Name: Estudio de las interacciones proteína-proteína en la autofagia investigación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: Aprende técnicas de inmunofluorescencia e inmunoprecipitación para estudiar interacciones proteína-proteína en mamíferos. Estos métodos permiten identificar componentes de vías de señalización celular y comprender la dinámica proteica en procesos de autofagia.

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Este trabajo fue apoyado por científicos y tecnológicos investigación Consejo de Turquía (TUBITAK) 1001 107T153 de la beca, la Universidad de Sabanci. SEB y NMK cuentan con una beca de TUBITAK BIDEB 2211 para estudios de doctorado.

1. inmunofluorescencia <ol><li>mantener HEK293T riñón embrionario humano células en medio de la glucosa alta de DMEM, y células de neuroblasto de ratón N2A en DMEM bajo medio de glucosa, 5% CO 2-incubador humedecido a 37 ° C. Complementar los medios de cultivo con suero bovino fetal inactivado por calor de 10% (FBS), antibióticos (50 U/mL de penicilina, estreptomicina 50 de μg/mL) y L-glutamina (2 mM).</li>
	<li>Separar las células utilizando tripsina 0.25%. Primero quitar los medios de cultivo celular y luego lavar las células con solución salina 10 mL estéril tamponada con fosfato (PBS) e incubar con 1 mL de tripsina a 37 ° C por 5 min Inactivate tripsina mediante la adición de medio DMEM de 2 mL.</li>
	<li>Lavar la placa bien mediante pipeteo. Extraiga 10 μl de solución de la célula y se mezcla con 10 μl de azul tripán. Contar el número de células vivas usando un hemocitómetro.</li>
	<li>HEK293T ambos y N2A es líneas de células adherentes, sin embargo, las células HEK293T separan de la placa fácilmente. Por lo tanto, si se trabaja con la línea de células HEK293T, capa la coverslides con estéril filtrado 0.01% poly-L-lisina antes de sembrar las células.
	<ol><li>Coverslides estéril de lugar en una placa de Petri de 10 cm. Añadir la cantidad apropiada de solución de poli-l-lisina en cada coverslide. Incubar coverslides con solución de poli-l-lisina durante 10 minutos</li>
		<li>Quitar la solución de poli-l-lisina. 
		Nota: Poly-L-lisina es reutilizable; es opcional recopilar y reutilizar para otros experimentos. Desde poly-L-lisina es tóxico, espere hasta que toda la solución en el coverslides se evapora completamente y luego recuperar la poli-l-lisina.</li>
		<li>Lave coverslides con PBS estéril.</li>
	</ol></li> <li>Agregar 1 mL de DMEM en cada pocillo de una placa de 12 pozos. Colocar un coverslide en cada pocillo.</li>
	<li>Semilla 20.000 células/pozo, gota a gota agitando la placa a la vez una distribución homogénea de las células de la coverslides. Mantener las células en el CO 2 incubadora a 37 ° C y agregar la droga por lo que el tiempo de incubación total no exceda de 48 horas, es decir, para 3 h tratamiento de Torin, añadir el medicamento a 45 h post siembra.
	Estudios de interacción de <ol><li>de RACK1-LC3, Torin 1, rapamicina y hambre fueron utilizados como inductores de la autofagia. Las células fueron incubadas con Torin 1 durante 3 h (250 nM concentración final); con rapamicina durante 16 h (200 nM concentración final); y con Earle &#39; s balanceado sal solución (EBSS) por 2 h para las células de morir de hambre. 
		Nota: Incubación en DMEM con 10% FBS fue utilizado como la condición control.</li>
	</ol></li> <li>Después de 48 h de incubación total, eliminar los medios de comunicación en la coverslides y lavarlas con 1 mL de PBS.</li>
	<li>Para fijar las células, incubar las células con 1 mL hielo frío estéril filtrada paraformaldehído al de 4% (PFA) de 1 x PBS (pH 7.4), por 20 min a temperatura ambiente sin ninguna agitación. 
	PFA es sensible a la luz, mantener (importante) la placa en la oscuridad durante el período de incubación; cubrir la placa con papel de aluminio puede ayudar. Por otra parte, PFA es tóxico, por lo tanto, trabajar bajo una campana de humos mientras que las células de fijación. 
	Nota: Ten en cuenta que la fijación en los experimentos de inmunofluorescencia debe ser optimizado, como los anticuerpos específicos pueden trabajar mejor utilizando agentes de fijación diferentes y condiciones.</li>
	<li>Después de 20 min de incubación de la PFA, primero retire la solución de la PFA en el coverslides y lavar cada muestra 3 veces con PBS filtrado estéril de 1 mL. En este paso, (importante) lavar los pocillos uno por uno para que no se deje secar. Evitar que se sequen ya que se interfieren con las reacciones posteriores de las células, cambiar la morfología de la célula y aumentar señales inespecíficas.</li>
	<li>Cuando el lavado es completado, mantener las muestras en 1 mL de PBS en hielo.</li>
	<li>Prepare la solución de bloqueo: PBS con 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA) y 0.1% saponina.</li>
	<li>Cubre una placa de 6 pozos con la película de parafina. Asegúrese de que la placa inferior es suave después de la cubierta de la película de parafina. Etiqueta de la placa de la pozo 6.</li>
	<li>Con unas pinzas, transferencia de la coverslides de las placas 12-bien a las placas de 6 pozos cubiertos con la película de parafina.</li>
	<li>Descartar el PBS en coverslides y agregue 100 μl de solución en cada coverslide para permeabilización de bloqueo. Incubar las muestras en hielo durante 30 minutos</li>
	<li>Preparar el anticuerpo primario en solución de bloqueo. Antes de los experimentos, optimizar las diluciones de anticuerpo para definir las mejores concentraciones de trabajo para la tinción de. 
	Nota: por ejemplo, LC3 anticuerpo se utiliza en una dilución 1: 100 en solución de bloqueo.</li>
	<li>Después de la incubación de 30 minutos, desechar la solución de bloqueo y lavar las muestras con 1 mL de PBS una vez.</li>
	<li>Agregar 100 μl de solución de anticuerpo primario para cada coverslide. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 1 h, en un agitador. 
	Nota: Tiempo de incubación con el anticuerpo primario debe ser optimizado. Dependiendo de los anticuerpos, una incubación durante la noche a 4 ° C puede ser preferible. Es mejor a incubar en un agitador suavemente (100 vueltas/min) para distribuir igualmente el anticuerpo en el coverslides.</li>
	<li>Después de la incubación con el anticuerpo primario, lavar las muestras individualmente, 3 veces con 1 mL de PBS.</li>
	<li>Prepare 1: 500 de anticuerpo secundario en el bloqueo de solución (optimizaciones de diluciones del anticuerpo secundario pueden ser necesarias). Aquí, anti-conejo IgG Alexa Fluor 568 fue utilizado como un anticuerpo secundario anti-conejo.
	<ol><li>Incubar las muestras con 100 μl de solución de anticuerpo secundario por 1 h a temperatura ambiente en un agitador. Puesto que los anticuerpos secundarios fluoróforo sensible a la luz, (importante) mantener la solución en la oscuridad. Coloque las muestras en la oscuridad durante y después de la incubación del anticuerpo secundario.</li>
	</ol></li> <li>Después de la incubación del anticuerpo secundario, lave la placa 3 veces con PBS. 
	Nota: Baed experiencia, algunos anticuerpos tienen señales de alto fondo que no pueden ser eliminadas por el PBS lava. Si trata con tal un anticuerpo, después paso 1.21, mantener las muestras en PBS a 4 ° C por 6 h puede ayudar.
	<ol><li>Si es necesario, las células con un colorante de unión al ADN, como Hoechst, con motivo de los núcleos de la mancha.</li>
	</ol></li> <li>Para teñir más de una proteína, aplicar el mismo procedimiento a partir de paso 1.16 para la proteína segunda.
	<ol><li>Asegúrese de que no hay ninguna reactividad de especies entre los anticuerpos cuando se realiza la coloración con más de un anticuerpo (por ejemplo, el uso del ratón y conejo anticuerpos). 
		Nota: Aquí, RACK1 se mancha como la segunda proteína con anticuerpos primarios anti-RACK1 y usando las mismas concentraciones mencionadas de secundarios anticuerpos anti-ratón IgG Alexa Fluor 488.</li>
	</ol></li> <li>Preparar la solución de montaje: 50% glicerol en PBS 1 x. Filtro a través de un filtro de 22 μm.</li>
	<li>Limpiar los portaobjetos con el etanol usando un paño libre de pelusas y agregar solución de montaje de 10 μl a cada diapositiva. Utilizando una pinza, coloque el coverslides en cada dropso que el lado con las células está en contacto directo con el medio de montaje. Deseche la solución de montaje de exceso con la ayuda de trapos sin pelusa.</li>
	<li>Sello coverslides con un esmalte de uñas transparente. En primer lugar, estabilizar la coverslides añadiendo gotas de esmalte de uñas en los 4 bordes y luego sellarlas completamente.</li>
	<li>Analizar las muestras bajo un microscopio fluorescente o confocal tan pronto como sea posible, ya que la señal fluorescente puede blanquear después de algunas horas.</li>
</ol> < clase p = "Japane_title "&gt; 2. Inmunoprecipitación <ol><li>separar y contar las células como se describen en los pasos 1.2 y 1.3.</li>
	<li>Si se trabaja con células HEK293T, 4 millones de células para cada condición en cajas Petri de 15 cm de la semilla. Si trabaja con las células N2A, 5 millones de células en cajas Petri de 15 cm de la semilla. Incubar las células en una incubadora de CO 2 a 37 ° C hasta el final del experimento.</li>
	<li>Tratar las células con los medicamentos pertinentes o las condiciones para una duración definida por lo que el tiempo total de incubación de las células no exceda de 48 h. 
	Nota: Para las pruebas de inmunoprecipitación en este estudio, las células fueron tratadas durante 3 horas con Torin 1 (250 nM), 16 h con rapamicina (200 nM) y 2 h con EBSS. DMEM con 10% FBS se agregó a las células como el control de.</li>
	<li>Después de 48 h de incubación total, eliminar los medios de comunicación y cosechar las células. Puesto que las células HEK293T separan fácilmente de la placa, lavar la placa con hielo PBS frío puede ser adecuada para la cosecha. Sin embargo, las células N2A son más resistentes a la separación; uso de raspadores de células para ayudar a las células de la cosecha.
	<ol><li>Recoger todas las células en los tubos de microcentrífuga.</li>
	</ol></li> <li>Muestras de centrifugar a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C. descarte el sobrenadante y lavar el pellet con 1 mL de PBS suspendiendo nuevamente mediante pipeteo.</li>
	<li>Centrífuga repetir, pero a la máxima velocidad de centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos, descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Buffer preparar ensayo Radio de inmuno-precipitación (RIPA) antes de comenzar el experimento. 
	Nota: Hay 3 tipos de almacenador intermediario de RIPA; elegir según la intensidad de la interacción de las proteínas siendo investigado (ver fórmulas a continuación).
	<ol><li>Si hay una interacción de proteínas fuerte, elegir el almacenador intermediario RIPA regular.</li>
		<li>Si la interacción es débil, seleccione suave RIPA o RIPA más. 
		Nota: Las recetas de estas reservas están en los siguientes pasos. Deben completarse todos los búferes que se utilizan en las pruebas de inmunoprecipitación con inhibidores de la proteasa.
		<ol><li>Preparar regular almacenador intermediario de RIPA usando 1% NP-40 150 mM NaCl, desoxicolato de sodio 0.5% y 0.1% sulfato de dodecil de sodio en 50 mM de Tris pH 8.</li>
			<li>Preparar el almacenador intermediario de RIPA suave usando 1% NP-40 y 150 mM NaCl, 0,25% desoxicolato de sodio en 50 mM de Tris pH 7.5.</li>
			<li>Preparar el Buffer de RIPA más leves en 1% Triton-X 100, 137 mM NaCl, 1% glicerol y ortovanadato de sodio 1 mM, 50 mM de Tris pH 7.4.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Después de elegir el tampón apropiado de RIPA, complementar el búfer con inhibidores de la proteasa (RIPA +). Entonces, lyse las células con 3 x el volumen de la pastilla celular en RIPA +.</li>
	<li>Vortex la suspensión por 15 s. mantenerlo en hielo por 5 minutos Repita el vórtice y Glas 5 veces y luego centrifugar las muestras a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio y centrifugar para eliminar restos de células remanentes. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.</li>
	<li>Diluir la proteína lysates de la 1:50 y prepare una placa de 96 pocillos con espacio en blanco y las normas. Diluir las muestras de.
	<ol><li>Las muestras de mezcla con Bradford solución 1:20. Incubar por 15 min en la oscuridad.</li>
		<li>Medir la densidad óptica en longitud de onda de 595 nm. Calcular la concentración de proteína con valores de absorbancia para cada muestra.</li>
	</ol></li> <li>El día antes de la cosecha de las células, pareja granos A Plus proteína con anticuerpos que son específicos a la proteína de interés.
	<ol><li>Corte el borde de una punta de 200 μL con unas tijeras y use 25 μl de la mezcla de grano para cada condición de.</li>
		<li>Lave los granos una vez con 1 mL de PBS, una vez con 1 mL de tampón de RIPA y una vez con 1 mL RIPA +. Llevar a cabo los pasos de lavado en 3.300 x g, 4 º C durante 1 minuto</li>
		<li>Después del último lavado, añadir 300 μL de RIPA + en las cuentas y añadir 1,5 anticuerpo μg que es específico a la proteína que se tirará.</li>
		<li>Incubar los tubos durante la noche a 4 ° C en un agitador (20 vueltas/min). 
		Nota: Aquí, ATG5 fue immunoprecipitated usando los anticuerpos específicos anti-ATG5.</li>
	</ol></li> <li>Después de la incubación durante la noche de granos con el anticuerpo, lavar los granos una vez con PBS, una vez con RIPA y una vez con RIPA + como se describe en el paso 2.12.2.</li>
	<li>Añadir 2 mg de proteína lisada en las cuentas para cada condición y completa el volumen total a 300 μL con RIPA + tubo de solución tampón. Incubar los tubos durante la noche en un agitador a 4 ° C.</li>
	<li>Después de la incubación, lavar los granos como se describió anteriormente (paso 2.12.2).
	<ol><li>Después del último lavado, utilice una punta de la pipeta más pequeña para eliminar el sobrenadante sin tocar los granos de.</li>
		<li>Añadir 10 μl de 3 x tinte de carga: 6%, 30% glicerol, 16% β-mercaptoetanol y SDS 0.1% azul de bromofenol 1M Tris-HCl pH 6.8.</li>
	</ol></li> <li>Preparar los controles de entrada con al menos 100 μg proteína lisada para cada condición. Igualar los volúmenes de la muestra con agua y añadir el volumen adecuado de 3 x carga tinte.</li>
	<li>Hervir las muestras a 95 ° C durante 10 minutos 
	Nota: Generalmente cuando hierva las muestras, las tapas de los tubos pueden abrir espontáneamente y las muestras son perdidas. Evitar esto mediante la celebración de las tapas de cerrado con un bloqueador específico cap.</li>
	<li>Vuelta abajo las muestras y la carga en geles de SDS-PAGE para separar las proteínas según su tamaño usando protocolos estándar de. 
	Nota: En este estudio sobre RACK1 y ATG5, las muestras se corrieron a través de geles de poliacrilamida 12% 80 V por 30 min y luego a 120 V durante aproximadamente 90 minutos. Sin embargo, para las más pequeñas proteínas como LC3, utilizando geles de poliacrilamida de 15% es más conveniente.</li>
	<li>Después del gel corriendo, transferir las proteínas a nitrocelulosa o PVDF membranas utilizando cualquiera de los dos métodos de transferencia húmedo o semiseco. Entonces, bloquear las membranas por la incubación en leche descremada de 5% en PBS con 0,05% Tween 20 (SAFT) a temperatura ambiente para membranas de 1 h. lavado 3 veces con SAFT para 5 min</li>
	<li>Incubar las membranas con anticuerpos primarios en las concentraciones de trabajo por 1 h a temperatura ambiente. Para las diluciones del anticuerpo primario, utilizar BSA que contenga soluciones rojo (5% BSA fracción de V de Cohn, 0,02% azida sódica en SAFT, pH 7,5; añade rojo fenol añadido como un marcador de pH) para permitir la reutilización de los anticuerpos a. 
	Nota: por ejemplo, diluir ATG5 x 2.000 de anticuerpo en la solución de rojo.
	<ol><li>Al final del tiempo de incubación, lavar las membranas 3 veces con SAFT.</li>
	</ol></li> <li>Incubar las membranas con anticuerpos secundarios HRP-conjugado que se prepararon en solución de leche descremada de 5% (aquí se utilizó anti-IgG de conejo en el 1: 10.000). Luego lavar las membranas 3 x con SAFT para 5 min</li>
	<li>Que la solución de ECL: 25 mM luminol, Ácido hidroxicinámico 9 mM, 3 x 10 -4% H 2 O 2 en 70 mM Tris-HCl de pH 8.8. Uso fresco H 2 O 2 para cada experimento. 
	Nota: La reacción comienza después de H 2 2 y continúa por aproximadamente 20 minutos.
	<ol><li>Incubar las membranas y radiografía películas por 20 min en ECL. Desarrollar y fijar en una habitación oscura.</li>
	</ol></li> <li>Para comprobar la co-inmunoprecipitación de proteínas con cierre o superposición de pesos moleculares, puede que sea necesario quitar los anticuerpos de las membranas por incubación de las membranas a 60 ° C por 30 min en el buffer de extracción: (pH 25 mM Tris-HCl 2 y 1% SDS).</li>
	<li>2.20 a 2.23 Repita los pasos para verificar la co-inmunoprecipitación con anticuerpos diferentes. Por ejemplo, siguiendo ATG5 detección y desmontaje de las membranas, proteínas RACK1 fue probado en las membranas mismo usando un anticuerpo primario anti-RACK1 (1:1, 000) y los anticuerpos secundarios (1:10, 000). Fue utilizado β-actina como control de carga; y señal de IgG fue utilizado como el control de carga para las muestras immunoprecipitated.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Técnicas de inmunoprecipitación e inmunofluorescencia son cruciales para el estudio de las interacciones proteína-proteína. Aunque estas dos técnicas se utilizan y bien establecido, se deben considerar varios criterios para definir la calidad de los experimentos durante el uso de estas técnicas.
En primer lugar, primarios los anticuerpos que se utilizan en estas pruebas deben ser específicos para las proteínas de interés. Para ello, utilizar shRNA caídas o células de nocaut para probar la espe...

Macroautophagy (autofagia, aquí) es un mecanismo de estrés celular que se caracteriza por el secuestro de citoplasma grueso, proteínas y organelos en vesículas de doble membrana llamados vesículas autofágicas. A través de la fusión de la capa externa de la membrana doble, vesículas autofágicas y su carga se entregan a los lisosomas y degradación en ella1. Autofagia ocurre en bajos niveles basales en todos los tipos celulares y en todos los organismos, realizando funciones homeostáticas como degradación de las proteínas y organelas (p. ej., mitocondrias) facturación. Bajo condiciones de estrés celular, como el hambre, la autofagia es rápidamente alza y permite a la célula mantener los niveles de energía y metabolismo básico1,2,3.
Alrededor de 30 genes de autofagia han sido clonados de la levadura y sus productos de proteína fueron demostrados para desempeñar un papel en las distintas etapas del proceso de autofagia, incluyendo nucleación de vesícula, expansión, fusión de la vesícula al último endosome/lisosoma y degradación de la carga 4 , 5. se han identificado ortólogos de la mayoría de estos genes y estudios en distintos organismos confirmaron la preservación de sus funciones celulares6. Estudios en la última década demostraron que varios autofagia relacionadas existen complejos de la proteína y las interacciones proteína-proteína y que gobiernan las vías autofagia de manera intrincada y controlada. Existen intersecciones, copias de seguridad, retroalimentación y mecanismos de feedforward, y permiten que la célula de coordinación de la autofagia con otros eventos relacionados (tales como secreción vesicular, biogénesis del lisosoma, endosomal clasificación y transporte7, etc.) En una pantalla de imparcial híbrido de levadura-dos utilizando la proteína autofagia ATG5 como cebo (ATG5 es una proteína de autofagia clave implicados en el sistema de conjugación como E2 que media lipidation LC3 en inanición inducida por autofagia), hemos identificado del Receptor activado C-kinasa 1 (RACK1; GNB2L1) como un fuerte interactor y un componente de autofagia novela8. Lo importante, la pantalla mostró que la interacción ATG5-RACK1 fue indispensable para la inducción autofagia por inductores de autofagia clásica (inhibición, es decir, hambre y mTOR).
Métodos de inmunofluorescencia se utilizan para controlar las interacciones proteína-proteína. Estas técnicas están principalmente basados en anticuerpos y ayudan a visualizar las interacciones y confirmar localizaciones celulares. En esta técnica fluorescente etiqueta conjugados anticuerpos que son específicos de las proteínas de interés se utilizan generalmente para la tinción específica. Cada proteína puede etiquetarse con anticuerpos acoplados a tintes fluorescentes diferentes. Usando los anticuerpos específicos de proteína, una superposición de la señal cuando se combinan imágenes indica la colocalización de proteínas bajo microscopia confocal. La técnica es aplicable a células o tejidos incluso. Técnicas de inmunofluorescencia proporcionan pistas sobre la dinámica de interacción y ayudar a identificar el tamaño y distribución de complejos proteicos, y seguimiento de los cambios generales en la morfología celular bajo diferentes condiciones9. La inmunoprecipitación es otra técnica utilizada basados en anticuerpos que permite el análisis de las interacciones entre dado proteínas10. Usando esta técnica, proteínas de interés se aíslan de células o tejido extractos utilizando anticuerpos específicos, dando por resultado la precipitación de proteínas que se encuentran en un complejo o en contacto con una proteína de interés. Co-inmunoprecipitación, donde se detectaron la proteína y su interactor Co, revela no sólo la interacción entre dos proteínas, pero puede medir su intensidad de interacción bajo diferentes circunstancias11.
Este protocolo se describe en técnicas clave de detalle que se utilizaron para confirmar y caracterizar la interacción ATG5-RACK1 y RACK1-LC3. El enfoque es sobre técnicas de inmunofluorescencia y la inmunoprecipitación con énfasis de pasos críticos y las dificultades para la investigación de la autofagia, así como sugerencias de solución de problemas.

<table><tbody><tr><td>Tripsina EDTA Solución A</td><td>Industrias Biológicas&nbsp;</td><td>BI03-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GE Healthcare</td><td>SH-30256.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glucosa alta)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glucosa baja)</td><td>Sigma</td><td>5546</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSL-103</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos</td><td>Isolab</td><td>I.075.02.005</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Torin</td><td>Tocris</td><td>4247</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>VWRSAD2650</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Industrias Biológicas&nbsp;</td><td>BI02-010-1A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>15812-7</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; A4503</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>LC3 Anticuerpo</td><td>Sigma</td><td>L7543</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Conejo IgG Alexa Fluor 568</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>RACK1 Anticuerpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>&nbsp; sc-17754</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón IgG Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Applichem</td><td>A16694.0250</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Applichem</td><td>A9242.5000</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Biochemika</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>4975</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>ATG5 Anticuerpo</td><td>Sigma</td><td>A0856</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Applichem</td><td>A4453</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Aplicamiento</td><td>A1108.0250</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol&nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A3640.0005</td><td></td></tr><tr><td>Leche desnatada</td><td>Apliquem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Riedel de Haen</td><td>13412</td><td></td></tr><tr><td>Rojo de fenol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>114537-5G</td><td></td></tr><tr><td>anti-conejo IgG, HRP conjugado</td><td>Jackson Immuno.</td><td></td><td></td>1110305144</tr><tr><td>Luminol</td><td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Coumérico</td><td>Sigma</td><td>C9008</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrógeno</td><td>Merck</td><td>K35522500604</td><td></td></tr><tr><td>anti ratón IgG, HRP conjugado</td><td>Jackson Immuno.</td><td>115035003</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Anticuerpo de actina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de conejo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; R0395</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A-Agarosa Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2001</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>solución de penicilina/estreptomicina</td><td>Biological Industries&nbsp;</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Industrias Biológicas&nbsp;</td><td>BI03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Solution</td><td>Sigma</td><td>6916</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitocelulosa</td><td>GE Healthcare</td><td>A10083108</td><td></td></tr><tr><td>Películas de rayos X</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19289</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

estudio de las interacciones proteína-proteína en la autofagia investigación

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Las interacciones proteína-proteína son importantes cascadas de señalización celular de comprensión identificación vía nuevos componentes y dinámica de proteínas. La mayoría de las actividades celulares requiere interacciones físicas entre proteínas. Para analizar y mapear estas interacciones, se desarrollaron varias técnicas experimentales como herramientas bioinformáticas. La autofagia es un celular reciclado mecanismo que permite a las células hacer frente a diferentes factores de estrés, incluyendo hipoxia, productos químicos y privación de nutrientes. Para entender mejor la autofagia-eventos relacionados con señalización y descubrir nuevos factores que regulan los complejos proteicos en la autofagia, realizamos pantallas de interacción proteína-proteína. Validación de estos resultados requiere el uso de técnicas de inmunoprecipitación y la inmunofluorescencia. En este sistema, interacciones proteína-proteína relacionada con la autofagia específico que descubrimos fueron probadas en Neuro2A (N2A) y líneas de células HEK293T. Detalles de los procedimientos técnicos utilizados se explican en este artículo experimento visualizado.

En la figura 1 un ejemplo de una colocalización muestra resultado obtenido mediante este protocolo. Una figura de nuestro reciente libro presenta8. Aquí, proteína endógena RACK1 fue manchada en verde, mientras que LC3 endógena fue manchado en rojo. Los puntos amarillos que se observan en los cuadros combinados indican sitios de traslapo entre las señales verdes y rojas. Así los puntos amarillos representan la co-localización parcial de estas dos proteínas.
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Presentados aquí son dos técnicas de investigación de interacción de proteínas anticuerpo-basado: la inmunofluorescencia y la inmunoprecipitación. Estas técnicas son convenientes para el estudio de interacciones físicas entre proteínas para el descubrimiento de nuevos componentes de vías de señalización celulares y para la dinámica de la proteína de comprensión.

Estudio de las interacciones proteína-proteína en la autofagia investigación

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Me llamo Devrim Gozuacik. Estamos trabajando en la Universidad Sabanci, Estambul, Turquía, en la regulación de la autofagia en mamíferos. Nos centramos en diferentes proteínas, vías y ARN que regulan la autofagia.Existen varias técnicas para estudiar la autofagia. Estamos utilizando técnicas de biología molecular, bioquímica y biología celular para analizar diferentes vías que estamos descubriendo. Empleamos inmunoprecipitación, técnicas de inmunofluorescencia, microscopía confocal y diversas otras técnicas para analizar las vías de autofagia.Los detalles de las diferentes técnicas, dificultades y solución de problemas serán explicados por mi estudiante de doctorado, Secil Erbil. El objetivo general de los procedimientos de inmunofluorescencia e inmunoprecipitación es monitorear interacciones proteína-proteína endógenas en una célula. Este método puede ayudarle a responder las preguntas clave sobre las interacciones proteína-proteína y su localización celular.La principal ventaja de estas técnicas es la posibilidad de cuantificar la intensidad de la interacción durante tratamientos y condiciones deseados en comparación con el control. Para comenzar, desprenda las células con tripsina. Luego cuente las células utilizando un hemocitómetro y calcule la concentración celular.Tome portaobjetos empaquetados y autoclavados y colóquelos en una placa de Petri de 10 centímetros. Si está trabajando con una línea celular que se desprende fácilmente, como HEK293T, como en este experimento, recubra los portaobjetos con una solución de poli-L-lisina al 0,01 % filtrada estérilmente. Después de 10 minutos de incubación, retire la solución.Espere hasta que todo el poli-L-lisina se evapore y las cubreobjetos estén completamente secas. Luego, lávelas con PBS estéril. Añada un mililitro de medio a una placa de 12 pocillos y coloque las cubreobjetos en cada pocillo.Siembre 20 000 células por pocillo. Es importante agitar la placa durante y después de la inoculación para lograr una distribución homogénea de las células sobre las laminillas. Trate sus células con el fármaco deseado y su control de manera que el tiempo total de incubación de las células no exceda las 48 horas.Al final de 48 horas, retire el medio de los portaobjetos y lave las células una vez con PBS. Luego, bajo una campana extractora, elimine el PBS y fije las células incubándolas con PFA al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Dado que el PFA es sensible a la luz, cubra la placa con papel de aluminio durante el tiempo de incubación.Luego elimine el PFA y lave las muestras tres veces con PBS. En este paso, es importante lavar las muestras una por una para no secarlas. A continuación, etiquete una placa de seis pocillos según sus condiciones de tratamiento y cubra cada pocillo con Parafilm.En este paso, preste atención para tener una superficie inferior lisa tras cubrir con Parafilm. Luego, coloque las laminillas de cobertura en una placa de seis pocillos y añada 100 microlitros de la mezcla de BSA-saponina sobre cada laminilla, incubándolas durante 30 minutos en hielo para el bloqueo. A continuación, retire la solución de bloqueo y lave las muestras una vez con PBS.Prepare de uno a 100 de anticuerpo primario en la mezcla de BSA-saponina y coloque 100 microlitros de esta solución en cada cubreobjeto. Incube durante una hora a temperatura ambiente. Durante la incubación, es preferible agitar la placa para lograr una distribución uniforme del anticuerpo en los cubreobjetos.Luego, retire el anticuerpo primario y lave las muestras tres veces con PBS. Prepare un anticuerpo secundario Alexa Fluor 1:500 en la mezcla de BSA-saponina y agregue 100 microlitros de esta solución sobre cada cubreobjetos. Dado que Alexa Fluor es sensible a la luz, es importante mantener las muestras en la oscuridad a partir de este paso.Por lo tanto, cubra la placa de seis pocillos con papel de aluminio e incúbela durante una hora a temperatura ambiente en la agitadora. Luego, retire el anticuerpo secundario y lave las muestras tres veces con PBS. Etiquete los portaobjetos con los nombres de sus tratamientos y límpielos con etanol utilizando Kimwipes.Luego, coloque 10 microlitros de solución de montaje en el centro de cada portaobjetos. Con una pinza, coloque cada cubreobjetos sobre los portaobjetos. A continuación, retire suavemente el exceso de solución de montaje utilizando una toalla absorbente Kimwipe.Primero, estabilice cada portaobjetos con cuatro gotas de esmalte de uñas. Luego, selle completamente el portaobjetos. Analice la muestra utilizando un microscopio confocal.Aquí se muestra un ejemplo del resultado de colocalización obtenido mediante el uso de este protocolo, extraído de nuestro artículo reciente. En este video, la proteína endógena RACK1 se tiñó con color verde, mientras que la LC3 endógena se tiñó con color rojo. Los puntos amarillos que aparecen en las imágenes combinadas (Merge) corresponden a los lugares donde las señales verde y roja se superponen.En otras palabras, los puntos amarillos representan la colocalización de estas dos proteínas. La inmunoprecipitación es otro método comúnmente utilizado para estudiar interacciones entre proteínas. Para comenzar, siembre cuatro millones de células HEK293T en placas de Petri de 15 centímetros para cada condición.Trate las células con los fármacos deseados de manera que el tiempo total de incubación de las células no exceda las 48 horas. Después de 48 horas de incubación, recolecte las células con PBS frío. Las células HEK293T se desprenden fácilmente de la placa.Por lo tanto, lavar la placa con PBS mediante pipeteo es suficiente para despegar y recolectar todas las células. Recoja sus células en tubos Eppendorf y centrifúgelos durante 15 minutos a velocidad máxima a cuatro grados. Luego deseche el sobrenadante y lave el botón celular con un mililitro de PBS resuspendiéndolo mediante pipeteo.Luego, centrifugue nuevamente y deseche el sobrenadante. A continuación, re suspenda el botón celular en tampón RIPA que contenga inhibidores de proteasas. Agite la suspensión en vórtex durante 15 segundos y mantenga el tubo Eppendorf en hielo durante cinco minutos.Repetir la agitación por vórtex cinco veces, cada una cada cinco minutos. Luego, centrifugar la muestra a la máxima velocidad durante 15 minutos a cuatro grados. A continuación, tomar el sobrenadante y centrifugar nuevamente para eliminar completamente los restos celulares.Diluya los lisados proteicos de uno a 50, y prepare una placa de 96 pocillos con el blanco, los patrones y las muestras diluidas. Mézclelos con la solución de Bradford en una proporción de uno a 20, espere 15 minutos a oscuras y mida la densidad óptica a 595 milímetros, y calcule la concentración de proteína utilizando los valores de absorbancia para cada muestra. Luego prepare las perlas para la acoplamiento del anticuerpo.Corte el extremo de una punta de 200 microlitros con tijeras y tome 25 microlitros de la suspensión de perlas para cada condición. Lave las perlas una vez con PBS, una vez con tampón RIPA y una vez con tampón RIPA que contenga inhibidores de proteasas. Después del último lavado, re suspenda las perlas en 300 microlitros de tampón RIPA que contenga inhibidores de proteasas y agregue 1,5 microgramos de anticuerpo específico para la proteína que desea inmunoprecipitar.Incube la mezcla de anticuerpo y perlas durante la noche a cuatro grados en un rotador. Después de la incubación, lave las perlas con tampón RIPA que contenga inhibidores de proteasas y cargue dos miligramos de lisado celular total de cada condición. Complete el volumen total hasta 300 microlitros con tampón RIPA que contenga inhibidores de proteasas e incube durante la noche en un rotador a cuatro grados.Luego, lave las perlas tres veces con tampón RIPA que contenga inhibidores de proteasas. Después del último lavado, utilizando una pipeta más pequeña, intente retirar todo el sobrenadante sin tocar las perlas. A continuación, agregue 10 microlitros de colorante de carga 3X.Para controlar la expresión endógena de proteínas que se verificarán en un experimento de co-inmunoprecipitación, prepare muestras de entrada utilizando al menos 100 microgramos de lisado proteico. Añada el volumen adecuado de tampón de carga 3X a cada muestra. Para desnaturalizar las muestras de inmunoprecipitación y los controles de entrada, hiérvalas a 95 grados durante 10 minutos.Luego, centrifugar y cargar las muestras en un gel de SDS para separar las proteínas según su tamaño mediante una transferencia western. Correr las muestras de proteínas en el gel de SDS y después transferir las proteínas a membranas de nitrocelulosa. Una vez finalizada la transferencia húmeda, bloquear la membrana de nitrocelulosa incubándola con una solución al 5 % de leche descremada durante una hora a temperatura ambiente en agitador.Luego, lave la membrana tres veces con solución PBS-Torin durante cinco minutos en el agitador a temperatura ambiente. Incube la membrana con el anticuerpo primario, específico para la proteína que desea detectar, durante una hora a temperatura ambiente. Puede preferir preparar los anticuerpos primarios en solución roja para reutilizarlos sin perder su calidad.Después de la incubación con el anticuerpo primario, repetir los pasos de lavado con PBS-Torin tres veces. A continuación, preparar la solución de anticuerpo secundario conjugado con HRP en leche descremada al 5 % e incubar con la membrana durante una hora a temperatura ambiente en agitación. Tras la incubación, repetir nuevamente los pasos de lavado.Luego prepare una solución ECL casera y coloque la membrana en una caja. A continuación, continúe con los pasos de revelado, tal como se describe en el texto en un diagrama completo. Después de fijar y secar la película, marque según los bordes de la membrana y la letra de la proteína para poder predecir la banda específica.Repita todos estos pasos de incubación con el anticuerpo seguidos de los procedimientos en cámara oscura para todas las proteínas cuya interacción desee comprobar. Luego analice los resultados. Aquí se muestra un resultado de inmunoprecipitación endógena obtenido de nuestro artículo reciente.En este video, se precipitó la proteína endógena ATG5 y se verificaron los niveles de co-inmunoprecipitación de RACK1 endógeno bajo diferentes condiciones. Al realizar estos procedimientos, es importante recordar incluir tantos repeticiones biológicas como sea posible, junto con controles positivos y negativos, con el fin de recopilar los niveles cuantificados de interacción tras diferentes tratamientos. El panorama general que proporcionan todas las réplicas biológicas se define como el patrón de interacción bajo diferentes condiciones.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo buscar las dinámicas de las interacciones proteína-proteína.

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Investigación

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