PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

El objetivo general del ensayo PIP-on-a-chip es evaluar las interacciones entre la membrana de las proteínas de forma cuantitativa y sin marcadores. Las interacciones proteína-membrana son el corazón de muchos procesos de la célula y sus patógenos, pero las técnicas para estudiar estas interacciones son pocas. Las ventajas de esta técnica son el bajo volumen simple, la ausencia de requisitos de marcaje de ligandos o receptores combinados con la capacidad de probar las interacciones de la membrana de una manera fisiológicamente relevante.

Muchos objetivos terapéuticos de los virus son proteínas de membrana, los estudios de estas proteínas diana a menudo se realizan en solución utilizando detergentes. Nuestra técnica proporciona una alternativa biológicamente más relevante. Si bien verá que este ensayo es capaz de monitorear las interacciones de las proteínas con las membranas, en realidad es un ensayo bastante versátil y se puede usar para monitorear las interacciones de la membrana de hierro, la membrana de moléculas pequeñas e incluso las interacciones de la membrana peptídica.

Para empezar, mezcle el prepolímero de polidimetilsiloxano o PDMS y el agente de curado en una proporción de 10:1, en un gran recipiente de pesaje de plástico. Desgasifique la mezcla en el vacío durante una hora con una intensidad de vacío de 500 tor o menos. Coloque el maestro de silicio que contiene múltiples réplicas del mismo micropatrón SU8 en un gran bote de pesaje de plástico y vierta el PDMS de desgasificación, luego cúrelo en un horno seco a 60 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, retire suavemente el PDMS del maestro de silicona con las manos. Marque los límites de cada micro patrón en rectángulos con un bisturí quirúrgico y una regla. A continuación, corte el PDMS en bloques, perfore 16 agujeros en ambos extremos de cada microcanal con un punzón de biopsia, para hacer agujeros de 1,0 milímetros de diámetro.

Pipeteó volúmenes calculados de fosfatidilcolina, fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato y sonda fluorescente sensible al pH en un solo vial de ventilación de vidrio de 20 mililitros. Seque la mezcla en un chorro de gas nitrógeno dentro de la campana de gases químicos durante 10 minutos o hasta que el solvente se evapore y se forme una fina película lipídica en el fondo del vial. A continuación, desecar la mezcla al vacío durante al menos tres horas con una resistencia al vacío de 10 milímetros para eliminar cualquier disolvente orgánico residual.

Rehidrate la película lipídica seca con cinco mililitros de tampón corriente, coloque el lípido rehidratado en un baño ultrasónico a una frecuencia de funcionamiento de 35 kilohercios durante 30 minutos a temperatura ambiente. Congele, descongele la suspensión de vesículas con nitrógeno líquido y el baño de agua a 40 grados centígrados para obtener vesículas unilaminares. Repita la congelación y descongelación 10 veces, extruya la suspensión de vesículas a una membrana de policarbonato de borde de pista de 0,1 micras, utilizando un extrusor de lípidos para enriquecer pequeñas vesículas unilaminares.

Repita la extrusión 10 veces. Pruebe las entradas y salidas del bloque PDMS en busca de obstrucciones rociando agua desionizada a través de los orificios con una botella de lavado con agua, luego seque el bloque PDMS con gas nitrógeno. A continuación, coloque el bloque PDMS y el cubreobjetos prelimpiados dentro de la cámara de muestras del sistema de plasma de oxígeno.

Exponga el bloque PDMS y el cubreobjetos con plasma de oxígeno durante 45 segundos con los ajustes de potencia a 75 vatios, la velocidad del flujo de oxígeno a 10 centímetros cúbicos por minuto y la fuerza de vacío de 200 milímetros. A continuación, coloque la superficie del patrón del bloque PDMS en contacto con el cubreobjetos inmediatamente después del tratamiento con plasma de oxígeno. Presione suavemente para eliminar las burbujas de aire en los sitios de contacto.

Coloque el dispositivo en una placa calefactora nivelada a 100 grados centígrados durante tres minutos para mejorar la unión. Use una toallita húmeda sin pelusa con etanol al 100% para eliminar cualquier partícula de polvo de la parte superior e inferior del dispositivo. Luego, pegue el dispositivo en la parte superior de un portaobjetos de microscopio de vidrio.

Transfiera 100 microlitros de fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato que contiene pequeñas vesículas unilaminares a un tubo de microcentrífuga de 0,65 mililitros. Ajuste el pH de la solución a aproximadamente 3/2 añadiendo 6,4 microlitros de ácido clorhídrico normal 0,2. Pipetear 10 microlitros de la solución de vesícula unilaminar pequeña con pH ajustado en cada canal a través de la entrada y aplicar presión a través de la pipeta hasta que la solución llegue a la salida.

Separe la punta de la pipeta y déjela unida al dispositivo. Después de repetir este paso para cada canal, incubar el dispositivo durante 10 minutos a temperatura ambiente, la inyección de vesículas en microcanales debe realizarse inmediatamente después del montaje del dispositivo. Mientras tanto, corte conjuntos de tubos de entrada y salida, con pinzas, conecte el juego de tubos de salida al dispositivo y luego pegue el dispositivo con cinta adhesiva en una platina de microscopio.

Sumerja un extremo del juego de tubos de entrada en 25 mililitros de tampón de funcionamiento contenido en un tubo cónico y péguelo con cinta adhesiva para asegurarse de que el tubo esté asegurado. Con un conector de laboratorio, coloque el tubo cónico en un terreno más alto que el dispositivo para empujar la solución a través de los microcanales a través del flujo por gravedad. Para cada tubo de entrada, use una jeringa para extraer un mililitro de tampón de funcionamiento del extremo libre del tubo.

Retire la punta de la pipeta de la entrada e inserte el extremo libre del tubo de entrada en el dispositivo. Repita este proceso para conectar todas las piezas del tubo de entrada al dispositivo. El flujo de tampón de rodadura a través de los canales ayuda a eliminar el exceso de vesículas no rotas y a equilibrar la bicapa para las condiciones experimentales.

A continuación, abra el software de control del microscopio. En el panel izquierdo, haga clic en la pestaña del microscopio y elija el objetivo 10x. Haga clic en vivo y luego en los íconos de imagen de Alexa 568 en la barra de herramientas, usando las perillas de ajuste fino y grueso, concéntrese en los micro canales.

Escanee el dispositivo para comprobar la calidad de los SLB y los canales. A continuación, haz clic en el icono de imagen cerrada del obturador FL en la barra de herramientas, haz clic en la pestaña de adquisición y, en Ajustes básicos, selecciona el tiempo de exposición. Ajusta el tiempo de exposición a 200 milisegundos.

En el panel izquierdo, haga clic en adquisición multidimensional. En el menú de filtros, seleccione el canal rojo. Luego, haga clic en el menú de lapso de tiempo, establezca el intervalo de tiempo en cinco minutos, la duración en 30 minutos y el menú de lapso.

Seleccione la herramienta de círculo en la pestaña de medición y dibuje un círculo en cualquier canal. Haga clic con el botón derecho mientras el círculo está seleccionado y elija propiedades. En la pestaña de perfil, marque todas las T para ver la intensidad de fluorescencia en función del tiempo.

Asegúrese de que esta curva alcance una meseta que indique equilibrio antes de continuar con el siguiente paso, baje la solución tampón a un suelo igual al del dispositivo, para detener el flujo. Uno a la vez, separe cada tubo de salida y aplique 200 microlitros de cada dilución de proteína en el canal de salida con una pipeta. No apliques ninguna presión, deja que la gravedad haga el trabajo.

Separe la punta de la pipeta y déjela unida al dispositivo microfluídico. Repita este proceso para cada canal y asegúrese de que no se introduzcan burbujas de aire en los canales durante este proceso. A continuación, baje el tubo de entrada a una tierra debajo del dispositivo microfluídico para comenzar a fluir la proteína a través de los microcanales.

Pega con cinta adhesiva el extremo libre del tubo a un contenedor de residuos. Fluir las diluciones del dominio de homología de pleckstrin durante 30 minutos. En el panel izquierdo del software, en la pestaña de lapso de tiempo, haga clic en iniciar para comenzar a tomar imágenes nuevamente.

Aquí se muestra una vista representativa del fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato que contiene SLB dentro de los microcanales. Antes, y después, de añadir el dominio de homología de pleckstrin a las concentraciones indicadas. Las intensidades de fluorescencia de la línea escaneada a través de microcanales se trazan en función de la distancia y los píxeles para los experimentos de unión a fosfatidilcolina, fosfatidilinositol 4 fosfato y fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato.

A continuación, se normalizan los datos de unión de los experimentos individuales, se trazan en función de la concentración del dominio de homología de la fosfolipasa C delta 1 pleckstrin y se ajustan a un isotérmino de unión para extraer las constantes de asociación aparentes. La comparación de las constantes de asociación aparentes muestra que el dominio de homología de la fosfolipasa C Delta 1 pleckstrin interactúa con el fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato específicamente, como se esperaba. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer pequeñas vesículas unilaminares, hacer dispositivos microfluídicos, formar bicapas lipídicas soportadas dentro de estos dispositivos microfluídicos, como sus interacciones de unión a la membrana de proteínas, utilizando este ensayo con nuestro enfoque PIP-on-a-chip.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo, para evaluar el efecto de la unión de la membrana de proteínas en la difusión lateral de los lípidos. Esta técnica allana el camino para estudiar las interacciones de la membrana de las proteínas con el conjunto de lípidos que se encuentran en las células en lugar de uno a la vez, por lo que este enfoque tendrá un gran impacto en la bioquímica y la biología celular de las interacciones entre las proteínas y la membrana.