Name: PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende a evaluar interacciones proteína-membrana cuantitativamente sin etiquetado usando el ensayo PIP-on-a-chip. Este método microfluídico ofrece una alternativa biológicamente relevante para estudiar proteínas diana terapéuticas.

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DS y CEC fueron apoyados, en parte, por la concesión AI053531 (NIAID, NIH); SS y PSC fueron apoyados por la subvención N00014-14-1-0792 (ONR).

Los autores no tienen nada que revelar.

Cada variante PIP, aunque a bajas concentraciones, está presente en la superficie citosólica de organelos específicos donde contribuyen al establecimiento de una composición física única y especificidad funcional de la membrana organelar 1 . Uno de los usos más importantes de los PIPs es como una plataforma de acoplamiento específica para la multitud de proteínas que requieren localización subcelular específica y / o la activación [ 6 , 7]</sup...

Las innumerables interacciones y procesos bioquímicos tienen lugar en superficies de membrana fluidas bidimensionales. Los organelos cerrados con membrana en células eucariotas son únicos no sólo en los procesos bioquímicos y su proteoma asociado, sino también en su composición lipídica. Una clase excepcional de fosfolípidos es phosphoinositides (PIPs). Aunque constituyen sólo el 1% del lipidoma celular, desempeñan un papel crucial en la transducción de señales, autofagia y tráfico de membranas, entre otros 1 , 2 , 3 , 4 . La fosforilación dinámica del grupo cabeza de inositol por quinasas PIP celular da lugar a siete grupos de cabeza PIP que son mono-, bis- o tris-fosforilados 5 . Adicionalmente, los PIPs definen la identidad subcelular de las membranas y sirven como sitios de acoplamiento de membrana especializados para proteínas / enzimas que contienen uno o más fosfoinosPor ejemplo, Homología de Pleckstrin (PH), Homología de Phox (PX), y Homología N-terminal de epsina (ENTH) 6 , 7 . Uno de los dominios mejor estudiados de unión PIP-es fosfolipasa C (PLC) dominio PH -δ1 que interactúa específicamente con fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) dentro de una alta afinidad rango micromolar nanomolar bajo 8 , 9 , 10 , 11 . Se han desarrollado una variedad de métodos cualitativos y cuantitativos in vitro para estudiar el mecanismo, la termodinámica y la especificidad de estas interacciones. Entre los ensayos de unión a PIP más comúnmente utilizados están la resonancia de plasmón de superficie (SPR), la calorimetría isotérmica (ITC), la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR), el ensayo de flotación / sedimentación de liposomas y las transferencias lipídicas (tiras de grasa / PIP)12 , 13 . A pesar de que se utilizan ampliamente, todos ellos tienen muchas desventajas. Por ejemplo, SPR, ITC y RMN requieren grandes cantidades de muestra, instrumentación costosa y / o personal capacitado 12 , 13 . Algunos formatos de ensayo tales como las transferencias lipídicas basadas en anticuerpos utilizan formas de PIP solubles en agua y las presentan de una manera no fisiológica 12 , 14 , 15 , 16 . Además, las transferencias de lípidos no se pueden cuantificar de forma fiable y con frecuencia han dado lugar a falsas observaciones positivas / negativas 12 , 17 , 18 . Para superar estos desafíos y mejorar el conjunto actual de herramientas, se estableció un nuevo método libre de etiquetas basado en una bicapa lipídica soportada (SLB) en el contexto de am<html> Icrofluidic plataforma, que se aplicó con éxito al estudio de la proteína-PIP interacciones ( Figura 1 ] [ 19] . La estrategia empleada para detectar las interacciones proteína-PIP se basa en la detección de la modulación del pH. Esto implica un colorante sensible al pH que tiene orto -Sulforhodamine B (o SRB) directamente conjugado con grupo de cabeza fosfatidiletanolamina lípidos 20. La sonda o SRB-POPE (Figura 2A) es altamente fluorescente a pH bajo y se inactivó a pH alto con un pKa en torno a 6,7 dentro de 7,5% en moles de PI (4,5) P 2 SLB que contiene (figura 5B). Dominio PH PLC-δ1 se ha utilizado ampliamente para la validación de metodologías proteína-PIP-de unión debido a su alta especificidad hacia PI (4,5) P 2 (Figura 5A) 21, 22,&quot;&gt; 23, 24, 25 .Hence, razonó que el dominio PLC-δ1 PH se puede utilizar para poner a prueba su unión a PI (4,5) P 2 a través del ensayo de PIP-on-a-chip. El dominio PH constructo Utilizado en este estudio tiene una carga positiva neta (pI 8.4), y por lo tanto atrae a OH - iones ( Figura 5C ). Al unirse a PI (4,5) P 2 -contiene SLBs, el dominio PH lleva a OH - superficie de la membrana, que a su vez modula el potencial interfacial y desplaza el estado de protonación de O SRB-POPE (Figura 5C) 26. en función de la concentración de dominio PH, la fluorescencia se inactiva (figura 6A). por último, la transmisión de datos normalizada es ajustarse a una isoterma de unión para determinar la afinidad de la interacción PH dominio-PI (4,5) P 2 (Figura 6B, 6C). &lt;Pabellón En este estudio, se proporciona un protocolo detallado para realizar la unión de proteínas a PIB que contienen SLBs dentro de una plataforma microfluídica. Este protocolo lleva al lector a ensamblar el dispositivo microfluídico y la preparación de la vesícula a la formación de SLB y la unión a proteínas. Además, las direcciones para el análisis de datos para extraer información afinidad por el PLC-δ1 PH dominio de PI (4,5) la interacción P 2 se proporcionan.

<table><tbody><tr><td><cubreobjetos > fuerte</cubreobjetos ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>vidrio resistente: Rectángulos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, n.º 1 1/2; Vidrio de borosilicato</td></tr><tr><td>7X Solución de limpieza</td><td>MP Biomedicals</td><td>976670</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>PYREX Plato cristalizante</td><td>Corning</td><td>3140-190</td><td>Plato de vidrio de borosilicato con fondo plano; Diámetro x Altura (190 x 100 mm); Distribuidor: VWR (89090-700)</td></tr><tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>Paragon Industries</td><td>SC-2</td><td>Horno</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>PDMS</td>Sylgard 184 Kit de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elastómeros de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polidimetilsiloxano (PDMS); Distribuidor: Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>PYREX Deseccator</td><td>VWR</td><td>89134-402</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia</td> con clasificación al vacío <td>Harris</td><td>15110-10</td><td>Harris Uni-Core; 1,0 mm de diámetro; Punzón de biopsia Miltex con émbolo (Cat. Nº 15110-10) se puede utilizar como alternativa</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Dispositivo</fuerte>Sistema de limpieza de</td> plasma Bomba de vacío de aceite de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> accionamiento directo de 2 etapas <td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>, Servicio de O2 (Krytox Charged)</td></tr><tr><td>Placa calefactora digital</td><td>Benchmark</td><td>H3760-H</td><td>Comprado a través de Denville Scientific (Cat. Nº 1005640)</td></tr><tr><td>Microportaobjetos esmerilados</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>esmerilados, seleccionados y prelimpios; Hecho de vidrio suizo; Grosor: 1 mm; Dimensiones: 75 x 25 mm; GR 144</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>v.2016</td><td>Software de dibujo para el diseño de fotomáscaras</td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services</td><td>N/A</td><td>El diseño con fondo negro y características claras se imprimió con una resolución de 20k ppp en una máscara transparente (5 x 7 pulgadas) por CAD/Art</td></tr><tr><td>Services Obleas de silicona</td><td>University Wafer</td><td>1575</td> Prime <td>Grade, pulido por un solo lado; 100 mm (4 pulgadas) de diámetro; 525 mmm de espesor</td></tr><tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>tono negativo fotorresistente; Instalación de nanofabricación de Penn State Propiedad</td></tr><tr><td>SU-8 Desarrollador</td><td>: MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Penn State Nanofabrication Facility Propiedad</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4-fosfato</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>850757C</td><td>POPE; Necesario para la síntesis de oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Lissamina Cloruro de rodamina B sulfonilo (isómeros mixtos)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td><td>Necesario para la síntesis de oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Sonda lipídica fluorescente sensible al pH (oSRB-POPE)</td>Síntesis <td>interna</td><td>de N/A</td> interna <td>(Huang D. et al. 2013)</td></tr><tr><td>Vial de centelleo de vidrio</td><td>VWR</td><td>66022-065 Capacidad de</td><td>volumen de 20 ml</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>MEMBRANAS ULTRASÓNICAS DE GRABADO</td></tr> CON <tr><td>HUELLAS DE NUCLEPOROS</td><td>membrana</td> de policarbonato Whatman <td>110605</td><td>; Diámetro: 25 mm; Tamaño de poro: 0,1 mmm; Distribuidor: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td><td>Extrusora LIPEX de grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL Extrusora de termobarril</td></tr><tr><td>Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td>Dispersión dinámica de la luz; Instalación de cristalografía de rayos X de Penn State Propiedad</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte</td><td>><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Análisis de datos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma</td><td>Software GraphPad</td><td>v.6</td><td>Software de ajuste de curvas para el análisis de datos</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M</td><td>Microscopio Carl Zeiss Microscopía</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cámara AxioCam MRm</td><td>Carl Zeiss Microscopía Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Cámara</td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>N/A</td><td>Fuente de luz</td></tr><tr><td>Alexa 568 Juego de filtros</td><td>Carl Zeiss Microscopía</td><td>N/A</td><td>Ex/Em 576/603 nm</td></tr><tr><td>Software AxioVision LE64 v.4.9.1.0</td><td>Carl Zeiss Microscopía</td><td>N/A</td><td>Software de procesamiento</td></tr> <tr><td>de imágenesName</td><td>Company</td><td> Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Otros</puntas > fuertes</td> VWR 10034-132 Puntas de pipeta <td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td></td><td></td><td></td><td>200 uL; Punta fina y lisa para aplicar la solución de proteínas en el canal microfluídico</td></tr><tr><td>Puntas</td><td>VWR</td><td>53509-070</td><td>Puntas de pipeta de 10 uL; Punta fina y lisa para aplicar la solución de vesícula en el canal microfluídico</td></tr><tr><td>Medidor de pH Orion Star A321</td> Medidor de pH <td>Thermo Scientific</td><td>STARA3210</td><td>Sonda</td></tr> de <tr><td>pH Orion Micro sonda de pH Thermo</td><td>Scientific</td><td>8220BNWP</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico)</td><td>VWR</td><td></td><td>VWRB30487 HEPES,</td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td> ácido libre <td>VWR</td><td>BDH8014-2.5KGR</td> Tubería <td>de NaCl</td></tr><tr><td></td><td>Alambre Aliado & Cable</td><td>TFT-200-24 N</td><td>Diámetro interno: 0,020-0,026 pulgadas (0,051-0,066 cm); Espesor de la pared: 0,010 pulgadas (0,025 cm); Tubo flexible de pared delgada de politetrafluoroetileno; Color Natural</td></tr><tr><td>Nitrógeno Gaso -</td><td>Industrial Praxair</td><td>N/A</td><td>Proveedor Local</td></tr><tr><td>Oxígeno Gaso - Industrial</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Proveedor Local</td></tr><tr><td>Nitrógeno Líquido</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Proveedor Local</td></tr></tbody></table>

pip-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerosas proteínas celulares interactúan con las superficies de la membrana para afectar los procesos celulares esenciales. Estas interacciones pueden dirigirse hacia un componente lipídico específico dentro de una membrana, como en el caso de fosfoinositidos (PIP), para asegurar una localización y / o activación subcelular específica. Los PIP y los dominios celulares de unión a PIP se han estudiado ampliamente para comprender mejor su papel en la fisiología celular. Se aplicó un ensayo de modulación del pH en bicapas lipídicas (SLB) como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-PIP. En estos estudios, se usó fosfatidiletanolamina conjugada con orto- sulforeamina B sensible al pH para detectar interacciones proteína-PIP. Tras la unión de una proteína a una superficie de membrana que contiene PIP, se modula el potencial interfacial ( es decir, cambio en el pH local), desplazando el estado de protonación de la sonda. Se presenta un estudio de caso del uso exitoso del ensayo de modulación del pH usando fosfolipasa C delta1 Pleckstren la homología (PH PLC-δ1) dominio y fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) la interacción como un ejemplo. La aparente constante de disociación ( K d, app ) para esta interacción fue 0,39 ± 0,05 μ M, similar a K d, app valores obtenidos por otros. Como se observó anteriormente, el dominio PH PLC-δ1 es PI (4,5) P 2 específico, muestra unión más débil hacia fosfatidilinositol 4-fosfato, y no se une a SLB de fosfatidilcolina pura. El ensayo de PIP sobre un chip es ventajoso con respecto a los ensayos de unión a PIP tradicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, bajo volumen de muestra y sin requisitos de marcado de ligando / receptor, la capacidad de probar interacciones de membrana de alta y baja afinidad con Grandes moléculas, y una relación señal / ruido mejorada. En consecuencia, el uso del enfoque PIP-on-a-chip facilitará la elucidación de mecanismos de una amplia gama de interacciones de membrana. Además, este método podría ser uEn la identificación de terapéuticos que modulan la capacidad de la proteína para interactuar con las membranas.

Se utilizó el ensayo de modulación del pH para estudiar la PLC-δ1 dominio PH-PI (4,5) P 2 interacción dentro de un PIP-on-a-chip microdevice ( Figura 1 ]. A través de un protocolo detallado, hemos demostrado cómo preparar y ensamblar los componentes del dispositivo microfluídico, hacer pequeñas vesículas unilamelares (SUVs) ( Figura 2 ), forma SLBs dentro de un dispositivo ( Figura 3 ], y...

Aquí presentamos una bicapa lipídica soportada en el contexto de una plataforma microfluídica para estudiar las interacciones proteína-fosfoinositido utilizando un método libre de etiquetas basado en la modulación del pH.

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

El objetivo general del ensayo PIP-on-a-chip es evaluar las interacciones entre la membrana de las proteínas de forma cuantitativa y sin marcadores. Las interacciones proteína-membrana son el corazón de muchos procesos de la célula y sus patógenos, pero las técnicas para estudiar estas interacciones son pocas. Las ventajas de esta técnica son el bajo volumen simple, la ausencia de requisitos de marcaje de ligandos o receptores combinados con la capacidad de probar las interacciones de la membrana de una manera fisiológicamente relevante.Muchos objetivos terapéuticos de los virus son proteínas de membrana, los estudios de estas proteínas diana a menudo se realizan en solución utilizando detergentes. Nuestra técnica proporciona una alternativa biológicamente más relevante. Si bien verá que este ensayo es capaz de monitorear las interacciones de las proteínas con las membranas, en realidad es un ensayo bastante versátil y se puede usar para monitorear las interacciones de la membrana de hierro, la membrana de moléculas pequeñas e incluso las interacciones de la membrana peptídica.Para empezar, mezcle el prepolímero de polidimetilsiloxano o PDMS y el agente de curado en una proporción de 10:1, en un gran recipiente de pesaje de plástico. Desgasifique la mezcla en el vacío durante una hora con una intensidad de vacío de 500 tor o menos. Coloque el maestro de silicio que contiene múltiples réplicas del mismo micropatrón SU8 en un gran bote de pesaje de plástico y vierta el PDMS de desgasificación, luego cúrelo en un horno seco a 60 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, retire suavemente el PDMS del maestro de silicona con las manos. Marque los límites de cada micro patrón en rectángulos con un bisturí quirúrgico y una regla. A continuación, corte el PDMS en bloques, perfore 16 agujeros en ambos extremos de cada microcanal con un punzón de biopsia, para hacer agujeros de 1,0 milímetros de diámetro.Pipeteó volúmenes calculados de fosfatidilcolina, fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato y sonda fluorescente sensible al pH en un solo vial de ventilación de vidrio de 20 mililitros. Seque la mezcla en un chorro de gas nitrógeno dentro de la campana de gases químicos durante 10 minutos o hasta que el solvente se evapore y se forme una fina película lipídica en el fondo del vial. A continuación, desecar la mezcla al vacío durante al menos tres horas con una resistencia al vacío de 10 milímetros para eliminar cualquier disolvente orgánico residual.Rehidrate la película lipídica seca con cinco mililitros de tampón corriente, coloque el lípido rehidratado en un baño ultrasónico a una frecuencia de funcionamiento de 35 kilohercios durante 30 minutos a temperatura ambiente. Congele, descongele la suspensión de vesículas con nitrógeno líquido y el baño de agua a 40 grados centígrados para obtener vesículas unilaminares. Repita la congelación y descongelación 10 veces, extruya la suspensión de vesículas a una membrana de policarbonato de borde de pista de 0,1 micras, utilizando un extrusor de lípidos para enriquecer pequeñas vesículas unilaminares.Repita la extrusión 10 veces. Pruebe las entradas y salidas del bloque PDMS en busca de obstrucciones rociando agua desionizada a través de los orificios con una botella de lavado con agua, luego seque el bloque PDMS con gas nitrógeno. A continuación, coloque el bloque PDMS y el cubreobjetos prelimpiados dentro de la cámara de muestras del sistema de plasma de oxígeno.Exponga el bloque PDMS y el cubreobjetos con plasma de oxígeno durante 45 segundos con los ajustes de potencia a 75 vatios, la velocidad del flujo de oxígeno a 10 centímetros cúbicos por minuto y la fuerza de vacío de 200 milímetros. A continuación, coloque la superficie del patrón del bloque PDMS en contacto con el cubreobjetos inmediatamente después del tratamiento con plasma de oxígeno. Presione suavemente para eliminar las burbujas de aire en los sitios de contacto.Coloque el dispositivo en una placa calefactora nivelada a 100 grados centígrados durante tres minutos para mejorar la unión. Use una toallita húmeda sin pelusa con etanol al 100% para eliminar cualquier partícula de polvo de la parte superior e inferior del dispositivo. Luego, pegue el dispositivo en la parte superior de un portaobjetos de microscopio de vidrio.Transfiera 100 microlitros de fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato que contiene pequeñas vesículas unilaminares a un tubo de microcentrífuga de 0,65 mililitros. Ajuste el pH de la solución a aproximadamente 3/2 añadiendo 6,4 microlitros de ácido clorhídrico normal 0,2. Pipetear 10 microlitros de la solución de vesícula unilaminar pequeña con pH ajustado en cada canal a través de la entrada y aplicar presión a través de la pipeta hasta que la solución llegue a la salida.Separe la punta de la pipeta y déjela unida al dispositivo. Después de repetir este paso para cada canal, incubar el dispositivo durante 10 minutos a temperatura ambiente, la inyección de vesículas en microcanales debe realizarse inmediatamente después del montaje del dispositivo. Mientras tanto, corte conjuntos de tubos de entrada y salida, con pinzas, conecte el juego de tubos de salida al dispositivo y luego pegue el dispositivo con cinta adhesiva en una platina de microscopio.Sumerja un extremo del juego de tubos de entrada en 25 mililitros de tampón de funcionamiento contenido en un tubo cónico y péguelo con cinta adhesiva para asegurarse de que el tubo esté asegurado. Con un conector de laboratorio, coloque el tubo cónico en un terreno más alto que el dispositivo para empujar la solución a través de los microcanales a través del flujo por gravedad. Para cada tubo de entrada, use una jeringa para extraer un mililitro de tampón de funcionamiento del extremo libre del tubo.Retire la punta de la pipeta de la entrada e inserte el extremo libre del tubo de entrada en el dispositivo. Repita este proceso para conectar todas las piezas del tubo de entrada al dispositivo. El flujo de tampón de rodadura a través de los canales ayuda a eliminar el exceso de vesículas no rotas y a equilibrar la bicapa para las condiciones experimentales.A continuación, abra el software de control del microscopio. En el panel izquierdo, haga clic en la pestaña del microscopio y elija el objetivo 10x. Haga clic en vivo y luego en los íconos de imagen de Alexa 568 en la barra de herramientas, usando las perillas de ajuste fino y grueso, concéntrese en los micro canales.Escanee el dispositivo para comprobar la calidad de los SLB y los canales. A continuación, haz clic en el icono de imagen cerrada del obturador FL en la barra de herramientas, haz clic en la pestaña de adquisición y, en Ajustes básicos, selecciona el tiempo de exposición. Ajusta el tiempo de exposición a 200 milisegundos.En el panel izquierdo, haga clic en adquisición multidimensional. En el menú de filtros, seleccione el canal rojo. Luego, haga clic en el menú de lapso de tiempo, establezca el intervalo de tiempo en cinco minutos, la duración en 30 minutos y el menú de lapso.Seleccione la herramienta de círculo en la pestaña de medición y dibuje un círculo en cualquier canal. Haga clic con el botón derecho mientras el círculo está seleccionado y elija propiedades. En la pestaña de perfil, marque todas las T para ver la intensidad de fluorescencia en función del tiempo.Asegúrese de que esta curva alcance una meseta que indique equilibrio antes de continuar con el siguiente paso, baje la solución tampón a un suelo igual al del dispositivo, para detener el flujo. Uno a la vez, separe cada tubo de salida y aplique 200 microlitros de cada dilución de proteína en el canal de salida con una pipeta. No apliques ninguna presión, deja que la gravedad haga el trabajo.Separe la punta de la pipeta y déjela unida al dispositivo microfluídico. Repita este proceso para cada canal y asegúrese de que no se introduzcan burbujas de aire en los canales durante este proceso. A continuación, baje el tubo de entrada a una tierra debajo del dispositivo microfluídico para comenzar a fluir la proteína a través de los microcanales.Pega con cinta adhesiva el extremo libre del tubo a un contenedor de residuos. Fluir las diluciones del dominio de homología de pleckstrin durante 30 minutos. En el panel izquierdo del software, en la pestaña de lapso de tiempo, haga clic en iniciar para comenzar a tomar imágenes nuevamente.Aquí se muestra una vista representativa del fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato que contiene SLB dentro de los microcanales. Antes, y después, de añadir el dominio de homología de pleckstrin a las concentraciones indicadas. Las intensidades de fluorescencia de la línea escaneada a través de microcanales se trazan en función de la distancia y los píxeles para los experimentos de unión a fosfatidilcolina, fosfatidilinositol 4 fosfato y fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato.A continuación, se normalizan los datos de unión de los experimentos individuales, se trazan en función de la concentración del dominio de homología de la fosfolipasa C delta 1 pleckstrin y se ajustan a un isotérmino de unión para extraer las constantes de asociación aparentes. La comparación de las constantes de asociación aparentes muestra que el dominio de homología de la fosfolipasa C Delta 1 pleckstrin interactúa con el fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato específicamente, como se esperaba. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer pequeñas vesículas unilaminares, hacer dispositivos microfluídicos, formar bicapas lipídicas soportadas dentro de estos dispositivos microfluídicos, como sus interacciones de unión a la membrana de proteínas, utilizando este ensayo con nuestro enfoque PIP-on-a-chip.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo, para evaluar el efecto de la unión de la membrana de proteínas en la difusión lateral de los lípidos. Esta técnica allana el camino para estudiar las interacciones de la membrana de las proteínas con el conjunto de lípidos que se encuentran en las células en lugar de uno a la vez, por lo que este enfoque tendrá un gran impacto en la bioquímica y la biología celular de las interacciones entre las proteínas y la membrana.

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Investigación

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Bioingeniería

En este video, demostramos las interacciones proteína-fosfoinositida en un patrón microfluídico utilizando el ensayo de modulación de pH, utilizando un colorante fluorescente sensible al pH marcado con el lípido de fosfatidiletanolamina de una bicapa lipídica soportada, llamada plataforma microfluídica. Las modulaciones en el pH después de la unión de proteínas a fosfolípidos causan extinción de fluorescencia.

Ensayo de modulación del pH en bicapas lipídicas soportadas para detectar interacciones proteína-fosfoinositida

Fosfoinosítidos están señalando los lípidos cuya abundancia relativa cambia rápidamente en respuesta a diversos estímulos. Este artículo describe un método para medir la abundancia de fosfoinosítidos por las células metabólicamente etiquetado con 3 H- myo -inositol, seguido por extracción y desacilación. Glicero-inositides extraídos se separan luego por cromatografía líquida de alta resolución y cuantificados por centelleo de flujo.

El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

PI (4,5) P 2 regula diversas funciones celulares, pero su organización nanoescala en la membrana plasmática de la célula es poco conocido. Por PI etiquetado (4,5) P 2 con una sonda fluorescente de dos colores fusionado con el dominio de homología Pleckstrin, se describe un nuevo enfoque para estudiar la PI (4,5) P 2 distribución espacial en la membrana plasmática en la escala nanométrica .

Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

El protocolo aquí describe las interacciones de la proteína de canal de iones hEAG1 purificada con la pequeña molécula lipídica ligando fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2). La medición demuestra que BLI podría ser un método potencial para la detección de iones de molécula pequeña novela canal ligando.

Captura de la cinética de la interacción de una proteína de canal iónico con moléculas pequeñas por el ensayo de interferometría de la Bio-capa

Este protocolo se centra en la identificación de proteínas que se unen a fosfatos de inositol o fosfoinosítidos. Utiliza cromatografía de afinidad con fosfatos de inositol biotinylados o fosfoinositidos que se inmovilizan a través de estreptavidina a agarosa o cuentas magnéticas. Las proteínas de unión de fosfato de inositol o fosfoinositida se identifican por la hincha occidental o espectrometría de masas.

Identificación de fosfato de inositol o proteínas que interactúan con fosfoinositida por cromatografía de afinidad acoplada a Western Blot o espectrometría de masas

Aquí, describimos protocolos que utilizan sensores de lípidos fluorescentes y liposomas para determinar si una proteína extrae y transporta fosfatidilserina o fosfatidilinositol 4-fosfato in vitro.

Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

Aquí, presentamos un protocolo para el enriquecimiento de fosfoproteínas fosfatasas endógenas y sus proteínas que interactúan a partir de células y tejidos y su identificación y cuantificación mediante proteómica basada en espectrometría de masas.

Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

Un nuevo enfoque que permite el análisis de la alta resolución de las interacciones de célula de cáncer con exógena de ácido hialurónico (HA) se describe. Superficies modeladas se fabrican mediante la combinación de la química y la impresión por microcontacto carbodiimida.

Superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer

La espectroscopia Raman es una técnica adecuada para el contacto no, libre de marca análisis de las células vivas, las construcciones de ingeniería de tejidos y tejidos nativos. Fuente específicos de huellas espectrales pueden ser generados y analizados utilizando el análisis multivariado.

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Se describe un método de microscopía correlativa que combina alta velocidad de microscopía de luz fluorescente de células vivas 3D y la crio-tomografía electrónica de alta resolución. Se demuestra la capacidad del método correlativo por imágenes dinámicas, pequeñas partículas de VIH-1 que interactúan con las células HeLa de acogida.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Aprende a evaluar interacciones proteína-membrana cuantitativamente sin etiquetado usando el ensayo PIP-on-a-chip. Este método microfluídico ofrece una alternativa biológicamente relevante para estudiar proteínas diana terapéuticas.

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

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