóscide y antenas dentro de la copa. Continúa construyendo la copa hacia afuera y hacia arriba hasta que llegue al nivel de los ojos.

Con fórceps, tome los palpos labiales y únalos a la copa de cera con cera derretida. A continuación, selle las aberturas de la taza de cera y los tubos con una capa de epoxi binario. Mezcla el epoxi con un palillo.

Primero, cubra las superficies exterior e interior de la taza. En segundo lugar, llene la parte del tubo de sujeción que rodea el cuello para que la cabeza se sostenga con más firmeza. Después de 20 minutos, revise la copa en busca de fugas.

Para comenzar la cirugía cerebral, primero corte los palpos labiales. Para abrir el lado ventral de la cápsula de la cabeza, corte la cutícula a lo largo de la parte posterior y delantera de la cabeza y alrededor de los ojos. Luego, corta a lo largo de la parte posterior de la cabeza y haz más cortes a lo largo de la parte delantera de la cabeza cerca de la probóscide.

Luego, levante suavemente el colgajo de la cutícula con pinzas para exponer el cerebro. Ahora, realice el paso más crítico, exponiendo la ZEE y los nervios maxilares. Retire lenta y cuidadosamente el tejido graso y la tráquea.

Enjuague el cerebro frecuentemente con solución salina fresca. Hay que tener mucho cuidado, porque es muy fácil aplastar los nervios maxilares. Cuando la ZEE y los nervios maxilares sean finalmente visibles, estarán cubiertos por una vaina delgada.

Para eliminar esta vaina, drene el exceso de solución salina y luego debilite la vaina aplicando una solución de colagenasa dispasa al 10%. Después de remojar durante cinco minutos, enjuague la solución varias veces con solución salina. A continuación, después de varios enjuagues con solución salina, retire suavemente la vaina con pinzas de microdisección superfinas.

Por último, asegure una línea de goteo de solución salina en la copa de perfusión. En esta sección se describe cómo crear y utilizar un sistema de entrega de tastas. El sistema consta de un tubo de ensayo con varias aberturas.

Las aberturas proporcionan entrada para la probóscide del animal, el colector de degustantes, un sensor de color, y permiten el paso de la flor a través del agua. Para construir este sistema, primero prepare un tubo de ensayo para la probóscide. Haz un agujero del tamaño de una probóscide con un soldador.

Luego, construya una sección apantallada dentro del tubo para mantener la probóscide en su lugar. Corta cinco milímetros por encima del agujero, coloca la malla allí con cera y vuelve a conectar los tubos con cera y epoxi. Utilice un sistema de perfusión presurizado para administrar los degustantes.

Une tantos tubos de sabor como sea necesario a un colector. Para conectar el tubo de salida tastant, haga un orificio de aproximadamente un centímetro por encima de la malla, luego asegure el tubo de salida con epoxi. En cada degustación, incluya un tinte artificial para que sea detectado por un sensor de color.

Conecte un sensor de color al aparato en un orificio de medio centímetro alrededor de la malla y asegúrelo allí con epoxi. Utilice una bomba peristáltica para suministrar agua destilada al sistema a través de tubos de silicona. Recoja las aguas residuales con un recipiente grande.

Utilice una bomba neumática para administrar los degustantes con bocanadas de aire. Ahora, comience a bombear agua limpia a través de la tubería y entregue pulsos de sabor para probar el sensor de color. Ahora, cargue los dos tercios de la probóscide de la polilla en el tubo de ensayo.

Con pinzas, extienda la probóscide y empújela suavemente en el orificio. Luego, selle la probóscide en su lugar con cera dental suave y una capa de epoxi. Ahora, conecte la línea de perfusión salina y configure el flujo de perfusión.

A continuación, sumerja el electrodo de tierra del tetrodo de alambre retorcido en el baño salino. Luego, usando un micromanipulador, coloque el tetrodo junto al nervio maxilar y hágalo avanzar lentamente hacia el nervio. Después de detectar señales de picos, deje que la preparación se estabilice durante al menos 10 minutos antes de realizar grabaciones.

Los registros se realizaron a partir de neuronas receptoras gustativas antes, durante y después del parto de cata utilizando el protocolo descrito. El sensor de color monitoreó el inicio y el desplazamiento de un pulso de un segundo de cada sabor. Los catadores provocaron picos que fueron detectados por cada uno de los cuatro canales.

Dentro de los trenes de picos, se pudieron observar potenciales de acción individuales. Se utilizó un software de clasificación de picos para asignar estos picos a neuronas únicas. La respuesta de tres neuronas receptoras gustativas diferentes a seis tasantes administrados en secuencia revela diferentes niveles de actividad basal y selectividad a los tasantes.

Además, las respuestas tuvieron diferentes horarios. Algunos están limitados a la duración del estímulo, mientras que otros duran más que el estímulo. Los registros intracelulares también podrían realizarse a partir de axones receptores gustativos utilizando electrodos de vidrio afilados convencionales.

Los registros intracelulares fueron muy similares a las respuestas observadas con la técnica de tetrodo descrita, pero los registros de tetrodo fueron más fáciles de hacer, más duraderos y más robustos. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de exponer los nervios maxilares y la zona subesófaga en mandi-casecsta, y ser capaz de construir un sistema de entrega sabroso con un control temporal preciso. Mientras realiza este protocolo, use guantes de seguridad de laboratorio y una mascarilla porque las escamas finas y polvorientas que desprende mandi-casecsta pueden ser alergénicas.

Una vez dominado, este procedimiento se puede completar en tres horas y media. Siguiendo este procedimiento, también se pueden realizar grabaciones simultáneas de múltiples áreas del cerebro para responder preguntas adicionales, como por ejemplo, cómo se transforman las respuestas de las neuronas receptoras gustativas a los saborantes cuando se transmiten a las neuronas diana postsinápticas.