Name: Protocolo para HER2 de los pescados usando un fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol para combinar las ventajas de la criopreservación y la fijación de formalina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda un protocolo de fijación tisular sin entrecruzamiento ni formol para análisis FISH de HER2 en muestras de cáncer de mama. Este método preserva la morfología y la calidad del ARN para medicina personalizada.

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Agradecemos al equipo del laboratorio de patología molecular en el Instituto de patología de la Universidad médica de Graz por su experiencia y apoyo. Además, agradecemos a Iris Kufferath y Daniela Pabst para asistencia técnica, Bernadette Rieger y Sylvia Eidenhammer para el procesamiento de los casos HER2 como Kinga Szurian (patólogo) y Tamas Regényi (3DHISTEC). Agradecemos a Penelope Kungl para corregir el manuscrito. Este trabajo ha sido apoyado financieramente por el fondo de investigación Doppler cristiano, del Ministerio Federal austriaco de ciencia, investigación y economía y la Fundación Nacional para la investigación, tecnología y desarrollo.

El estudio fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad médica de Graz (referencia número 20-066), Austria. Se obtuvieron muestras de tejido de dos casos de cáncer de mama invasor primario resecado quirúrgicamente después de los pacientes habían dado consentimiento de informado escrita.
1. fijación de tejidos
Nota: El tejido es realizado ya sea con solución de formalina tamponada estándar (SBFS), definida como solución de formalina al 10% que contiene una fracción de masa del 3,7% (correspondiente a una fracción de volumen del 4%) formaldehído tamponado a pH 6.8 pH 7.2 según CEN/TS 16827-1:2015 o el sistema de fijación de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol (también conocido como la solución de fijación alternativo más abajo) que consta de un fijador y un estabilizador a temperatura ambiente (RT).
<ol>
	<li>Corte la pechuga de las muestras de tejido de cáncer con un bisturí estéril en dos mitades cada 4 mm de espesor para asegurar la cantidad adecuada de tejido. Utilizar un tamaño máximo 4 x 15 x 15 mm para fijación de tejidos NCFPE o SBFS.</li>
	<li>Colocar cada mitad de la muestra de tumor en una cinta de tejido estándar y sumérjalo en SBFS o la solución de fijación alternativos durante 24 h con un volumen por cociente del volumen (v/v) de 4 partes de fijador y el tejido de una parte (4 mL/1 g de tejido (idealmente 10 mL/1 g)).</li>
	<li>Transferir las muestras fijadas alternativamente en la solución de estabilizador para 2-72 h por abrir el contenedor, dando vuelta la cinta de tejido por 180° y sumergiéndola.</li>
	<li>Coloque las cintas de tejido con las muestras SBFS-fijo en 250 mL de etanol de 70% por 30 min a temperatura ambiente para eliminar residuos SBFS. Nota: Este paso es importante para evitar la contaminación SBFS no enlazan a la Cruz muestras tratadas con fijador en el procesador automatizado de tejidos, que destruirían las propiedades beneficiosas de fijadores no enlazan a la Cruz para la preservación de las biomoléculas. PRECAUCIÓN: SBFS es una solución peligrosa, causa irritación de la piel, daños oculares graves, puede provocar reacciones alérgicas de la piel, se sospecha de causar defectos genéticos, puede provocar cáncer, irritación respiratoria, somnolencia y causa daños a los órganos. El fijador alternativo es tóxico por inhalación, contacto con la piel y en caso de ingestión, irrita los ojos y la piel, peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación, contacto con la piel y por ingestión. Deben evitarse la inhalación y el contacto físico para ambas soluciones de fijación. Usar ropa protectora adecuada, guantes y protección facial y ocular. Trabajar en una campana de humos.</li>
	<li>Proceder al procesamiento de tejido, incrustar y tejido seccionado (secciones 2 y 3).</li>
</ol>
2. tejido procesamiento e incrustar
<ol>
	<li>Realizar la deshidratación gradual de cintas de tejido con las muestras de tejido fijo en 70% (2 x 15 min), 80% (30 min), 90% (60 min) y etanol al 99% (2 x 60 min), seguido de xileno (2 x 60 min). Luego infiltran con parafina en un procesador automatizado de tejido (4 x 45 min.).</li>
	<li>Utilizando pinzas, coloque las muestras deshidratadas y se infiltró en parafina (alternativamente y fijo SBFS) en moldes metálicos.</li>
	<li>Incrustar las muestras en parafina fundida de 5-10 mL (punto de solidificación 56-58 ° C) usando una inclusión en parafina del instrumento.</li>
	<li>Colocar los moldes sobre una placa de enfriamiento a-5 ° C por 30 minutos.</li>
	<li>Recuperar los bloques de tejido parafina-encajado de los moldes.</li>
	<li>Almacenar los bloques resultantes (alternativomente-fijo, parafina-encajado (NCFPE) y parafina-encajado SBFS-fijo (FFPE)) en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso.</li>
</ol>
3. tejido seccionado y diapositiva preparación de pescado
Nota: Secciones FFPE directamente se utilizan para los peces, mientras que diapositivas con secciones NCFPE después se fijan en SBFS durante 24 horas antes de procedimiento de pescado.
<ol>
	<li>Insertar la hoja de un solo uso en el microtomo y ajustar el micrótomo a 10 μm.</li>
	<li>Tome el primer bloque de la placa de enfriamiento e introdúzcalo en el instrumento.</li>
	<li>Recortar el bloque hasta conseguir una superficie uniforme. El micrótomo con un pincel de limpiar y ajustar a 3 μm. Deseche las primeras secciones de 2-3.</li>
	<li>Cortar 3 tramos de μm de bloques NCFPE y FFPE y colocarlos en un baño de agua fría (agua ultrapura). Nota: Para obtener mejores fotografías sin superposición de núcleos, aquí, imágenes de 2 secciones de μm en lugar de 3 a 5 μm como se recomienda en las instrucciones manufacturer´s se muestran.</li>
	<li>Recoja cada sección flotante con un pincel fino y una aguja sobre un portaobjetos recubierto para la adherencia de las secciones de tejido.</li>
	<li>Sumir este slide en un caliente (40 ° C) baño de agua y dejar que la sección estirar completamente.</li>
	<li>La sección vuelva a colocar la diapositiva tirando cuidadosamente de la diapositiva fuera del agua y evitar las arrugas.</li>
	<li>Deje que secar todas las secciones a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Calentar los portaobjetos a 70 ° C por 30 min en una incubadora para derretir la parafina.</li>
	<li>Poner los portaobjetos horizontalmente en un vaso jarra de tinción.</li>
	<li>Rehidratar las secciones paso a paso en RT en los recipientes de tinción llenan de 250 mL cada uno de los siguientes líquidos: xileno 100% 2 x 15 min, etanol al 96% 2 x 15 min, etanol al 90% 2 min, etanol al 80% 2 min, 2 min, 50% etanol etanol al 70% 2 min y agua destilada agua 2 x 10 min. PRECAUCIÓN: Realice los pasos de la parafina y rehidratación en una campana de humos, no inhalar solventes tóxicos volatilizados. Nota: Dependiendo de las secciones y tejido, puede ser necesario probar tiempos de incubación diferentes de antemano.</li>
</ol>
4. la fijación de las muestras NCFPE
<ol>
	<li>Realizar la fijación de los portaobjetos NCFPE ponerlos en una jarra de tinción nuevo llenada de SBFS durante 24 h en lugar de excelencia del tarro en una campana de humos durante el paso de 24 horas posteriores a la fijación.</li>
	<li>SBFS exceso quitar lavando con fosfato tampón salino (3 x 10 min) y (2 x 10 min) de agua destilada.</li>
</ol>
5. en situ hibridación de la fluorescencia (pescado)
Nota: Aquí los pescados se realiza utilizando la sonda de color dual HER2/CEN17 comercialmente disponible Kit según las instrucciones del fabricante. No permita que las secciones de tejido a secar durante la hibridación y lavado pasos. No permita que la sonda de ADN y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ADN contratinción las soluciones a ser expuesto a la luz durante un largo periodo. Realice estos pasos en la oscuridad utilizando recipientes resistente a la luz. Dependiendo de la edad y el paso de fijación de la muestra, aumentar o disminuir la desnaturalización y lavar a temperaturas para obtener mejores resultados de hibridación.
<ol>
	<li>Coloque una jarra de tinción que contenga 250 mL de solución de tratamiento previo de calor cítrico en un baño de agua de 98 ° C.</li>
	<li>El FFPE rehidratado y NCFPE post fijo se desliza en la jarra incube durante 15 minutos.</li></ol>No utilice más de 6 diapositivas por jarra de tinción.
	<li>Lave los portaobjetos en agua destilada por 3 min a temperatura ambiente en un frasco nuevo de tinción.</li>
	<li>De proteólisis, coloque los portaobjetos en un sistema de hibridación de temperatura controlada a 37 ° C.<ol>
		<li>Aplicar inmediatamente, lista para usar la solución de pepsina (2mg/ml) gota a gota (~ 30 μL por cada gota) a las secciones de tejido hasta que está completamente cubierto. Incubar durante 9 min a 37 ° C en el sistema de hibridación. Nota: Se recomienda un tiempo de incubación de 5-15 min. El momento óptimo para la proteólisis se debe determinar de antemano.</li>
		<li>Coloque los portaobjetos en un frasco que contiene el tampón de lavado SSC e incubar durante 5 minutos.</li>
		<li>Enjuague los portaobjetos en agua destilada por 1 min a TA.</li>
		<li>Realizar la deshidratación de las secciones de los siguientes alcoholes graduales: 50%, 70%, 90% y 100% por cada 1 min aire secan las secciones.</li>
		<li>Para hibridación, pipetee 10 μl de sonda HER2/CEN17 en las secciones de tejido seco, cubrir cada muestra con un cubreobjetos y sellar con pegamento de caucho. Nota: se recomienda 10 μl de sonda por 22 x 22 mm tejido de superficie. Un suave calentamiento de la sonda facilita el proceso de pipeteo. Evitar las burbujas y una exposición prolongada de la sonda a la luz.</li>
		<li>Desnaturalizar conjuntamente la sonda y la muestra de ADN en el sistema de hibridación a 75 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>El sistema de hibridación a 37 ° C e hibridar durante la noche.</li>
		<li>Retire con cuidado el cemento de goma con pinzas para la hibridación y detección.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos en un tinción tarro que contiene 37 º C previamente calentado x 1 Tampón de lavado A 5 minutos Retire los cubreobjetos.</li>
		<li>Lave los portaobjetos usando previamente calentado 1 x wash buffer A dos veces por 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Deshidratar el portaobjetos en etanol 70%, 90% y 100%, 1 min.</li>
		<li>Las muestras de aire en seco y proteger de la luz.</li>
		<li>Para la tinción, se aplican 30 μL solución de DAPI al área hibridizada evitando burbujas. Cubrir las secciones con un cubreobjetos.</li>
		<li>Incubar por 15 min, protegido de la luz.</li>
		<li>Para sacar el exceso de solución de DAPI presionando suavemente el portaobjetos entre papeles de filtro.</li>
		<li>Almacenar las diapositivas a 2-8 ° C en la oscuridad hasta por 2 semanas hasta evaluación por microscopía confocal.</li>
	</ol>
	</li>

6. confocal de imágenes y análisis de peces se desliza
<ol>
	<li>Realizar la proyección de imagen confocal y escaneo de las diapositivas en un confocal scanner digital equipado con un 40 x / 1.2 objetivo NA, filtros de banda cuádruple (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) y un 5.5Mpx, 16 bits, refrigerado por cámara de científico complementario de óxido metálico semiconductor (CMOS).</li>
	<li>Adquirir las imágenes con filtros verdes (excitación: 503 nm, emisión: 528 nm) y naranja (excitación: 547 nm, emisión: 572 nm) canales.</li>
</ol>
7. interpretación
Nota: La punta de prueba de HER2/CEN17 es una mezcla de una rojo marcado con fluorocromo CEN17 sonda específica para la región de alfa satélite centromérica del cromosoma 17 (D17Z1) y una verde marcado con fluorocromo HER2 sonda específica para el gen HER2 (sonda localización 17q12). Muestras de tumor con una relación de HER2:CEN17 ≤ 2,0 por núcleo se anotaron como normal, mientras que ésos con un HER2:CEN17 relación ≥2.0 se anotaron como amplificado17.
<ol>
	<li>Realizar análisis de calidad de las imágenes con el CaseViewer 2.120de código abierto.<ol>
		<li>Evaluar al menos 20 células que se encuentran en dos regiones diferentes del componente invasivo del carcinoma definido por un patólogo. Son claramente distinguibles núcleos bien distribuidos en el área de conteo. Excluir del conteo de las regiones de tejido en las zonas retraídas o exprimidas y límite.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. ARN calidad
<ol>
	<li>Extracción de ARN<ol>
		<li>Asegúrese de que todos los instrumentos y herramientas son libres de Rnasa. Utilice una solución de eliminación de Rnasa.</li>
		<li>Cortar secciones de 10 a 20 (5 μm de espesor) de muestras NCFPE o FFPE usando un micrótomo siguiendo el protocolo hasta el paso 3.8.</li>
		<li>Extracto de RNA de NCFPE kit de muestras mediante el aislamiento del RNA (véase la tabla de materiales). Extraiga el RNA de muestras FFPE usando un kit de aislamiento de RNA FFPE. Nota: Extracción de ARN de fijadores no enlazan a la Cruz requiere de un método de aislamiento adaptado al método de fijación. No use cualquier otro RNA método de aislamiento (por ejemplo Trizol, FFPE RNeasy, etc. para muestra NCFPE).</li>
		<li>Determinar la concentración de RNA y pureza utilizando un espectrofotómetro. La relación entre la absorbancia a 260 nm y 280 nm (A260/280) debe ser ~ 2.0.</li>
		<li>Guardar el ARN aislado a-70 ° C hasta su posterior análisis.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Realizar una gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en tiempo real transcripción reversa PCR usando las cartillas para generar amplicones de longitudes8,9.<ol>
		<li>Utilice un kit de transcripción inversa de cDNA acuerdo a manufacturer´s instrucciones para síntesis de cDNA. Uso 500 ng ARN de cada muestra. Almacenar el cDNA a-20 ° C hasta su uso posterior.</li>
		<li>Preparar la mezcla principal de PCR según las instrucciones de manufacturer´s.</li>
		<li>Pipetear la mezcla principal de PCR en triplicado en una placa de 384 pocillos de reacción. Añadir 4 μL de 1:16 diluida cDNA (plantilla PCR). Realizar la PCR según las instrucciones de manufacturer´s. Nota: Para GAPDH humana, se utilizaron los siguientes iniciadores: GAPDH adelante: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH inversa: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´ 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, bp 200 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, bp 277 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ y 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´.</li>
		<li>Analizar los resultados utilizando un software aplicable a la máquina de la polimerización en cadena. Productos no específicos deben ser excluidos basado en la fusión curva análisis21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+handling+and+specimen+preparation+in+surgical+pathology%3A+issues+concerning+the+recovery+of+nucleic+acids+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).</li>
</ol>

D.G. se emplea por Qiagen y tiene acciones o bonos holdings en plan de pensiones de la empresa. Los datos presentados en este manuscrito se refieren al sistema PAXgene de tejido, que ha sido desarrollado en un esfuerzo conjunto por Qiagen y PreAnalytiX. QIAGEN es socio industrial del laboratorio Doppler cristiano financiados con fondos públicos de investigación de la muestra biológica y las tecnologías de biobancos. Todos los autores tienen ningún conflicto de intereses y no intereses financieros que compiten.

Los resultados muestran dos resultados claves. En primer lugar, un paso de la fijación simple 24 h SBFS de secciones cortadas de los tejidos NCFPE es suficiente para obtener resultados equivalentes a los FFPE en análisis de peces utilizando pescado ensayos aprobados para los tejidos FFPE (véase también la referencia14). Este protocolo tiene la ventaja de utilizar ensayos de peces originalmente desarrollado y aprobado para FFPE sin necesidad de revalidación global (por ejemplo, mediante la optimización de las condiciones de la hibridación de tejidos no-cruz-ligado). El protocolo de pescado puede usarse exactamente como se describe en las instrucciones del fabricante.
Pequeñas modificaciones de las instrucciones de manufacturer´s que se describe en este resultado de protocolo (por ejemplo tejido sección diámetro incubación períodos y en los pasos de parafina) de anteriores adaptaciones, explícitamente recomendado por el fabricante debido al uso de tejidos diferentes tipos y métodos de fijación.
El paso de la fijación es crítico porque requiere un tiempo de reacción química de 18-24 h, que se extiende el tiempo de análisis por un día pero que permite el mismo flujo de trabajo diario, desarrollado para los tejidos FFPE (figura 1). SBFS se divulga para penetrar el tejido a una tasa promedio de 1 mm por hora22 a 5 mm en 2 h según el tipo de tejido23,24. La observación de que sólo la fijación prolongada de más de 18 h puede cambiar las propiedades de NCFPE secciones FFPE, indica que no la penetración de este fijador pero el tiempo de reacción química es fundamental para lograr los resultados deseados1 ,14.
En segundo lugar, el tejido restante de NCFPE que no se utiliza para la fijación puede utilizarse para otros análisis moleculares como las biomoléculas están bien conservadas. Esto fue demostrado por transcripción reversa en tiempo real PCR (figura 3). El ensayo es más sensible y específico que el electroferograma deriva valor RIN (número de integridad del RNA) con respecto a la calidad del RNA (es decir, modificación química y fragmentación) para mRNA aislado de tejidos parafina-encajado8. Control de calidad se limita en este estudio a la PCR en tiempo real ya que los grupos independientes han demostrado que además de RNA, la calidad del ADN y las proteínas aisladas de NCFPE es mejor que la de FFPE tejidos 8,9, 13.
El protocolo presentado sigue, en su caso (por ejemplo, receta SBFS, las condiciones de fijación, control de calidad de RNA, validación), los requisitos de las especificaciones técnicas del CEN para procedimientos pre-analíticos para el diagnóstico in vitro (IVD), que han sido liberados recientemente por el Comité Europeo de normalización (CEN) (e.g. CEN/TS 16827-1:2015 para el aislamiento del RNA de tejidos FFPE que se refiere a la norma ISO 15189).
El método se limita a este fijador específico. Aunque la buena preservación de las biomoléculas y morfología mediante el fijador no enlazan a la Cruz, libre de formol se ha presentado en varios estudios, se utiliza principalmente en la investigación pero no en aplicaciones médicas rutinarias. Una de las razones es que cambiar el estándar de oro SBFS fijación por otro fijador requeriría una variedad de estudios de validación como no todos los protocolos optimizados para material FFPE pueden ser utilizados para materiales con fijadores no enlazan a la Cruz. No se probaron otros métodos de fijación de tejido para este protocolo de pesca.
El paso de posteriores a la fijación simple que se describe en este manuscrito tiene la ventaja de utilizar ensayos de IVD aprobado tanto para tejidos FFPE y NCFPE.

Medicina personalizada depende cada vez más pruebas de múltiples parámetros que involucran análisis morfológicos y moleculares de los tejidos. Fijación con formalina de los tejidos como el estándar de oro proporciona excelente calidad morfológica1,2. Sin embargo, modificación química inducida de formol y cross-linking de proteínas y ácidos nucleicos3,4,5 negativamente interfiere con el análisis molecular6. Estas modificaciones moleculares limitar la calidad de los ácidos nucleicos y proteínas y puede resultar en gene secuencia artefactos7 o disminución de la sensibilidad de la reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena)-basado en análisis8. Aunque se obtuvieron grandes esfuerzos para optimizar las pruebas moleculares para tejido FFPE, crio-preservación de los tejidos es en general superior a la fijación de formalina, lo que es necesario dividir las muestras de tejido para los procedimientos de conservación diferentes. Para evitar la necesidad de criopreservación para análisis moleculares, un no-cross-linking, fijador libre de formol, PAXgene tejido fue desarrollado. Este sistema comercialmente disponible consiste en una fijación y una solución de estabilización que contiene diversos alcoholes, ácido acético y un compuesto orgánico soluble. Adecuada preservación de los ácidos nucleicos, las proteínas (phospo) y la morfología fue demostrado en varios estudios6,9,10,11,12,13.
Una particular aplicación en el diagnóstico de cáncer es detectar una amplia gama de alteraciones cromosómicas, translocaciones, deleciones submicroscópicas y amplificaciones 14peces. Por ejemplo, 20% de los tumores de cáncer de mama invasivo muestran amplificación del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) gene15,16,17, que se asocia a pronóstico pobre18 ,19. Determinación del estado de la sobreexpresión y amplificación de HER2 en cáncer de mama por los peces es necesario para seleccionar a pacientes para la terapia anti-HER2-dirigida y es un complemento diagnóstico enumerado por la Asociación Federal de drogas (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. Para permitir una amplia aplicación de diagnósticos de compañero a base de pescado en la atención sanitaria, ensayos fueron desarrollados y aprobados para los tejidos FFPE.
En un estudio previo, demostró que los tejidos NCFPE no pueden utilizarse para ensayos de peces que han sido aprobados para el tejido FFPE. Sin embargo, las pruebas de tiempo serie de post diferentes métodos de fijación de los tejidos NCFPE con 4% tamponada formaldehído demostrada que publicar tiempos de fijación de h 18 o más de las secciones de tejido NCFPE lograr resultados equivalentes a los de los tejidos FFPE14.
En este estudio, proporcionar un protocolo detallado y demostrar el impacto de fijación y 24 h el tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol 4% tamponada con posteriores a la fijación formaldehído en secciones de calidad FISH HER2 y el ARN de la misma muestra de tejido primario.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig1.jpg"> 
Figura 1: diagrama que muestra los pasos para en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) y análisis de ARN de formalina fijada parafina incrustado (FFPE) y la vinculación de cruz no, libre de formol fija parafina encajados los tejidos (NCFPE). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Alemania</td><td>www.sav-lp.de</td><td>FN-200L-4-1</td><td>Fijador de tejidos</td></tr><tr><td>Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canadá</td><td>www.simport.com</td><td>M-498 Dispositivo de</td><td>conservación que proporciona etiquetado, fijación e inclusión en parafina para muestras de tejidos.</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Alemania</td><td>www.qiagen.com</td><td>765112</td><td>Para la recolección, fijación y estabilización de muestras de tejido: 10 contenedores de reactivos prellenados, que contienen PAXgene Tissue FIX y PAXgene Tissue STABILIZER.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com</td><td></td><td>813150</td><td>Procesamiento de muestras biológicas desde la fijación química hasta la infiltración de parafina</td></tr><tr><td>Merck Millipore, Múnich, Alemania</td><td>www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html</td><td>MC1009834000</td><td>Deshidratación de muestras de tejido</td></tr><tr><td>VWR Chemicals, Darmstadt, Alemania</td><td>https://at.vwr.com</td><td>10293EP</td><td>Deshidratación de muestras de tejido</td></tr><tr><td>ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Viena, Austria</td><td>www.herba-chemosan.at</td><td>2549662 32</td><td>Parafina utilizada en un dispositivo de procesamiento de tejidos</td></tr><tr><td>Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Viena, Austria</td><td>www.LeicaBiosystems.com</td><td>39602004</td><td>Medio de inclusión de parafina</td></tr><tr><td>Sanova Diagnostik, Viena, Austria</td><td>www.sanova.at</td><td>5229</td><td>Instrumento de inclusión de parafina para tejidos para histología</td></tr><tr><td>Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria</td><td>www.histocom.info</td><td>M 910010</td><td>Este dispositivo se utiliza para técnicas de corte de parafina especialmente sofisticadas en biología y medicina. Solo el personal calificado o especialmente capacitado debe operar el micrótomo, es decir, sujetar la muestra, recortar, seccionar y quitar las secciones del instrumento.</td></tr><tr><td>Dako Denmark A/S, Glostrup, Dinamarca</td><td>www.chem.agilent.com</td> portaobjetos de vidrio recubierto <td>de K802021-2</td><td>, destinados al montaje de secciones de tejido fijadas en formol e incrustadas en parafina.</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Alemania</td><td>www.qiagen.com</td><td>73504</td><td>Para la purificación de ARN total a partir de secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Alemania</td><td>www.qiagen.com</td><td>765134</td><td>Para la purificación de ARN total a partir de secciones de tejido fijadas en PAXgen e incluidas en parafina</td></tr><tr><td>ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Alemania</td><td>www.zytovision.com</td><td>Z-2015-200</td><td>Para la detección del gen ERBB2 (también conocido como HER2), la amplificación se observa con frecuencia en neoplasias malignas sólidas, por ejemplo, muestras de cáncer de mama.</td></tr><tr><td>3DHISTEC, Budapest, Hungría</td><td>www.3dhistech.com Dispositivo</td><td></td><td>digital para escanear portaobjetos de tejido equipado con un objetivo de 40x/1.2 NA, filtros de cuatro bandas (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) y una cámara científica CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) refrigerada de 5.5Mpx, 16 bits.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com</td><td></td><td>4368814</td><td>El kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad contiene todos los componentes necesarios para la conversión cuantitativa de hasta 2 &; g de ARN total a ADNc monocatenario en un solo 20 &micro; L reacción.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4367659</td><td>mezcla maestra de PCR que contiene polimerasa, nucleótidos y SYBR Green para PCR y cuantiificación de amplicones.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE</td><td>www.thermofisher.com</td><td>Ser. Nr. F239</td><td>Espectrofotómetro para la cuantificación de ácidos nucleicos.</td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 7 Flex</td><td>www.thermofisher.com</td><td>máquina de</td><td>PCR 4485701,</td></tr> <tr><td>Laboratorios Vysis/Abbott. Abbott Park, Illinois, EE. UU.</td><td>www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order</td><td>e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 Sistema de procesamiento de</td><td>portaobjetos con control de temperatura para procedimientos de desnaturalización/hibridación in situ.</td></tr></tbody></table>

protocolo para her2 de los pescados usando un fijador de tejido no enlazan a la cruz, libre de formol para combinar las ventajas de la criopreservación y la fijación de formalina

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Evaluación morfológica de muestras de tejidos formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) ha sido el estándar de oro para el diagnóstico de cáncer durante décadas debido a su excelente conservación de la morfología. Medicina personalizada proporciona cada vez más terapias individualmente adaptadas y dirigidas para caracterizadas enfermedades individuales habilitadas por tecnologías combinadas de análisis morfológicas y moleculares y diagnóstico. Realización de análisis morfológicos y moleculares de la misma muestra FFPE es difícil debido al impacto negativo de formalina por modificación química y cross-linking de proteínas y ácidos nucleicos. Un fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol se ha desarrollado recientemente para cumplir con ambos requisitos, es decir, para preservar la morfología como FFPE y biomoléculas como criopreservación. Puesto que los peces se requieren a menudo en combinación con la histopatología y diagnóstico molecular, probamos la aplicabilidad de los protocolos de pescado sobre los tejidos tratados con este nuevo fijador. Se encontró la fijación de formalina de secciones histológicas de no-cross-linking, libre de formol y embebido en parafina (NCFPE) mama cáncer tejido generado resultados equivalentes a los tejido FFPE en receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) Análisis de los pescados. Este protocolo describe cómo se puede utilizar un ensayo FISH originalmente desarrollado y validado para tejido FFPE para tejidos NCFPE por un simple paso de posteriores a la fijación de las secciones histológicas.

Determinación de HER2 FISH:
Las intensidades de la señal de HER2-peces de FFPE y NCFPE son similares (figura 2). Ambos casos en la mayoría de las células muestran un claro exceso de la señal verde (indicativo de lo locus de gen HER2 amplificado) en comparación con la señal roja (CEN17 gen de referencia). Por lo tanto, el caso demuestra un gen HER2 amplificado, que significa que este paciente se espera responder a trastuzumab, una terapia anti-HER2 dirigidos. La muestra FFPE sirvió como control positivo. Las señales observadas en células no neoplásicas (tanto en FFPE y NCFPE) sirven como referencia interna y el control negativo de amplificación del gen HER2. Para cada serie de análisis, puede usarse al menos una sección con el estado de la amplificación del gen conocido como control positivo para la reacción de hibridación.
Calidad de ARN:
FFPE correspondiente y NCFPE muestras de dos casos diferentes muestran diferencias en la calidad de RNA por medio de transcripción reversa en tiempo real PCR. Resultados obtenidos muestran eficiencias de amplificación diferentes para productos diferentes longitudes (es decir, 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) del mRNA de GAPDH. Todos los valores de Ct (ciclo umbral) obtenidos de muestras FFPE fueron superiores a los de NCFPE. Esta diferencia demuestra el amplificability PCR menor de mRNA aislado de tejidos FFPE, sugiriendo una modificación química más pronunciada. Además, los valores de Ct mayores para largo en comparación con amplicones corto son un indicador de fragmentación de mRNA. En comparación, las pistas de valor de Ct de las longitudes de distintos amplicones muestra más pronunciada fragmentación de mRNA en FFPE que los tejidos NCFPE (figura 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2.jpg"> 
Figura 2: resultados representativos de peces HER2 para correspondiente formalina fijada parafina incrustado (FFPE) y parafina fijo no enlazan a la Cruz, libre de formol incorporado secciones de tejido (NCFPE). Muestras correspondientes de los mismo tejidos FFPE (A) y NCFPE (B) se muestran. En contraste con las células de interfase normal (C), donde se esperan dos señales de (CEN17) rojas y dos verdes (HER2), células con Lugar geomtrico del gene HER2 amplificado representan copias múltiples de señales verdes (HER2) (D). Estado de amplificación de HER2 fue idéntica en ambos FFPE y la posterior fijo NCFPE (A, B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig3.jpg"> 
Figura 3: resultados de un ensayo PCR de transcripción reversa en tiempo real utilizado para control de calidad de RNA. Eje y: Valores de Ct (ciclo umbral) del gen GAPDH se muestran productos diferentes longitudes (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) en el eje x. mRNA fue aislada de FFPE y NCFPE de dos muestras de tejido de cáncer mama diferentes procesados en paralelo y transcrito a cDNA por PCR. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Hibridación in situ de la fluorescencia (pescado) se requiere a menudo en combinación con la histopatología y el diagnóstico molecular para la selección del tratamiento en la medicina personalizada. Fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol novedoso que permite alta calidad morfológica, molecular y análisis de peces de la misma muestra por adición de un paso de la fijación antes de pescado se presenta.

Protocolo para HER2 de los pescados usando un fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol para combinar las ventajas de la criopreservación y la fijación de formalina

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

La medicina personalizada requiere distintos tipos de análisis, desde la histología clásica hasta el análisis molecular, y se realizan diversas técnicas in situ sobre un tumor para seleccionar la mejor terapia. Las técnicas de investigación permiten aplicar varias tecnologías analíticas a partir de una única muestra. Aquí demostramos que, mediante el uso de un fijador que no genera enlaces cruzados en el sencillo paso de postfijación con formalina, es posible utilizar protocolos originalmente desarrollados y validados para materiales fijados con formalina e incluidos en parafina, a partir de muestras celulares, obteniendo buena morfología, calidad adecuada de ARN y buenos resultados para hibridación in situ completa.Las condiciones típicas de hibridación no son adecuadas para tejidos fijados sin formalina a fin de obtener resultados de FISH. Demostramos que no es la penetración, sino el tiempo de corrección química, lo que resulta fundamental para lograr resultados de FISH comparables a partir de tejido fijado con pectina. Solo la sección utilizada para FISH se fija formal y posteriormente.El tejido fijado sin formalina restante permite un análisis molecular superior en comparación con el tejido FFP, como se ha demostrado mediante RTPCR. El procedimiento que demostró Daniela Pabst, la técnica de mi laboratorio. Para comenzar, corte las muestras de tejido de cáncer de mama con un escalpelo estéril en dos mitades, cada una de cuatro milímetros de grosor para asegurar una cantidad adecuada de tejido.Utilice un tamaño máximo de 4x15x15 milímetros para la fijación mediante solución estándar de formalina tamponada, o mediante un método alternativo de fijación tisular sin entrecruzamiento y libre de formalina. Coloque una mitad de la muestra tumoral en una caja de tejido estándar y sumérjala en SBFS. Coloque la otra mitad de la muestra tumoral en la solución de fijación alternativa durante 24 horas con una relación volumen por volumen de cuatro partes de fijador y una parte de tejido.Luego, transfiera las muestras fijadas alternativamente a la solución estabilizadora durante dos a 72 horas abriendo el recipiente, girando el casete de tejido 180 grados e introduciéndolo. A continuación, coloque los casetes de tejido con las muestras fijadas con SBFS en un recipiente lleno con etanol al 70 % durante 30 minutos a temperatura ambiente para eliminar el SBFS residual. Tras el procesamiento e inclusión del tejido según se describe en el protocolo escrito, utilice un microtomo para cortar secciones de tres micrones de bloques FFPE y NCFPE.Coloque algo de cada tipo de sección en un baño de agua fría. Tome la sección flotante con un pincel fino sobre un portaobjetos para microscopio y transfiérala a un baño de agua tibia. Vuelva a tomar las secciones extendidas con el pincel y colóquelas sobre el portaobjetos sin arrugas.También prepárese para el aislamiento de ARN para realizar la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscriptasa en la misma muestra colocando una parte de cada tipo de corte en un vial de reacción. Para la desparafinización de los cortes de tejido, hidratamos los cortes paso a paso a temperatura ambiente en frascos de tinción con 250 mililitros de diferentes reactivos. Primero coloque los cortes en xileno al 100% dos veces durante 15 minutos, luego transfiera los cortes a etanol al 96% dos veces durante 15 minutos.A continuación, pase las secciones a porcentajes progresivamente menores de etanol, incubando cada solución durante dos minutos. Finalmente, transfiera las secciones a agua destilada dos veces durante 10 minutos. Realice la post-fijación de las laminillas de NCFPE colocándolas en un frasco de tinción nuevo lleno con SBFS durante 24 horas a temperatura ambiente.Deje el frasco en la campana extractora durante el paso de postfijación de 24 horas. Sorprendentemente, todos los tiempos de postfijación superiores a 18 horas dieron resultados similares a los obtenidos con material fijado en formaldehído y parafina. Elimine el exceso de SPFS de los portaobjetos lavándolos en solución salina tamponada con fosfato durante 10 minutos, tres veces.Continúe con el segundo lavado en agua destilada durante 10 minutos, dos veces. A continuación, coloque el frasco de tinción que contiene 250 mililitros de solución citrato para pretratamiento térmico en un baño de agua a 98 grados celsius. Coloque los portaobjetos de FFPE hidratados y post-fijados en NCFPE dentro del frasco e incube durante 15 minutos.Luego, lave los portaobjetos con agua destilada durante tres minutos a temperatura ambiente en un frasco de tinción nuevo. Para la proteólisis, coloque los portaobjetos en una hibridación con control de temperatura a 37 grados celsius. Aplique inmediatamente la solución de pepsina lista para usar gota a gota sobre las secciones de tejido hasta que queden completamente cubiertas.Luego, incubar durante nueve minutos a 37 grados Celsius en el sistema de hibridación. A continuación, colocar los portaobjetos en un frasco que contiene tampón de lavado SSC e incubar durante cinco minutos. Colocar los portaobjetos en agua destilada durante un minuto a temperatura ambiente.Realice la deshidratación de las secciones en una serie de alcoholes graduados, durante un minuto cada uno. Posteriormente a la serie de deshidratación, seque al aire las secciones. Para la hibridación, agregue mediante pipeta 10 microlitros de la sonda combinada de HER2 y sun 17 sobre las secciones de tejido secas, cubra cada muestra con un cubreobjetos y séllela con cemento de caucho.Desnaturalice el ADN de la sonda y del espécimen en el sistema de hibridación a 75 grados celsius durante 10 minutos. El sistema de hibridación disminuye automáticamente a 37 grados celsius, y la hibridación continúa durante la noche. Al día siguiente, retire cuidadosamente el cemento de caucho y también los cubreobjetos con pinzas para la post-hibridación y protección.Incube los portaobjetos en un frasco de tinción que contenga tampón A 1X precalentado a 37 °C durante cinco minutos. A continuación, lave los portaobjetos con tampón de lavado 1X precalentado, dos veces durante cinco minutos a 27 °C. Luego deshidrate los portaobjetos en etanol al 70 %, 90 % y 100 %, un minuto en cada concentración.Seque las muestras al aire y protéjalas de la luz. Para la tinción, aplique 30 microlitros de solución de DAPI en el área hibridada, evitando burbujas. Cubra las secciones con una lámina de cobre antes de incubarlas durante 15 minutos, protegidas de la luz.Retire cuidadosamente el exceso de solución de DAPI presionando suavemente la laminilla entre papeles filtro. Almacene las laminillas entre dos y ocho grados celsius en la oscuridad durante hasta dos semanas antes de su evaluación mediante microscopía confocal. Adquiera las imágenes utilizando filtros para los canales verde y naranja.Continúe con la interpretación de los datos y la evaluación de la calidad del ARN según se describe en el protocolo escrito. Aquí se muestra la comparación directa del resultado obtenido a partir de la muestra formalina-fijada y la muestra fijada sin reticulación que ha sido postfijada. Las señales tienen una intensidad similar, y el fondo también es similar.En células normales en interfase, hay un número igual de señales rojas y verdes correspondientes al locus HER2 y al locus de referencia cen 17, lo que indica que no existe amplificación en el gen HER2. Aquí se muestra el resultado de otro caso en el que el gen HER2 está amplificado, y hay una señal mucho más intensa y amplia para el locus HER2 que para el gen de referencia. Este fenómeno es evidente tanto en el tejido fijado formal y fijado como en el tejido fijado sin entrecruzamiento.Este gráfico muestra la eficacia de amplificación para las diferentes longitudes de amplicón del ARNm de GAPDH. Para el formaldehído, se necesitan aproximadamente 23 ciclos, y para el material fijado sin entrecruzamiento, esto disminuye a 20 ciclos. La diferencia se hace más evidente en amplicones más largos, lo que indica que tanto la fragmentación como la modificación química se reducen notablemente al usar fijadores sin entrecruzamiento.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se puede utilizar una clave aprobada por la FDA para material FFPN en tejido fijado sin entrecruzamiento, mediante la adición de un sencillo paso de postfijación en el procedimiento preanalítico. La principal ventaja de esta técnica es que solo se postfija con formalina la sección utilizada para la hibridación in situ de sentido completo, mientras que el resto del bloque se fija en un fijador sin entrecruzamiento y, por lo tanto, puede utilizarse para un amplio espectro de análisis moleculares. Este protocolo es particularmente útil en el contexto de la medicina personalizada moderna, cuando deben realizarse múltiples análisis a partir de tumores relativamente pequeños y no es factible procesar especímenes de tejido según diferentes protocolos.Además, el uso de un fijador no entrecruzante tiene la ventaja de que conserva propiedades del tejido como la criopreservación. Esto evita la necesidad de utilizar nitrógeno líquido en estado de congelación y de mantener una cadena de enfriamiento en un contexto químico. Estas diferencias en la calidad del ARN no son evidentes, por lo que al utilizar ensayos clásicos de control de calidad del ARN, como los números de integridad del ARN, estos ensayos no son completamente informativos sobre la calidad del ARN aislado de material fijado e incluido en parafina.

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