Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario

El objetivo general de este procedimiento es observar directamente neuronas que migran radialmente en cultivos de cortes organotípicos preparados a partir de cerebro embrionario electroporado, mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Este método puede ayudar a estudiar aspectos clave del desarrollo de la neocorteza. Permite investigar los mecanismos moleculares implicados en la polarización neuronal y la migración radial de las neuronas hacia su posición final dentro del cerebro.

La principal ventaja de esta técnica es que se pueden analizar las propiedades dinámicas de las neuronas migratorias, incluyendo los perfiles de velocidad, la velocidad media de migración, así como los cambios en la dirección migratoria. Comience colocando un ratón hembra preñado adecuadamente anestesiado en posición supina sobre una placa calefactora. Verifique la ausencia del reflejo plantar.

Luego, cubra cuidadosamente los ojos con vaselina para evitar que se sequen. A continuación, extienda suavemente las extremidades y fíjelas a la placa calefactora con cinta quirúrgica. Esterilice el abdomen pasando etanol al 70 % seguido de solución de yodo, luego coloque una gasa estéril, en la cual se ha hecho un corte para la incisión abdominal, sobre el abdomen.

Humedezca la gasa con solución bacteriostática de cloruro de sodio. Después de volver a evaluar el desarrollo de la anestesia quirúrgica mediante la pérdida del reflejo podal, utilice pinzas micro Adson serradas y tijeras finas anguladas para cortar la piel aproximadamente 1,5 centímetros a lo largo de la línea media del abdomen. A continuación, corte el músculo subyacente a lo largo de la línea alba.

Sujete el cuerno uterino entre embriones con pinzas de anillo y colóquelo suavemente sobre la gasa humedecida sin perturbar las placentas ni los vasos sanguíneos. A continuación, coloque cuidadosamente un embrión para obtener una vista clara del ventrículo lateral, que aparece como una sombra con forma de media luna paralela al seno sagital. El sitio de inyección se encuentra en el punto medio de una línea entre el ojo pigmentado y la confluencia de senos, donde el seno sagital se divide en dos senos transversos.

Una vez identificado, introduzca la aguja de microinyección a través de la pared uterina y dentro del ventrículo lateral. A continuación, utilice un microinyector operado con un pedal para inyectar uno a dos microlitros de solución de ADN mediante cinco a 10 pulsos. La inyección exitosa puede monitorearse mediante la solución coloreada de ADN, que debe llenar el sistema ventricular.

Luego, coloque electrodos del tipo pinzas de modo que el terminal positivo esté en el mismo lado que el ventrículo inyectado y el terminal negativo en el lado opuesto del ventrículo inyectado, debajo de la oreja de la cabeza del embrión. Humedezca el sitio de electroporación con unas gotas de solución bacteriostática de cloruro de sodio y aplique cinco pulsos de corriente eléctrica de 50 milisegundos de duración con intervalos de 950 milisegundos. La presencia de burbujas en el electrodo negativo indica la corriente eléctrica.

De 60 a 90 miliamperios suelen ser suficientes para una electroforesis exitosa. Corrientes más bajas no transfectarán eficazmente las neuronas, mientras que corrientes más altas pueden provocar la muerte del embrión. Después de repetir el procedimiento para cada embrión del primer cuerno uterino, colóquelo suavemente de vuelta en la cavidad abdominal.

Después de suturar la capa muscular y la piel, desinfecte cuidadosamente con solución de yodo y retire suavemente la vaselina de los ojos utilizando torundas de celulosa. Coloque al ratón bajo una lámpara de infrarrojos hasta que despierte. Después de sacrificar a la hembra preñada mediante un método aprobado, retire el útero que contiene los embriones y colóquelo en una placa de Petri de 10 centímetros con HBSS completo frío con hielo.

A partir de este momento, mantenga todas las soluciones, embriones y cerebros sobre hielo. Mientras trabaje bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas de punta fina y un par de tijeras de resorte Vannas Tubingen para separar cada embrión del útero. Transfiera los embriones a otra placa de Petri que contenga HBSS completo frío con hielo.

Realice una incisión a nivel del bulbo raquídeo y corte a lo largo de la línea media sagital. Retire la piel y el cartílago que cubren el cerebro. A continuación, corte el bulbo raquídeo justo detrás de los hemisferios y extraiga el cerebro del cráneo.

Transfiera el cerebro con una espátula microscópica a una placa de 12 pocillos que contenga HBSS completo frío con hielo. Recolecte todos los cerebros de la camada en la placa de 12 pocillos. Luego, utilice un estereomicroscopio fluorescente para examinar los cerebros en la placa de 12 pocillos en busca del brillo de la fluorescencia, así como del tamaño de la región electroporada.

Seleccione dos a cuatro cerebros con señales fluorescentes intensas y la corteza somatosensorial presunta para su posterior procesamiento. A continuación, vierta una solución fundida de agarosa al 3 % de punto de fusión bajo en un molde desechable desprendible para inclusión. Utilice una espátula microcucharilla para retirar el cerebro de la placa de 12 pocillos y drene cuidadosamente el exceso de HBSS completo alrededor del cerebro usando papel de tejido fino.

Coloque suavemente el cerebro en la solución de agarosa. Luego, utilice una aguja de calibre 20 para empujarlo hasta el fondo del molde y ajuste cuidadosamente su posición. Para secciones coronales, oriente el cerebro con los bulbos olfatorios apuntando hacia arriba.

Mantenga el molde sobre hielo hasta que la solución de agarosa se solidifique, luego proceda al corte del cerebro. Use una cuchilla limpia para recortar el exceso de agarosa alrededor del cerebro, dejando aproximadamente un milímetro de agarosa en todos los lados, excepto en los bulbos olfatorios, donde deben dejarse dos a tres milímetros de agarosa. Después de aplicar una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato sobre un espécimen, fije el bloque de agarosa recortado con los bulbos olfatorios orientados hacia abajo.

Transfiera la platina del espécimen a la cámara de corte de un microtomo de cuchilla vibratoria que contenga HBSS completo frío con hielo y coloque el cerebro con su lado dorsal hacia la cuchilla. Corte secciones cerebrales de 250 micrones de grosor que contengan la región electroporada con una amplitud baja a moderada y una velocidad de corte muy lenta. Por lo general, se obtienen cuatro a seis secciones con una señal fluorescente brillante de cada cerebro electroporado con éxito.

Sujete el borde de agarosa de una sección con pinzas de punta fina y tire suavemente de la rebanada hacia una espátula microscópica curvada. De esta manera, transfiera cuidadosamente las rebanadas cerebrales a una placa de seis pocillos que contenga HBSS completo frío con hielo. Humedezca los insertos recubiertos con laminina con 100 microlitros de HBSS completo.

Luego, transfiera cuidadosamente las secciones a las membranas utilizando la espátula de microcucharilla doblada y pinzas. Empuje suavemente la sección desde la espátula hacia la membrana y luego colóquela con las pinzas. Continúe transfiriendo las secciones restantes.

Se pueden colocar hasta cinco secciones sobre un inserto de membrana. Retire el HBSS completo en exceso con una pipeta. Luego, con la ayuda de pinzas, coloque cuidadosamente los insertos de membrana con las secciones en una placa de seis pocillos que contenga 1,8 mililitros de medio de cultivo para secciones.

Seleccione una sección de cerebro para la obtención de imágenes al observar las secciones mediante un microscopio invertido. Elija una sección con neuronas individuales brillantes en la ZVS superior que migren radialmente hacia la superficie pial de la sección. La presencia de finos procesos fluorescentes de células gliales radiales que atraviesan toda la lámina indica un armazón de células gliales radiales intacto, que es utilizado por las neuronas conjugadas en migración.

Transfiera el inserto de membrana con un trozo seleccionado a una placa de vidrio de 50 milímetros de diámetro que contenga dos mililitros de medio de cultivo de trozos. Coloque la placa en la cámara climática del microscopio confocal. Establezca la resolución en 512 por 512 píxeles.

Aumente la velocidad de escaneo de 400 hercios a 700 hercios para incrementar la tasa de cuadros de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 cuadros por segundo. Utilice no más de dos veces el promediado. Defina una serie Z a través de la región electroporada con un tamaño de paso de 1,5 micrones.

Inicie la serie de lapsos de tiempo adquiriendo una serie Z cada 30 minutos. La configuraciones descritas permiten una resolución y brillo suficientes de la imagen, manteniendo al mínimo el daño por fototoxicidad durante la adquisición. Esta película muestra neuronas corticales de E16.5 migrando desde las zonas ventriculares subventriculares hacia la placa cortical.

En el transgénico condicional con Bcl11a floxado tras la electroporación del plásmido control IRES-GFP en el día embrionario 14,5. La película consta de 108 cuadros a una velocidad de cinco cuadros por segundo. La barra de escala representa 100 micrones.

La electroforesis de un vector plasmídico de ADN que contiene Cre-IRES-GFP afectó la migración de neuronas corticales en cerebros condicionales con Bcl11a floxeados. Como se observa aquí, muy pocas neuronas avanzan más allá de la zona intermedia para alcanzar la placa cortical. Esta película muestra la polarización de neuronas corticales de un control marcado con GFP a la izquierda en comparación con neuronas de un mutante de Bcl11a a la derecha.

Estos trazos animados representativos del control en neuronas mutantes de Bcl11a se obtuvieron a partir de series de lapsos de tiempo de cultivos de cortes de E16.5 con resolución de intervalos de una hora. Nuevamente, los datos del cerebro de control se muestran a la izquierda y los datos del cerebro electroporado con Cre-IRES-GFP se muestran a la derecha. Como se observa en este conjunto de trazos representativos de cultivos de cortes de control y mutantes de Bcl11a, las neuronas mutantes de Bcl11a experimentan frecuentemente fases repetitivas de reducción en la velocidad de migración y cambios aleatorios en la orientación, marcados por las flechas rojas.

Los perfiles de velocidad pueden calcularse a partir de los rastros de neuronas migratorias. Como se observa aquí, una proporción mayor de neuronas mutantes de Bcl11a presenta velocidades de migración más lentas en comparación con los controles. El ángulo de desviación puede calcularse a partir de los datos del rastreo.

Como se observa en este histograma, las neuronas mutantes de Bcl11a representadas por las barras negras presentan ángulos de desviación mayores en comparación con los controles. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de dos horas cada una para la electrotransferencia intraútero y la preparación del cultivo de cortes cerebrales organotípicos. Este procedimiento puede adaptarse fácilmente para realizar el análisis fraccional de genes de interés en neuronas corticales migratorias radiales mediante la ganancia y pérdida de función, así como para experimentos vasculares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo observar directamente neuronas que migran radialmente en cultivos de cortes organotípicos preparados a partir de cerebros embrionarios electroporados mediante microscopía confocal de lapso de tiempo.