Medición simultánea de HDAC1 y HDAC6 actividad en HeLa células usando UHPLC-MS

El objetivo general de este método es determinar el potencial inhibidor de HDAC de los compuestos e identificar la selectividad hacia HDAC6 o HDAC1 en las células utilizando un solo ensayo de espectrometría de masas de cromatografía líquida de ultra alta resolución. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de fármacos, como determinar si un inhibidor de HDAC es selectivo para HDAC6 en lugar de HDAC de clase I en células vivas. La principal ventaja de esta técnica es que requiere un solo paso de incubación con células, inhibidores y sustratos selectivos para determinar la potencia frente a dos isoformas de HDAC simultáneamente.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el descubrimiento temprano de fármacos inhibidores selectivos de HDAC, ya que detecta si la selectividad de HDAC6 se mantiene en células vivas, evitando los ensayos de acetilación de proteínas endógenas. Aunque este método evalúa la selectividad de los inhibidores de HDAC en las células HeLa, también se puede aplicar a otras líneas celulares, como las células primarias y otras células tumorales, incluidas las muestras clínicas. Cultivo de células HeLa con un 80% de confluencia en un matraz de cultivo celular T75 en medios esenciales mínimos suplementados con suero bovino fetal al 10%, penicilina G y estreptomicina.

Lave las células dos veces con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. A continuación, aspire el tampón y añada un mililitro de reactivo de disociación celular. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos para separar las células.

Después de cinco minutos, agregue nueve mililitros de medio de cultivo MEM a las células y vuelva a suspender completamente la suspensión celular. Transfiera las células a un nuevo tubo de 15 mililitros y luego cuente las células con un hemocitómetro. Ajuste la densidad de la suspensión celular a 60, 000 celdas por mililitro en MEM.

A continuación, agregue 100 microlitros de la suspensión celular a los pocillos de control y prueba de una placa de 96 pocillos estéril, de fondo plano, tratada con cultivo de tejidos. Luego, agregue 100 microlitros de medio de cultivo MEM a los pocillos en blanco de la placa de 96 pocillos. Incubar la placa de 96 pocillos a 37 grados centígrados durante 24 horas.

Aspire el medio de los pocillos de la placa de 96 pocillos. Al aspirar el medio, evite desprender y extraer las células del pocillo. Esto se puede lograr utilizando una tasa de aspiración baja y colocando cuidadosamente las puntas de aspiración en la esquina inferior de la superficie del pozo.

Luego, agregue 25 microlitros de los compuestos de prueba dos veces en MEM a los pocillos de prueba, incluidos Trichostatin A, MS275 y Tubastatin A. Agregue 25 microlitros de MEM a los pocillos de control y en blanco. A continuación, agregue 25 microlitros de la mezcla de sustrato a los pozos de control y prueba. Luego, agregue 25 microlitros de MEM a los pozos en blanco.

Incube la placa de 96 pocillos a 37 grados centígrados durante ocho horas en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%. Para realizar la lisis celular, primero agregue 10 microlitros de tampón RIPA seis veces suplementado con inhibidor de proteasa a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Detenga la reacción agregando 160 microlitros de acetonitrilo frío a cada pocillo y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Coloque el plato en un congelador a menos 80 grados centígrados durante 10 minutos. Retire la placa del congelador y transfiera 220 microlitros del contenido de cada pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo cónico no estéril. Centrifugar la placa a 5.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Después de la centrifugación, transfiera 200 microlitros de sobrenadante a una placa de 96 pocillos compatible con el sistema UHPLC. Luego, selle la placa con una lámina de termosellado pelable con un sellador de placas. Prepare el sistema de espectrometría de masas de cromatografía líquida de ultra alta resolución llenándolo con el sistema de fase móvil.

Coloque la placa de 96 pocillos en un administrador de muestras que contenga un soporte para placas. Ejecute los ejemplos de acuerdo con las condiciones UHPLC ESI MS/MS que se encuentran en el texto. Para realizar el análisis de datos, integre el área máxima de cada sustrato y su producto desacetilado con el software de integración UHPLC adecuado.

Para cada sustrato, calcule la relación de área máxima de desacetilado a acetilado en cada cromatograma. Incluya las muestras de prueba y de control. Finalmente, calcule el porcentaje de inhibición de HDAC de cada muestra de prueba de acuerdo con la ecuación en el protocolo de texto.

Aquí se presenta el cromatograma UHPLC-MS de una muestra. Los picos correspondientes a los sustratos añadidos a las células se detectan de acuerdo con sus transiciones de masa como se describe en la tabla uno del protocolo escrito. MOCPAC es desacetilado por HDAC1 para proporcionar el pico de MOCPAC desacetilado.

De manera similar, BATCP es desacetilado por HDAC6 para proporcionar el pico BATCP desacetilado. Por último, la MAL proporciona el pico de MAL desacetilado que refleja la desacetilación de varias HDAC endógenas de forma inespecífica. Aquí se muestra la figura con el cromatograma obtenido con diferentes concentraciones del inhibidor de HDAC Trichostatin A.Se realizó una evaluación de la dosis-respuesta de los inhibidores estándar de HDAC.

Los valores integrados obtenidos de MOCPAC y dMOCPAC se utilizaron para calcular la potencia de los inhibidores estándar frente a HDAC1. Después de los cálculos de IC 50, MS275, un inhibidor selectivo de HDAC de clase I, mostró valores de IC 50 más bajos para HDAC1 que para Tubastatin A, un inhibidor de HDAC6 conocido. Por otro lado, se utilizaron los valores aislados de BATCP y dBATCP para calcular la potencia de los estándares frente a HDAC6.

Esta vez, la tubastatina A proporcionó un valor de IC 50 más bajo que MS275, lo que confirma su perfil de selectividad de isoformas. La tricostatina A es un inhibidor potente y no selectivo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 72 horas si se realiza correctamente, incluyendo el tiempo de tratamiento celular y el análisis de la placa de 96 pocillos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los tiempos de incubación indicados aquí son para las células HeLa. Si se utiliza otra línea celular, es necesario optimizarla. Siguiendo este procedimiento, se podría medir la actividad inhibidora selectiva de HDAC de otras isoformas siempre que existan sustratos específicos.

No olvide que trabajar con solventes orgánicos y otros productos químicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben usar gafas de protección, guantes y una bata de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.