Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario En Utero Electroporación

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

El objetivo general de este procedimiento es observar directamente las neuronas que migran radialmente en un cultivo de cortes organotípicos preparado a partir de un cerebro embrionario electroporado mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Este método puede ayudar a estudiar aspectos clave del desarrollo del neocórtex. Permite investigar los mecanismos moleculares implicados en la polarización de las neuronas y la migración radial de las neuronas a su posición final dentro del cerebro.

La principal ventaja de esta técnica es que se pueden analizar las propiedades dinámicas de las neuronas migratorias, incluidos los perfiles de velocidad, la velocidad media de migración y los cambios de dirección migratoria. Comience colocando una rata embarazada debidamente anestesiada en posición supina sobre una placa de calentamiento. Compruebe la ausencia del reflejo del pedal.

Y luego, cubra cuidadosamente los ojos con vaselina para evitar que se sequen. A continuación, extienda suavemente las extremidades y fíjelas a la placa calefactora con cinta quirúrgica. Esterilice el abdomen frotando con etanol al 70% seguido de una solución de yodo, luego coloque una gasa estéril, en la que se ha hecho un corte para la incisión abdominal, sobre el abdomen.

Humedecer la gasa con una solución bacteriostática de cloruro de sodio. Después de reevaluar el desarrollo de la anestesia quirúrgica, por pérdida del reflejo pedal, se utilizaron pinzas micro Adson dentadas y tijeras finas en ángulo para cortar la piel aproximadamente 1,5 centímetros a lo largo de la línea media del abdomen. Luego, corta el músculo subyacente a lo largo de la línea alba.

Sujete el cuerno uterino entre los embriones con pinzas anulares y colóquelo suavemente sobre la gasa humedecida sin perturbar las placentas ni los vasos irrigadores. Luego, coloque cuidadosamente un embrión para dar una visión clara del ventrículo lateral que se presenta como una sombra en forma de media luna paralela al seno sagital. El lugar de la inyección se encuentra en el centro de una línea entre el ojo pigmentado y la confluencia de los senos paranasales, donde el seno sagital se ramifica a dos senos de transferencia.

Una vez identificada, empuje la aguja de microinyección a través de la pared uterina y dentro del ventrículo lateral. A continuación, utilice un microinyector accionado con un pedal para inyectar uno o dos microlitros de solución de ADN con cinco a 10 pulsos. El éxito de la inyección puede ser monitoreado por la solución de ADN coloreada que debe llenar el sistema ventricular.

Luego, coloque electrodos tipo pinza de modo que el terminal positivo esté en el mismo lado que el ventrículo inyectado y el terminal negativo esté en el lado opuesto del ventrículo inyectado debajo de la oreja de la cabeza del embrión. Humedezca el sitio de electroporación con unas gotas de solución bacteriostática de cloruro de sodio y aplique cinco pulsos de corriente eléctrica de 50 milisegundos de duración con intervalos de 950 milisegundos. Las burbujas en el electrodo negativo indican corriente eléctrica.

De 60 a 90 miliamperios suelen ser suficientes para una electroporación exitosa. Las corrientes más bajas no transfectarán neuronas de manera eficiente, mientras que las corrientes más altas pueden provocar la muerte embrionaria. Después de repetir el procedimiento para cada embrión del primer cuerno uterino, vuelva a colocarlo suavemente en la cavidad abdominal.

Después de suturar la capa muscular y la piel, desinfecte cuidadosamente con una solución de yodo y retire suavemente la vaselina de los ojos con hisopos de celulosa. Coloque el mouse debajo de una lámpara infrarroja hasta que se despierte. Después de sacrificar a la hembra embarazada con un método aprobado, extraiga el útero que contiene los embriones y colóquelo en una placa de Petri de 10 centímetros con HBSS completo helado.

A partir de este momento, mantenga todas las soluciones, embriones y cerebros en hielo. Mientras trabaja bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas de punta fina y un par de tijeras de resorte de Vannas Tubingen para separar cada embrión del útero. Transfiera los embriones a otra placa de Petri que contenga HBSS completo helado.

Haga una incisión a nivel del tronco encefálico y corte a lo largo de la línea media sagital. Retire la piel y el cartílago que cubren el cerebro. Luego, corta el tronco encefálico justo detrás de los hemisferios y extrae el cerebro del cráneo.

Transfiera el cerebro con una espátula de microcuchara a una placa de 12 pocillos que contenga HBSS completo helado. Recoge todos los cerebros de la basura en la placa de 12 pocillos. A continuación, utilice un microscopio estereoscópico fluorescente para examinar los cerebros de la placa de 12 pocillos para determinar el brillo de la florescencia y el tamaño de la región electroporada.

Seleccione de dos a cuatro cerebros con señales fluorescentes brillantes y la presunta corteza somatosensorial para su posterior procesamiento. A continuación, vierta la solución de agarosa fundida al 3% de bajo punto de fusión en un molde de inclusión desechable despegable. Use una espátula de microcuchara para extraer el cerebro de la placa de 12 pocillos y drene con cuidado el exceso de HBSS completo de alrededor del cerebro con papel de seda fino.

Coloque el cerebro suavemente en la solución de agarosa. Luego, use una aguja de calibre 20 para empujarlo hasta el fondo del molde y ajuste cuidadosamente su posición. Para las secciones coronales, orienta el cerebro con los bulbos olfativos apuntando hacia arriba.

Mantenga el molde en hielo hasta que la solución de agarosa se solidifique, luego proceda a seccionar el cerebro. Use una hoja de afeitar limpia para recortar el exceso de agarosa alrededor del cerebro, dejando aproximadamente un milímetro de agarosa en todos los lados, excepto en los bulbos olfativos, donde se deben dejar de dos a tres milímetros de agarosa. Después de aplicar una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato a una muestra, fije el bloque de agarosa recortado con los bulbos olfativos apuntando hacia abajo.

Transfiera la etapa de la muestra a la cámara de corte de un micrótomo de cuchilla vibratoria que contenga HBSS completo helado y coloque el cerebro con su lado dorsal hacia la hoja. Corte cortes de cerebro de 250 micras de grosor que contengan la región electroporada con una amplitud baja a moderada y una velocidad de corte muy lenta. Por lo general, se obtienen de cuatro a seis cortes con señal fluorescente brillante de cada cerebro electroporado con éxito.

Agarre el borde de agarosa de una sección con pinzas de punta fina y tire de la rodaja sobre una espátula de microcuchara doblada. De esta manera, transfiera con cuidado las rodajas de cerebro a una placa de seis pocillos que contenga HBSS completo helado. Humedecer los insertos de membrana recubiertos de laminina con 100 microlitros de HBSS completo.

Luego, transfiera con cuidado las rodajas a las membranas con la espátula de microcuchara doblada y las pinzas. Empuje suavemente la rebanada de la espátula hacia la membrana, luego colóquela con pinzas. Continúe transfiriendo las rebanadas restantes.

Se pueden colocar hasta cinco rebanadas en un inserto de membrana. Elimine el exceso de HBSS completo con una pipeta. Luego, con la ayuda de pinzas, coloque con cuidado los insertos de membrana con las rodajas en una placa de seis pocillos que contenga 1,8 mililitros de medio de cultivo en rodajas.

Seleccione un corte de cerebro para obtener imágenes observando los cortes a través de un microscopio invertido. Elija un corte con neuronas individuales brillantes en la SVZ superior que migren radialmente hacia la superficie de la pila del corte. La presencia de finos procesos fluorescentes de células gliales radiales que abarcan toda la placa conjugada indica un andamio glial radial intacto que es utilizado por las neuronas conjugadas migratorias.

Transfiera el inserto de membrana con una rebanada seleccionada a un plato con fondo de vidrio de 50 milímetros de diámetro que contenga dos mililitros de medio de cultivo en rodajas. Coloque el plato en la cámara climática del microscopio confocal. Establezca la resolución en 512 por 512 píxeles.

Aumente la velocidad de escaneo de 400 hercios a 700 hercios para aumentar la velocidad de fotogramas de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 cuadros por segundo. No use más de dos veces el promedio. Defina una pila Z a través de la región electroporada con un tamaño de paso de 1,5 micras.

Comience la serie de lapso de tiempo tomando una pila Z cada 30 minutos. Los ajustes descritos permiten una resolución y un brillo suficientes de la imagen, al tiempo que mantienen bajo el daño de la foto durante la adquisición. Esta película muestra las neuronas corticales E16.5 migrando de las zonas subventriculares ventriculares a la placa cortical.

En el transgénico condicional Floxado Bcl11a después de la electroporación del plásmido de control IRES-GFP en el día embrionario 14.5. La película consta de 108 fotogramas a una velocidad de cinco fotogramas por segundo. La barra de escala representa 100 micras.

La electroporación de un vector plásmido de ADN que contiene Cre-IRES-GFP afectó la migración de neuronas corticales en cerebros floxados condicionales con Bcl11a. Como se ve aquí, muy pocas neuronas se mueven más allá de la zona intermedia para llegar a la placa cortical. Esta película muestra la polarización de las neuronas corticales de un control marcado con GFP a la izquierda en comparación con las neuronas de un mutante Bcl11a a la derecha.

Estos rastros animados de control representativo en neuronas mutantes Bcl11a se obtuvieron a partir de series de lapso de tiempo de cultivos de corte E16.5 con una resolución de intervalo de una hora. De nuevo, los datos del cerebro de control se muestran a la izquierda y los datos del cerebro electroporado Cre-IRES-GFP se muestran a la derecha. Como se ve en esta colección de trazas representativas de cultivos de control y de corte mutante Bcl11a, las neuronas mutantes Bcl11a con frecuencia experimentan fases repetitivas de velocidad de migración reducida y orientación cambiada aleatoriamente como lo marcan las puntas de flecha rojas.

Los perfiles de velocidad se pueden calcular a partir de los rastros de las neuronas en migración. Como se ve aquí, una mayor proporción de neuronas mutantes Bcl11a tienen velocidades de migración más lentas en comparación con los controles. El ángulo de desviación se puede calcular a partir de los datos de seguimiento.

Como se ve en este histograma, las neuronas mutantes Bcl11a representadas por las barras negras exhiben mayores ángulos de desviación en comparación con los controles. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de dos horas cada una para la electroporación en el útero y la preparación del cultivo organotípico de cortes de cerebro. Este procedimiento se puede adaptar fácilmente para realizar análisis fraccionados de genes de interés en neuronas corticales migrantes radiales por ganancia y pérdida de función, así como experimentos vasculares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo observar directamente las neuronas que migran radialmente en un cultivo de corte organotípico preparado a partir de cerebros embrionarios electroporados mediante microscopía confocal de lapso de tiempo.