Name: Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario En Utero Electroporación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Aprende a observar neuronas migratorias radiales en cultivo organotípico de cerebro de ratón embrionario mediante microscopía confocal de tiempo real. Este método permite analizar mecanismos moleculares de polarización y migración neuronal durante el desarrollo del neocórtex.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka y Matthias Toberer por su excelente asistencia técnica, así como a Victor Tarabykin por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado por una concesión de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal (Regierungspräsidium Tübingen) y llevados a cabo de acuerdo con la Ley alemana de Bienestar Animal y la Directiva UE 2010/63 / EU. 1. En Utero Electroporación <ol><li> Agujas de microinyección <ol><li> Tirar capilares de vidrio borosilicato (diámetro exterior: 1,0 mm, diámetro interior: 0,58 mm, longitud: 100 mm) en agujas de microinyección utilizando un extractor de micropipeta con un filamento de caja (2,5 mm x 2,5 mm) y el siguiente programa: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20, y DELAY: 140. Determine el valor HEAT para cada filamento individual realizando una prueba RAMP (HEAT value: RAMP + 25). </li><li> Agujas biseladas en un ángulo de 38 ° y velocidad de revolución intermedia a alta con un microgrinder para obtener un tamaño de punta de 20 a 30 μm para inyección en el día embrionario (E) 13,5 o menor y de 30 a 40 μm para inyección en células embrionarias más viejasEtapas. Para el almacenamiento, fije las agujas en una caja o en una placa de Petri con arcilla de modelado para evitar daños en las puntas. </li></ol></li><li> Solución de ADN plasmídico <ol><li> Preparar una construcción de ADN plasmídico que contenga proteína reportera fluorescente ( por ejemplo GFP) usando un kit de preparación maxi sin endotoxina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Diluir la solución de ADN plasmídico a una concentración final de 1 - 2 μg / μl en tampón Tris-EDTA libre de endotoxina que contiene Fast Green a una concentración final de 0,01%. Una solución alícuota y almacenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Solución Bacteriostatica de Cloruro de Sodio <ol><li> Preparar solución bacteriostática de cloruro sódico añadiendo alcohol bencílico a una concentración final de 0,9% a una solución isotónica de cloruro de sodio al 0,9%. Solución de filtro estéril inmediatamente antes de su uso. </li></ol></li><li> Carprofen Solución de inyección <ol><li> Preparar la solución de inyección de carprofenoAñadiendo carprofeno a una concentración final de 0,5 mg / ml a una solución isotónica estéril de cloruro de sodio al 0,9%. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 28 días. </li></ol></li><li> Anestesia, Inyección de ADN y Electroporación <ol><li> Pesar un ratón E14.5 cronometrado-embarazado y colocarlo en una cámara de anestesia transparente conectado a un vaporizador y saturado con isoflurano al 5%. Cuando el animal está inconsciente, transfiéralo a una mascarilla anestesiadora unida a una placa calentadora a 37 ° C y manténgala anestesiada con 1,8-2,2% de isoflurano. Nota: Evalúe el desarrollo de la anestesia quirúrgica por la pérdida de pellizco de la cola y los reflejos del pedal (pinzamiento del dedo del pie). </li><li> Para la analgesia, inyectar 100 μL de solución de inyección de carprofeno por cada 10 mg de peso corporal de ratón (5 mg / kg de peso corporal) por vía subcutánea. Gire el ratón con la espalda hacia abajo y cubra cuidadosamente los ojos con vaselina para evitar que se sequen. </li><li> Extienda suavemente las extremidades y fíjelasA la placa de calentamiento con cinta quirúrgica. Esterilizar el abdomen con etanol al 70% seguido de solución de yodo (7,5 mg / ml) usando hisopos de celulosa. Repita este procedimiento tres veces para asegurar una desinfección adecuada. </li><li> Cubra el abdomen con una gasa estéril en la que se ha cortado una incisión para recoger un campo (diámetro: 2 - 2,5 cm) para la incisión abdominal. Humedecer la gasa con solución bacteriostática de cloruro sódico. Precaución: Reevalúe el desarrollo de la anestesia quirúrgica mediante la pérdida del reflejo del pedal. </li><li> Usando pinzas Micro Adson (dentadas, longitud: 12 cm) y tijeras finas (anguladas a la cara, longitud: 9 cm) cortar la piel aproximadamente 1,5 cm a lo largo de la línea media del abdomen. Corte el músculo subyacente a lo largo de la linea alba. </li><li> Quitar un cuerno uterino con pinzas anulares (longitud: 9 cm, diámetro exterior: 3 mm, diámetro interior: 2,2 mm) y colocarlo suavemente sobre la gasa humedecida. Precaución: Sostener el cuerno uterino con pinzas anulares sólo entre embriones yD no perturbar las placentas o cualquier recipiente de suministro. Mantenga el útero húmedo en todo momento con solución bacteriostática de cloruro sódico. </li><li> Coloque con cuidado un embrión con pinzas anulares y localice el ventrículo lateral, que se presenta como una sombra en forma de media luna paralela al seno sagital. El punto de inyección se encuentra aproximadamente en el centro de una línea entre el ojo pigmentado y la confluencia de los senos, donde el seno sagital se ramifica a dos senos transversales. Empuje la aguja de microinyección a través de la pared uterina y hacia el ventrículo lateral. Nota: Si es necesario, la profundidad de la inyección puede ser corregida por retracción de la aguja. </li><li> Inyecte 1 a 2 μl de solución de ADN en el ventrículo lateral con un microinyector que se acciona con un pedal, utilizando los siguientes ajustes: 25 psi, 10 a 20 ms por pulso y 5 a 10 pulsos. La inyección exitosa puede ser monitorizada por la solución de ADN coloreada, que debe llenar el sistema ventricular. </li><li> Coloque los electrodos tipo pinzas (3 mm de diámetro para E13.5 o menos y 5 mm de diámetro para E14.5 o mayores) de tal manera que el terminal &quot;positivo&quot; esté del mismo lado que el ventrículo inyectado y el terminal &quot;negativo&quot; Terminal está en el lado opuesto del ventrículo inyectado debajo de la oreja de la cabeza del embrión. </li><li> Humedezca el sitio de electroporación con unas gotas de solución bacteriostática de cloruro de sodio y aplique 5 pulsos de corriente eléctrica (35 V para E13.5 o menos y 40 V para E14.5 o mayores) de 50 ms de duración con intervalos de 950 ms. Nota: Las corrientes de 60 a 90 mA son usualmente suficientes para una electroporación exitosa. Las corrientes más bajas no transfectan eficientemente las neuronas, mientras que las corrientes más altas pueden conducir a la muerte embrionaria. </li><li> Repita el procedimiento (ver los pasos 1.5.7 a 1.5.10.) Para cada embrión del cuerno uterino y colóquelo suavemente en la cavidad abdominal. </li><li> Quite el cuerno uterino del otro lado y repita el procesoDescrito en el paso 1.5.7. A 1,5.11. </li><li> Cierre la cavidad abdominal suturando la capa muscular antes de suturar la piel usando fórceps Micro Adson, soporte de aguja Mathieu (carburo de tungsteno, longitud: 14 cm) y sutura quirúrgica no absorbible (3/8 de círculo, 13 mm). Precaución: Tenga cuidado de no capturar el útero u otros órganos durante la sutura. </li><li> Desinfecte cuidadosamente la sutura de la piel con solución de yodo (7,5 mg / ml) y elimine suavemente el exceso periocular de vaselina usando hisopos de celulosa. Coloque el ratón debajo de una lámpara infrarroja hasta que se despierte. Vigilar de cerca el ratón durante los próximos dos días. Repita el tratamiento analgésico como se describe en el paso 1.5.2 después de 12 a 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Cultivo organístico de la rebanada <ol><li> Laminin Stock Solution <ol><li> Disolver 1 mg de laminina liofilizada en agua estéril para obtener una solución madre de laminina de 1 mg / ml. Preparar alícuotas de 50 μL aAlmacenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Solución de inventario de poli-L-lisina <ol><li> Disolver 50 mg de poli-L-lisina en agua estéril para obtener una solución madre de poli-L-lisina de 1 mg / ml. Preparar alícuotas de 0,5 ml y almacenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Solución completa de sal equilibrada de Hank (HBSS completo) <ol><li> Preparar HBSS completo combinando 50 ml de solución de HBSS 10x, 1,25 ml de tampón HEPES 1 M (pH 7,4), 15 ml de solución de D-glucosa 1 M, 5 ml de solución de cloruro de calcio 100 mM, 5 ml de sulfato de magnesio 100 mM , Y 2 ml de solución 1 M de hidrogenocarbonato de sodio. Añadir agua estéril hasta 0,5 L, filtro estéril, y almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Medio de cultivo de la rebanada <ol><li> Combine 35 ml de Eagle Basal Medium (BME), 12,9 ml de HBSS completo (ver sección 2.3.1.), 1,35 ml de D-glucosa 1 M, 0,25 ml de L-glutamina 200 mM y 0,5 ml de penicilina-estreptomicina a Obtener 50 ml de cultivo en rebanadasmedio. Filtro estéril y añadir suero de caballo a una concentración final del 5%. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 4 semanas. </li></ol></li><li> Solución de Agarosa de bajo punto de fusión (LMP) <ol><li> Preparar solución de agarosa LMP al 3% disolviendo 1,5 g de agarosa LMP en 50 ml de HBSS completo calentando en un horno de microondas durante 1 a 2 min a potencia intermedia. Nota: Controle cuidadosamente el calor para evitar que se desborde durante la ebullición. </li><li> Colocar la solución en un baño de agua a 38 ° C hasta que esté lista para su uso. Guarde a 4 ° C y reutilice una vez. </li></ol></li><li> Revestimiento de insertos de membrana <ol><li> Añadir una alícuota de la solución madre de laminina (véase el paso 2.1.1.) Y una alícuota de solución madre de poli-L-lisina (véase el paso 2.2.1.) A 6 ml de agua estéril para obtener una solución de revestimiento (suficiente para 6 insertos) . </li><li> Coloque los insertos de membrana en una placa de 6 pocillos que contenga 2 mL de agua estéril en el fondo de cada pocillo. Añadir 1 ml de solución de revestimiento(Véase el paso 2.6.1.) Encima de cada membrana e incubar durante la noche a 37ºC y atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Nota: Únicamente utilice insertos con membranas ópticamente transparentes, como la membrana de PTFE (politetrafluoroetileno). </li><li> Lavar las membranas tres veces con 1 mL de agua estéril y secar. Utilizar membranas recubiertas el mismo día o almacenar en una placa limpia de 6 pocillos a 4 ° C durante un máximo de cuatro semanas. </li></ol></li><li> Disección cerebral e incorporación <ol><li> Dos días después de la electroporación colocar el ratón en una cámara transparente conectada a un vaporizador y saturada con isoflurano al 5%. Cuando el animal está inconsciente, sacarlo de la cámara y sacrificarlo por dislocación cervical. </li><li> Retire el útero que contiene los embriones y colóquelo en una placa de Petri de 10 cm con HBSS completo helado. Nota: A partir de este momento, mantenga todas las soluciones, embriones y cerebros en hielo. </li><li> Utilice un estereomicroscopio, fórceps con punta fina (recta,11 cm) y un par de tijeras Vannas Tübingen Spring (anguladas, longitud: 9,5 cm) para separar cada embrión del útero y transferirlo a otra placa de Petri que contenga HBSS completo helado. </li><li> Haga una incisión a nivel del tronco cerebral y corte a lo largo de la línea media sagital. Despegue la piel y el cartílago que cubre el cerebro. Luego, corte el tronco cerebral justo detrás de los hemisferios y retire el cerebro del cráneo. Transferir el cerebro con una espátula de micro-cuchara (185 mm x 5 mm) a una placa de 12 pocillos que contenga HBSS completo helado. Recoja todos los cerebros de la litera en la placa de 12 pocillos. </li><li> Utilice un estereomicroscopio fluorescente para examinar los cerebros en la placa de 12 pocillos para obtener brillo de fluorescencia así como el tamaño de la región electroporada. Seleccione de 2 a 4 cerebros con señales fluorescentes brillantes en la corteza somatosensorial presuntiva para su posterior procesamiento. </li><li> Vierta la solución de agarosa LMP al 3% mantenida a 38 ° C en un molde de incrustación desechable desechable. EliminarE del cerebro de la placa de 12 pocillos con una espátula de micro-cuchara y drene cuidadosamente el exceso de HBSS completo alrededor del cerebro usando papel de seda fino. </li><li> Colocar el cerebro suavemente en la solución de agarosa, empujarlo hasta el fondo del molde y ajustar cuidadosamente su posición usando una aguja de calibre 20. Para las secciones coronales, orientar el cerebro con los bulbos olfativos apuntando hacia arriba. Mantenga el molde sobre hielo hasta que la solución de agarosa se solidifique y continúe con la sección del cerebro. </li></ol></li><li> Sección de Vibratome y Cultura de Slice <ol><li> Retire el bloque de agarosa del molde y colóquelo en la tapa de una placa petri estéril. Corte el exceso de agarosa con una cuchilla de afeitar limpia dejando aproximadamente 2 a 3 mm por debajo de los bulbos olfativos y 1 mm de agarosa en los otros lados. Fijar el bloque de agarosa recortado con los bulbos olfativos apuntando hacia abajo a una etapa de muestra usando pegamento de cianoacrilato. Nota: Esterilizar instrumentos y equipos con un 70% de etanoL antes de cortar. </li><li> Transferir la etapa de la muestra a la cámara de corte de un micrótomo de lámina vibrante que contiene HBSS completo helado y colocar el cerebro con su lado dorsal hacia la hoja. Cortar cortes cerebrales de 250 μm de grosor que contienen la región electroporada con una amplitud de baja a moderada de 0,9 mm y una velocidad de corte muy lenta de 0,09-0,12 mm / s. Usualmente se obtienen de 4 a 6 rebanadas con señal fluorescente brillante de cada cerebro con éxito electroporado. </li><li> Con una espátula de cuchara micro doblada y fórceps con punta fina, transfiera cuidadosamente las rodajas de cerebro con la agarosa circundante a una placa de 6 pocillos que contenga HBSS completo helado. Precaución: Tenga cuidado de no dañar el tejido cerebral tocando el borde de agarosa alrededor de las secciones con la pinza durante la transferencia. </li><li> Procesar todos los cerebros seleccionados como se describe en los pasos 2.8.1. A 2.8.3. </li><li> Humedecer los insertos de membrana con 100 μL de HBSS completo antes de colocar el cerebro slHielo sobre las membranas para facilitar la colocación de las rebanadas. Se pueden colocar hasta 5 rebanadas en 1 inserto de membrana. </li><li> Cuidadosamente transferir las rebanadas en las membranas con una espátula de cuchara micro curvada y fórceps con punta fina. Tire suavemente una rebanada en la espátula tocando solamente el borde de la agarosa con la pinza y empuje suavemente la rebanada de la espátula sobre la membrana. Coloque la rebanada con una pinza y continúe transfiriendo las rebanadas restantes. Quitar el exceso de HBSS completo con una pipeta. Nota: No se superponen las rebanadas entre sí. </li><li> Con la ayuda de un fórceps, coloque cuidadosamente los insertos de membrana con las rebanadas en una placa de 6 pocillos que contenga 1,8 ml de medio de cultivo en lonchas (ver Paso 2.4.1) e incube a 37ºC y atmósfera de dióxido de carbono al 5% hasta un lapso de tiempo Imágenes </li></ol></li></ol> 3. Imagen de lapso de tiempo <ol><li> Configuración del microscopio <ol><li> Coloque una cámara climática en el escenario de unaMicroscopio confocal invertido a 37 ◦ C y atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Utilice un detector híbrido para reducir la intensidad del láser y mejorar la viabilidad celular. Para un análisis detallado, utilice una distancia de trabajo extra larga de 40X objetivo seco con una apertura numérica de 0,6 o superior. Nota: Todos los componentes del microscopio necesitan ser precalentados a 37 ° C durante 2 - 3 h antes de la formación de imágenes para proporcionar un enfoque estable durante el proceso de formación de imágenes. </li></ol></li><li> Slice Imaging <ol><li> Seleccione una rebanada de cerebro para obtener imágenes de la placa de 6 pocillos que contiene los insertos de membrana usando un microscopio de fluorescencia invertido. Precaución: Evite el tiempo prolongado de exposición a la luz ultravioleta, ya que esto puede causar fotodigasión celular. Nota: Seleccione una rebanada con neuronas simples brillantes en la SVZ superior que migran radialmente hacia la superficie pial de la rebanada. Los procesos fluorescentes finos de las células gliales radiales que abarcan todo el CP indican un andamio glial radial intacto, que se utilizaD por migración radial de neuronas corticales. </li><li> Transferir el inserto de membrana con la rebanada, que se seleccionó para la formación de imágenes en lapso de tiempo, en una placa de fondo de vidrio de 50 mm de diámetro que contiene 2 ml de medio de cultivo de rebanada con la ayuda de fórceps. Coloque el plato en la cámara climática del microscopio confocal. </li><li> Establezca la resolución a 512 por 512 píxeles y aumente la velocidad de exploración de 400 Hz a 700 Hz con el fin de aumentar la velocidad de fotogramas de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 fotogramas por segundo, respectivamente. No utilice más de dos veces el promedio. Definir una pila z a través de la región electroporada (normalmente 400-100 μm) con un tamaño de paso de 1,5 μm. Colectivamente, estos ajustes permiten una resolución y un brillo suficientes de la imagen, manteniendo el fotodigráfico bajo durante la adquisición. Comience la serie time-lapse tomando una pila z cada 30 min. Nota: La exposición prolongada de la rebanada a la luz láser inducirá el fotodamado reduciendo la viabilidad de las células. Ajustar la expOsure tiempo a la luz láser en consecuencia. </li><li> Analizar series de lapso de tiempo usando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) o equivalente. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).</li>
<li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J. J., Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multipolar+stage+and+disruptions+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The multipolar stage and disruptions in neuronal migration.</a> Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).</li>
<li>Tabata, H., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+mechanisms+of+neuronal+migration+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation.</a> Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).</li>
<li>Wiegreffe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11a+%28Ctip1%29+Controls+Migration+of+Cortical+Projection+Neurons+through+Regulation+of+Sema3c%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c.</a> Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).</li>
<li>John, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11a+is+required+for+neuronal+morphogenesis+and+sensory+circuit+formation+in+dorsal+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development.</a> Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), pl9(2002).</li>
<li>Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+of+neocortical+projection+neuron+specification%2C+development+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-selective+electroporation+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subtype-selective electroporation of cortical interneurons.</a> J Vis Exp. (90), e51518(2014).</li>
<li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+organotypic+slice+culture+of+mouse+hippocampal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).</li>
<li>Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dose-dependent+cortical+neuronal+migration+and+neurite+extension+defects+in+Lis1+and+Ndel1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice.</a> J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).</li>
<li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).</li>
<li>Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+analyzing+neuronal+progenitor+development+and+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).</li>
<li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).</li>
<li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trekking+across+the+brain%3A+the+journey+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-43 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La migración radial es un proceso clave en el desarrollo del neocórtex. Mutaciones en los genes que afectan a diferentes etapas de este proceso puede causar graves malformaciones corticales, incluida la lissencefalia y la materia blanca heterotopia [ 1 , 2] . Recientemente demostró que Bcl11a, que se expresa en jóvenes neuronas de proyección cortical migratorias, desempeña un papel en la migración radial. Utilizamos imágenes confocales de lapso de tiempo de las ...

El neocórtex es el sitio principal de funciones cognitivas, emocionales y sensoriomotoras. Se compone de seis capas horizontales orientadas en paralelo a la superficie del cerebro. Durante el desarrollo, las células progenitoras en la pared lateral del telencéfalo dorsal dan lugar a neuronas de proyección que migran radialmente hacia la superficie pial y adquieren una identidad neuronal específica del tipo de capa. Después de ser generadas en las zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ) estas neuronas se vuelven transitoriamente multipolar y retardan su migración. Después de una corta estancia en la zona intermedia (IZ) cambian a una morfología bipolar, se adhieren al andamio glial radial, y continúan la migración orientada radialmente hacia la placa cortical (CP). Al alcanzar su objetivo final, las neuronas se separan de los procesos radiales de la glía y adquieren una identidad específica de la capa. Las mutaciones en los genes que afectan a diferentes etapas de la migración neuronal pueden causar malformaciones corticales graves, tales como lissencEferencia o heterotopía de la materia blanca 1 , 2 . La electroporación in utero es una técnica rápida y potente para transfectar células progenitoras neurales en el cerebro en desarrollo de embriones de roedores 3 , 4 . Con esta técnica es posible desmontar y / o sobreexpresar genes de interés con el fin de estudiar sus funciones en el desarrollo de neuronas. Este método ha ayudado específicamente a describir los detalles morfológicos y caracterizar los mecanismos moleculares del proceso de migración radial 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Las neuronas que migran radialmente experimentan cambios dinámicos en la forma celular, velocidad de migración, así como la dirección migratoria, que requieren observación directa y continua a lo largo del tiempo. Organotypic slice cultuRe y time-lapse imágenes confocales de cerebros electroporados permiten observar directamente las neuronas migratorias con el tiempo. Utilizando este enfoque combinado, es posible analizar características distintas de las neuronas migratorias que no pueden ser investigadas en secciones de tejido fijas de cerebros electroporados. Recientemente hemos aplicado imágenes confocales de lapso de tiempo de migración de neuronas en cultivos de rebanada de cerebro electroporado para estudiar el papel de la CL de células de factor B de transcripción / linfoma 11a (Bcl11a) durante el desarrollo cortical 10 . Bcl11a se expresa en jóvenes neuronas corticales migratorias y se utilizó un alelo condicional Bcl11a ( Bcl11a flox ) 11 para estudiar sus funciones. La electroporación de la recombinasa Cre junto con la proteína fluorescente verde (GFP) en los progenitores corticales de los cerebros flox / flox Bcl11a nos permitió crear una situación de mutante de mosaico, en la que sólo unas pocas células se mutan en unaDe lo contrario de tipo salvaje de fondo. De esta manera, fue posible estudiar las funciones autónomas de células de Bcl11a en el nivel de célula única. Hemos encontrado que Bcl11a mutante neuronas muestran velocidad reducida, cambios en sus perfiles de velocidad, así como al azar-como orientación cambios durante su migración [ 10] . En el protocolo descrito describimos un flujo de trabajo para la electroporación exitosa y la preparación del cultivo en rebanadas 12 de cerebros de ratón, así como imágenes confocales en intervalos de tiempo de cultivos de corte cortical.

<table><tbody><tr><td>isoflurano</td><td>Abbott Laboratories&nbsp;</td><td>506949</td><td>Forene</td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>sutura quirúrgica no absorbible</td><td>Ethicon</td><td>K890H</td><td>3/8 círculo, 13 mm, punta cónica</td></tr><tr><td>Micro Adson Pinzas Fine</td><td>Science Tools</td><td>11018-12</td><td>dentado, longitud: 12 cm</td></tr><tr><td>tijeras finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td>angulado hacia un lado, longitud: 9 cm</td></tr><tr><td>Portaagujas Mathieu Fine</td><td>Science Tools</td><td>12510-14</td><td>carburo de tungsteno, longitud: 14 cm</td></tr><tr><td>pinzas de punta fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>recta, 11 cm</td></tr><tr><td>Vannas T&uuml; Tijeras de resorte bingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td>en ángulo hacia arriba,</td></tr><tr><td>pinza de anillo</td> de 9,5 cm <td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td>OD: 3 mm, ID, 2,2 mm, longitud: 9 cm</td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Gibco</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>suero de caballo</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>26050088</tr><tr><td>capilares de vidrio de</td> borosilicato <td>BME Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm</td></tr><tr><td>sistema de anestesia</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6471</td><td></td></tr><tr><td>cámara de anestesia</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0460</td><td></td></tr><tr><td>cartucho de filtro fluosorber</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0415</td><td></td></tr><tr><td>agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo de cuchilla vibratoria</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico de fluorescencia</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>microscopio de cultivo de tejidos de fluorescencia invertida</td><td>Leica</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>microscopio de barrido láser confocal</td><td>Detector híbrido Leica</td><td>TCS SP5II</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Leica</td><td>HyD</td><td></td></tr><tr><td>, 40x/0.60 NA</td> Sistema <td></td> de control de temperatura para microscopio <td>11506201</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Life Imaging Services</td><td>Cube, Brick & Inserto</td> de cultivo celular de caja <td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>micromolinillo</td><td>Narishige</td><td>EG-45 uso de</td><td>ángulo de 38 grados para biselar</td></tr><tr><td>el microinyector</td><td>Parker Hannifin &nbsp;</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III</td></tr><tr><td>carprofeno</td><td>Pfizer Animal Health</td><td>NDC 61106-8507</td><td>Molde</td></tr> de <tr><td>emdedding</td> Rimadyl <td>Polysciences</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>plásmido libre de endotoxinas maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magenio</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>electroporador de onda cuadrada</td><td>Sonidel</td><td>CUY21EDIT</td><td></td></tr><tr><td>pinzas con electrodos de disco de platino de 5 mm</td><td>Sonidel</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>caja de filamento</td><td>Sutter Instrument</td><td>FB255B</td><td>2,5 mm x 2,5 mm</td></tr><tr><td>espátula de microcuchara</td><td>VWR</td><td>231-0191 Plato con fondo de</td> vidrio de <td>185 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>, 50 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; en utero</em&gt; electroporación

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

La electroporación in utero es un enfoque rápido y poderoso para estudiar el proceso de migración radial en la corteza cerebral de los embriones de ratón en desarrollo. Ha ayudado a describir los diferentes pasos de la migración radial y caracterizar los mecanismos moleculares que controlan este proceso. Para analizar directa y dinámicamente las neuronas migratorias tienen que ser rastreadas con el tiempo. Este protocolo describe un flujo de trabajo que combina la electroporación in utero con cultivo de corte organotípico y confocal de tiempo transcurrido, lo que permite un examen directo y análisis dinámico de las neuronas corticales que migran radialmente. Además, es posible la caracterización detallada de las neuronas migratorias, como la velocidad de migración, los perfiles de velocidad, así como los cambios de orientación radial. El método puede adaptarse fácilmente para realizar análisis funcionales de genes de interés en neuronas corticales de migración radial por pérdida y ganancia de función así como experimentos de rescate. Lapso de tiempoLa formación de imágenes de las neuronas migratorias es una técnica del estado de la técnica que una vez establecida es una potente herramienta para estudiar el desarrollo de la corteza cerebral en modelos de ratón de trastornos de migración neuronal.

Anteriormente, hemos demostrado que la deleción genética de Bcl11a por electroporación in utero perjudica la migración radial de finales de nacido de capa superior de las neuronas de proyección [ 10] . La electroporación de un vector de plásmido de ADN que contiene Cre-IRES-GFP eliminó eficazmente Bcl11a en cerebros Bx11a flox / flox condicionales 11 . Cuando se analizaron los cerebros...

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

El objetivo general de este procedimiento es observar directamente neuronas que migran radialmente en cultivos de cortes organotípicos preparados a partir de cerebro embrionario electroporado, mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Este método puede ayudar a estudiar aspectos clave del desarrollo de la neocorteza. Permite investigar los mecanismos moleculares implicados en la polarización neuronal y la migración radial de las neuronas hacia su posición final dentro del cerebro.La principal ventaja de esta técnica es que se pueden analizar las propiedades dinámicas de las neuronas migratorias, incluyendo los perfiles de velocidad, la velocidad media de migración, así como los cambios en la dirección migratoria. Comience colocando un ratón hembra preñado adecuadamente anestesiado en posición supina sobre una placa calefactora. Verifique la ausencia del reflejo plantar.Luego, cubra cuidadosamente los ojos con vaselina para evitar que se sequen. A continuación, extienda suavemente las extremidades y fíjelas a la placa calefactora con cinta quirúrgica. Esterilice el abdomen pasando etanol al 70 % seguido de solución de yodo, luego coloque una gasa estéril, en la cual se ha hecho un corte para la incisión abdominal, sobre el abdomen.Humedezca la gasa con solución bacteriostática de cloruro de sodio. Después de volver a evaluar el desarrollo de la anestesia quirúrgica mediante la pérdida del reflejo podal, utilice pinzas micro Adson serradas y tijeras finas anguladas para cortar la piel aproximadamente 1,5 centímetros a lo largo de la línea media del abdomen. A continuación, corte el músculo subyacente a lo largo de la línea alba.Sujete el cuerno uterino entre embriones con pinzas de anillo y colóquelo suavemente sobre la gasa humedecida sin perturbar las placentas ni los vasos sanguíneos. A continuación, coloque cuidadosamente un embrión para obtener una vista clara del ventrículo lateral, que aparece como una sombra con forma de media luna paralela al seno sagital. El sitio de inyección se encuentra en el punto medio de una línea entre el ojo pigmentado y la confluencia de senos, donde el seno sagital se divide en dos senos transversos.Una vez identificado, introduzca la aguja de microinyección a través de la pared uterina y dentro del ventrículo lateral. A continuación, utilice un microinyector operado con un pedal para inyectar uno a dos microlitros de solución de ADN mediante cinco a 10 pulsos. La inyección exitosa puede monitorearse mediante la solución coloreada de ADN, que debe llenar el sistema ventricular.Luego, coloque electrodos del tipo pinzas de modo que el terminal positivo esté en el mismo lado que el ventrículo inyectado y el terminal negativo en el lado opuesto del ventrículo inyectado, debajo de la oreja de la cabeza del embrión. Humedezca el sitio de electroporación con unas gotas de solución bacteriostática de cloruro de sodio y aplique cinco pulsos de corriente eléctrica de 50 milisegundos de duración con intervalos de 950 milisegundos. La presencia de burbujas en el electrodo negativo indica la corriente eléctrica.De 60 a 90 miliamperios suelen ser suficientes para una electroforesis exitosa. Corrientes más bajas no transfectarán eficazmente las neuronas, mientras que corrientes más altas pueden provocar la muerte del embrión. Después de repetir el procedimiento para cada embrión del primer cuerno uterino, colóquelo suavemente de vuelta en la cavidad abdominal.Después de suturar la capa muscular y la piel, desinfecte cuidadosamente con solución de yodo y retire suavemente la vaselina de los ojos utilizando torundas de celulosa. Coloque al ratón bajo una lámpara de infrarrojos hasta que despierte. Después de sacrificar a la hembra preñada mediante un método aprobado, retire el útero que contiene los embriones y colóquelo en una placa de Petri de 10 centímetros con HBSS completo frío con hielo.A partir de este momento, mantenga todas las soluciones, embriones y cerebros sobre hielo. Mientras trabaje bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas de punta fina y un par de tijeras de resorte Vannas Tubingen para separar cada embrión del útero. Transfiera los embriones a otra placa de Petri que contenga HBSS completo frío con hielo.Realice una incisión a nivel del bulbo raquídeo y corte a lo largo de la línea media sagital. Retire la piel y el cartílago que cubren el cerebro. A continuación, corte el bulbo raquídeo justo detrás de los hemisferios y extraiga el cerebro del cráneo.Transfiera el cerebro con una espátula microscópica a una placa de 12 pocillos que contenga HBSS completo frío con hielo. Recolecte todos los cerebros de la camada en la placa de 12 pocillos. Luego, utilice un estereomicroscopio fluorescente para examinar los cerebros en la placa de 12 pocillos en busca del brillo de la fluorescencia, así como del tamaño de la región electroporada.Seleccione dos a cuatro cerebros con señales fluorescentes intensas y la corteza somatosensorial presunta para su posterior procesamiento. A continuación, vierta una solución fundida de agarosa al 3 % de punto de fusión bajo en un molde desechable desprendible para inclusión. Utilice una espátula microcucharilla para retirar el cerebro de la placa de 12 pocillos y drene cuidadosamente el exceso de HBSS completo alrededor del cerebro usando papel de tejido fino.Coloque suavemente el cerebro en la solución de agarosa. Luego, utilice una aguja de calibre 20 para empujarlo hasta el fondo del molde y ajuste cuidadosamente su posición. Para secciones coronales, oriente el cerebro con los bulbos olfatorios apuntando hacia arriba.Mantenga el molde sobre hielo hasta que la solución de agarosa se solidifique, luego proceda al corte del cerebro. Use una cuchilla limpia para recortar el exceso de agarosa alrededor del cerebro, dejando aproximadamente un milímetro de agarosa en todos los lados, excepto en los bulbos olfatorios, donde deben dejarse dos a tres milímetros de agarosa. Después de aplicar una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato sobre un espécimen, fije el bloque de agarosa recortado con los bulbos olfatorios orientados hacia abajo.Transfiera la platina del espécimen a la cámara de corte de un microtomo de cuchilla vibratoria que contenga HBSS completo frío con hielo y coloque el cerebro con su lado dorsal hacia la cuchilla. Corte secciones cerebrales de 250 micrones de grosor que contengan la región electroporada con una amplitud baja a moderada y una velocidad de corte muy lenta. Por lo general, se obtienen cuatro a seis secciones con una señal fluorescente brillante de cada cerebro electroporado con éxito.Sujete el borde de agarosa de una sección con pinzas de punta fina y tire suavemente de la rebanada hacia una espátula microscópica curvada. De esta manera, transfiera cuidadosamente las rebanadas cerebrales a una placa de seis pocillos que contenga HBSS completo frío con hielo. Humedezca los insertos recubiertos con laminina con 100 microlitros de HBSS completo.Luego, transfiera cuidadosamente las secciones a las membranas utilizando la espátula de microcucharilla doblada y pinzas. Empuje suavemente la sección desde la espátula hacia la membrana y luego colóquela con las pinzas. Continúe transfiriendo las secciones restantes.Se pueden colocar hasta cinco secciones sobre un inserto de membrana. Retire el HBSS completo en exceso con una pipeta. Luego, con la ayuda de pinzas, coloque cuidadosamente los insertos de membrana con las secciones en una placa de seis pocillos que contenga 1,8 mililitros de medio de cultivo para secciones.Seleccione una sección de cerebro para la obtención de imágenes al observar las secciones mediante un microscopio invertido. Elija una sección con neuronas individuales brillantes en la ZVS superior que migren radialmente hacia la superficie pial de la sección. La presencia de finos procesos fluorescentes de células gliales radiales que atraviesan toda la lámina indica un armazón de células gliales radiales intacto, que es utilizado por las neuronas conjugadas en migración.Transfiera el inserto de membrana con un trozo seleccionado a una placa de vidrio de 50 milímetros de diámetro que contenga dos mililitros de medio de cultivo de trozos. Coloque la placa en la cámara climática del microscopio confocal. Establezca la resolución en 512 por 512 píxeles.Aumente la velocidad de escaneo de 400 hercios a 700 hercios para incrementar la tasa de cuadros de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 cuadros por segundo. Utilice no más de dos veces el promediado. Defina una serie Z a través de la región electroporada con un tamaño de paso de 1,5 micrones.Inicie la serie de lapsos de tiempo adquiriendo una serie Z cada 30 minutos. La configuraciones descritas permiten una resolución y brillo suficientes de la imagen, manteniendo al mínimo el daño por fototoxicidad durante la adquisición. Esta película muestra neuronas corticales de E16.5 migrando desde las zonas ventriculares subventriculares hacia la placa cortical.En el transgénico condicional con Bcl11a floxado tras la electroporación del plásmido control IRES-GFP en el día embrionario 14,5. La película consta de 108 cuadros a una velocidad de cinco cuadros por segundo. La barra de escala representa 100 micrones.La electroforesis de un vector plasmídico de ADN que contiene Cre-IRES-GFP afectó la migración de neuronas corticales en cerebros condicionales con Bcl11a floxeados. Como se observa aquí, muy pocas neuronas avanzan más allá de la zona intermedia para alcanzar la placa cortical. Esta película muestra la polarización de neuronas corticales de un control marcado con GFP a la izquierda en comparación con neuronas de un mutante de Bcl11a a la derecha.Estos trazos animados representativos del control en neuronas mutantes de Bcl11a se obtuvieron a partir de series de lapsos de tiempo de cultivos de cortes de E16.5 con resolución de intervalos de una hora. Nuevamente, los datos del cerebro de control se muestran a la izquierda y los datos del cerebro electroporado con Cre-IRES-GFP se muestran a la derecha. Como se observa en este conjunto de trazos representativos de cultivos de cortes de control y mutantes de Bcl11a, las neuronas mutantes de Bcl11a experimentan frecuentemente fases repetitivas de reducción en la velocidad de migración y cambios aleatorios en la orientación, marcados por las flechas rojas.Los perfiles de velocidad pueden calcularse a partir de los rastros de neuronas migratorias. Como se observa aquí, una proporción mayor de neuronas mutantes de Bcl11a presenta velocidades de migración más lentas en comparación con los controles. El ángulo de desviación puede calcularse a partir de los datos del rastreo.Como se observa en este histograma, las neuronas mutantes de Bcl11a representadas por las barras negras presentan ángulos de desviación mayores en comparación con los controles. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de dos horas cada una para la electrotransferencia intraútero y la preparación del cultivo de cortes cerebrales organotípicos. Este procedimiento puede adaptarse fácilmente para realizar el análisis fraccional de genes de interés en neuronas corticales migratorias radiales mediante la ganancia y pérdida de función, así como para experimentos vasculares.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo observar directamente neuronas que migran radialmente en cultivos de cortes organotípicos preparados a partir de cerebros embrionarios electroporados mediante microscopía confocal de lapso de tiempo.

time-lapse-confocal-imaging-migrating-neurons-organotypic-slice

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se presenta un método para preparar cortes organotípicos de embriones de ratón mitad de la gestación para el cultivo y la imagen de lapso de tiempo de extensión del nervio periférico.

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

Este protocolo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el cerebro postnatal y de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

Fuente: Wiegreffe, C., et. al.,  Imágenes confocales de lapso de tiempo de neuronas migratorias en cultivo de corte organotípico de cerebro de ratón embrionario usando En el útero Electroporación. J. Vis. Exp. {{TAG_ 44}} (2017) Este video muestra la microscopía confocal de lapso de tiempo para observar la migración radial de las neuronas corticales desde la zona subventricular a la placa cortical a través de andamios gliales radiales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos.

Imágenes de lapso de tiempo de la migración radial de neuronas corticales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Aquí presentamos un protocolo que proporciona una herramienta para examinar los mecanismos reguladores de genes específicos durante el desarrollo del hipocampo. El empleo de la electroporación ex útero y el cultivo de cortes organotípicos permite la regulación hacia arriba y hacia abajo de la expresión de genes de interés en células individuales y seguir su destino durante el desarrollo.

Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

Este protocolo demuestra un método sencillo y robusto para estudiar el crecimiento del axón in situ y la dinámica del cono de crecimiento. Describe cómo preparar cortes cerebrales agudos fisiológicamente relevantes ex vivo y proporciona una tubería de análisis fácil de usar.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende a observar neuronas migratorias radiales en cultivo organotípico de cerebro de ratón embrionario mediante microscopía confocal de tiempo real. Este método permite analizar mecanismos moleculares de polarización y migración neuronal durante el desarrollo del neocórtex.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario En Utero Electroporación (Video) | JoVE Journal

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario

Explorar más videos