Análisis de la transferencia dependiente de la unión Gap de miARN con 3D-FRAP Microscopía

El objetivo general de este procedimiento es investigar la transferencia de micro ARN dependiente de la unión gap en cardiomiocitos vivos. Este método puede ayudar a abordar el papel del micro ARN para el sistema de transacción de señales intercelulares. La principal ventaja de esta técnica es que el intercambio de uniones gap de micro RNA se puede visualizar y cuantificar en células vivas con alta resolución espacio-temporal.

Después de aislar los cardiomiocitos de acuerdo con el protocolo de texto, coloque las células en placas de seis pocillos a una densidad de tres veces 10 a la quinta célula por centímetro cuadrado. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, agregue 0,5 tripzina a las células e incube los cultivos durante cinco minutos para separar las células.

Inactivar la tripzina añadiendo medio de cultivo celular. Después de contar las células, centrifugarlas a 300 veces g durante 10 minutos. A continuación, utilice el tampón de electroporación para volver a suspender las células a cuatro veces 10 por 10 a la quinta célula por cada 100 microlitros.

A continuación, mezcle 100 microlitros de suspensión celular con microARN fluorescente en un tubo y cargue la mezcla en una cubeta de electroporación. A continuación, realice la electroporación utilizando el programa G009 en el electroporador. Agregue 500 microlitros de medio de cultivo celular precalentado y transfiera todo el volumen de suspensión celular a un pocillo de una cámara de vidrio de cuatro pocillos.

Cultive las células durante un día a 37 grados centígrados, en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Después de precalentar la incubadora del microscopio y encender el sistema confucal, inserte el portaobjetos de la cámara en el portamuestras de la plataforma. Utilice un objetivo de aceite de 1,4 na y una luz de excitación láser de 561 nanómetros, a baja potencia láser, con un rango de detección de 570 a 680 nanómetros para encontrar el grupo de cardiomiocitos transvecvectados.

A continuación, en el administrador de configuración, active los botones z-stack, series temporales, blanqueo y regiones. A continuación, para definir los parámetros frap, en el menú del modo de adquisición, establezca el tamaño de fotograma en 512 por 512, el paso de línea en uno y el tiempo de escaneo en menos de un segundo. En el menú de canales, ajuste la potencia del láser, la compensación y la configuración de ganancia para obtener la máxima fluorescencia a partir de la mínima excitación del láser, para evitar la saturación de intensidad.

A continuación, ajuste el tamaño del orificio a dos micrómetros. A continuación, en el menú de regiones, seleccione la herramienta de dibujo roy y use el cursor para marcar la celda de destino, la celda de referencia y el área de fondo. Si es necesario, seleccione varias células objetivo para el fotoblanqueo.

En el menú de blanqueo, ajuste la configuración de blanqueo de fotos. A continuación, en el menú de z-stack, defina los límites para la adquisición de z-stack, en función del grosor de las celdas. Ajuste el número de capas z a 12 tp 15, luego, inicie el experimento frap y registre la recuperación de fluorescencia.

Para analizar los datos, cree la proyección máxima de las pilas z adquiridas utilizando un software específico para microscopio, haga clic en el procesamiento, proyección de intensidad máxima, seleccione el archivo, aplique. Finalmente, copie los datos de intensidad de fluorescencia en todos los puntos de tiempo del objetivo, el fondo y la celda de referencia, en una hoja de cálculo y realice el análisis de datos de acuerdo con el protocolo de texto. Aquí se muestran cardiomiocitos aislados con el típico patrón de alfa actinina estriado y grandes placas de conexina43, a lo largo de los bordes de célula a célula.

Algunos no cardiomiocitos estaban presentes en el cultivo. Como se ve aquí, por citometría de flujo, se alcanzó una eficiencia de transvección del 45%. Además, un ensayo de vivos muertos reveló que la mayoría de las células demostraron una alta viabilidad, lo cual es importante cuando se analiza la comunicación de la unión gap.

Para el análisis frap, las células objetivo se seleccionan dentro de un grupo de células y se fotoblanquean con una potencia láser del 100%, lo que reduce la fluorescencia del microARN en las células seleccionadas. El análisis cuantitativo y la normalización de los datos adquiridos, mostraron una recuperación promedio del 20%En este experimento, la reducción de la expresión de proteínas y la inhibición de la comunicación de la unión gap mediada por siRNA43, condujo a una reducción de la expresión de proteínas y la inhibición de la comunicación de la unión gap. La recuperación de fluorescencia se redujo en más del 50%, lo que indica que la eficiencia de la transferencia de ARN miro depende en gran medida del acoplamiento de la unión gap entre las células.

Esta figura muestra una representación de superficie en 3D de un experimento frap. En comparación con las proyecciones máximas, la adquisición de pilas z se puede utilizar para crear reconstrucciones en 3D para investigar la localización y la movilidad del micro ARN dentro de las células. Una vez dominado, las mediciones de frap se pueden realizar en dos o tres horas si se realizan correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante elegir celdas objetivo que tengan un número similar de celdas vecinas. Además, mis parámetros de blanqueo y las condiciones de adquisición de la imagen deben seleccionarse para evitar efectos fototóxicos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la microscopía frap para cuantificar y visualizar el movimiento del micro ARN dentro de los grupos celulares.