Protocolo para HER2 de los pescados usando un fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol para combinar las ventajas de la criopreservación y la fijación de formalina

La medicina personalizada requiere de los diferentes tipos de análisis, desde la histología clásica hasta el análisis molecular, y se realizan diversas técnicas in-situ sobre un tumor para seleccionar la mejor terapia. Las técnicas de investigación permiten diversas tecnologías analíticas a partir de una sola muestra. Demostramos aquí, mediante el uso de un fijador no reticulante en el paso simple de posfijación con formalina, que se pueden usar protocolos originalmente desarrollados y validados para material incrustado en parafina formal y fija, que se pueden usar a partir de la muestra celular que produce una buena morfología, una buena calidad de ARN y buenos resultados para una hibridación in situ con sentido más completo.

Las condiciones típicas de hibridación no son apropiadas para que los tejidos fijos sin formalina generen resultados de FISH. Revelamos que no es la penetración, sino el tiempo de corrección química lo que es crítico para lograr resultados FISH comparables a partir de tejido fijado con pectina. Solo la sección utilizada para FISH es formal y fija a posteriori.

El resto del tejido fijo sin formalina permite un análisis molecular superior en relación con el tejido FFP, como lo demuestra RTPCR. El procedimiento que demostramos con Daniela Pabst, la técnica de mi laboratorio. Para comenzar, corte las muestras de tejido de cáncer de mama con un bisturí estéril en dos mitades, cada una de cuatro milímetros de grosor para garantizar una cantidad adecuada de tejido.

Utilice un tamaño máximo de 4x15x15 milímetros para la fijación a través de una solución de formalina tamponada estándar, o mediante una fijación de tejido alternativa sin formalina y sin reticulación. Coloque la mitad del espécimen tumoral en un casete de tejido estándar y sumérjalo en SBFS. Coloque la otra mitad del espécimen tumoral en la solución de fijación alternativa durante 24 horas con una relación volumen-volumen de cuatro partes de fijador y una parte de tejido.

Luego, transfiera las muestras fijadas alternativamente a la solución estabilizadora durante dos a 72 horas abriendo el recipiente, girando el casete de tejido 180 grados y sumergiéndolo. A continuación, coloque los casetes de tejido con las muestras fijadas en SBFS en un recipiente lleno de etanol al 70% durante 30 minutos a temperatura ambiente para eliminar los SBFS residuales. Después del procesamiento y la inclusión de tejidos como se describe en el protocolo de texto, use un micrótomo para cortar secciones de tres micras de bloques FFPE y NCFPE.

Coloque un poco de cada tipo de sección en un baño de agua fría. Recoja la sección flotante con un pincel fino en un portaobjetos de microscopio fino y transfiéralo a un baño de agua tibia. Vuelva a recoger las secciones estiradas con el pincel en el portaobjetos del microscopio sin arrugas.

También prepare el aislamiento de ARN para realizar una PCR con transcripción inversa en la misma muestra colocando parte de cada tipo de sección en un vial de reacción. Para la desparafinación de secciones de tejido, hidratamos las secciones de forma escalonada a temperatura ambiente en los frascos de tinción con 250 mililitros de diferentes reactivos. Primero coloque las secciones en xileno al 100% dos veces durante 15 minutos, luego transfiera las secciones a etanol al 96% dos veces durante 15 minutos.

A continuación, mueva las secciones a través de porcentajes incrementalmente más bajos de etanol, incubando cada solución durante dos minutos. Finalmente, transfiera las secciones a destilado dos veces durante 10 minutos. Realice la posfijación de los portaobjetos de NCFPE colocándolos en un nuevo frasco de tinción lleno de SBFS durante 24 horas a temperatura ambiente.

Deje el frasco en la campana extractora durante las 24 horas posteriores a la fijación. Sorprendentemente, todos los tiempos de post-fijación superiores a 18 horas dieron resultados similares a los obtenidos con el material de parafina formal y fija. Retire el exceso de SPFS de los portaobjetos lavándolos con solución salina tamponada con fosfato durante 10 minutos tres veces.

Siga con el segundo lavado en agua destilada durante 10 minutos dos veces. A continuación, coloque el frasco de tinción que contiene 250 mililitros de solución de pretratamiento térmico cítrico en un baño de agua a 98 grados centígrados. Coloque el FFPE hidratado en portaobjetos NCFPE postfijados en el frasco e incube durante 15 minutos.

Luego, lave los portaobjetos en agua destilada durante tres minutos a temperatura ambiente en un frasco de tinción nuevo. Para la proteólisis, coloque los portaobjetos en una hibridación a temperatura controlada a 37 grados centígrados. Aplique inmediatamente la solución de pepsina lista para usar gota a gota en las secciones de tejido hasta que estén completamente cubiertas.

Luego, incubar durante nueve minutos a 37 grados centígrados en el sistema de hibridación. A continuación, coloque los portaobjetos en un frasco que contenga tampón de lavado SSC e incube durante cinco minutos. Coloque los portaobjetos en agua destilada durante un minuto a temperatura ambiente.

Realice la deshidratación de las secciones en una serie de alcoholes graduados, cada uno durante un minuto. Después de la serie de deshidratación, seque las secciones al aire. Para la hibridación, pipetee 10 microlitros de la sonda combinada HER2 y sun 17 en las secciones de tejido seco, cubra cada muestra con un cubreobjetos y séllela con cemento de caucho.

El código desnaturaliza la sonda y el ADN de la muestra en el sistema de hibridación a 75 grados centígrados durante 10 minutos. El sistema de hibridación disminuye automáticamente a 37 grados centígrados y la hibridación continúa durante la noche. Al día siguiente, retire con cuidado el cemento de goma y los cubreobjetos también con pinzas para la posthibridación y protección.

Incubar los tamaños en un frasco de tinción que contenga 37 grados centígrados de tampón 1X A precalentado durante cinco minutos. A continuación, lave los portaobjetos con un tampón de lavado 1X precalentado dos veces durante cinco minutos a 27 grados centígrados. A continuación, deshidrate los portaobjetos en etanol al 70%, 90% y 100% en un minuto para cada concentración.

Seque las muestras al aire y protéjalas de la luz. Para la tinción, aplique 30 microlitros de solución DAPI en el área hibridada, evitando burbujas. Cubra las secciones con un cubreobjetos antes de incubar las secciones durante 15 minutos, protegidas de la luz.

Retire con cuidado el exceso de solución DAPI presionando suavemente el portaobjetos entre los papeles de filtro. Guarde los portaobjetos a una temperatura de entre dos y ocho grados centígrados en la oscuridad durante un máximo de dos semanas hasta que se evalúen mediante microscopía confocal. Adquiere las imágenes con filtros para canales verde y naranja.

Proceda a la interpretación de los datos y a la evaluación de la calidad del ARN tal y como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestra la comparación directa del resultado obtenido de la muestra formal y fija, y la muestra fija no reticulante que ha sido postfijada. Las señales son de intensidad similar y el fondo también es similar.

En las células normales de interfase, hay un número igual de señales rojas y verdes correspondientes al locus HER2 y al locus de referencia sen 17, lo que demuestra que no hay amplificación en el gen HER2. Aquí se muestra el resultado de otro caso en el que el gen HER2 se amplifica, y hay una señal mucho más fuerte y amplia para el locus HER2 que para el gen de referencia. Este fenómeno es evidente en el tejido fijo formal y fijo, y en el tejido fijo no reticulado.

Este gráfico muestra la eficacia de amplificación para las diferentes longitudes de amplicón del ARNm de GAPDH. Para la formalina, se necesitan alrededor de 23 ciclos, y para el material fijo no reticulante, esto se reduce a 20 ciclos. La diferencia se hace más evidente en amplicones más largos, lo que indica que tanto la fragmentación como la modificación química se reducen notablemente mediante el uso de fijadores no reticulantes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se puede usar una clave aprobada por la FDA para material FFPN en material fijo no reticulante agregando un simple paso de posfijación en el procedimiento preanalítico. La principal ventaja de esta técnica es que solo la sección utilizada para la hibridación in situ de sentido completo es para la postfijación con formalina, mientras que el bloque restante se fija en el fijador no reticulado y, por lo tanto, se puede utilizar para un amplio espectro de análisis molecular. Este protocolo es particularmente útil en el contexto de la medicina personalizada moderna cuando se deben realizar múltiples análisis a partir de tumores relativamente pequeños y no es factible procesar muestras de tejido para diferentes protocolos.

Además, el uso de un fijador no reticulante tiene la ventaja de que conserva las propiedades del tejido, como la criopreservación. Esto evita la necesidad de congelar nitrógeno líquido y mantener una cadena de enfriamiento en un contexto químico. Estas diferencias en la calidad del ARN no son obvias, por lo que cuando se utilizan ensayos clásicos de control de calidad del ARN, como los números de integridad del ARN, ya que estos ensayos no son completamente formativos en la calidad del ARN aislado de material fijo e incluido en parafina.