Name: Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a identificar factores metastásicos mediante transferencia génica somática en el modelo murino RIP-Tag; RIP-tva. Este método permite estudiar lesiones precursoras de células β pancreáticas y descubrir nuevas dianas terapéuticas contra el cáncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong y Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. es apoyado por subvenciones de DOD W81XWH-16-1-0619 y NIH grant 1R01CA204916.

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multistep+nature+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The multistep nature of cancer.</a> Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).</li>
<li>Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models in cancer research.</a> Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).</li>
<li>Khanna, C., Hunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in vivo.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).</li>
<li>Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+tumor+progression+factors+by+somatic+gene+transfer+into+a+mouse+model%3A+Bcl-xL+promotes+islet+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion.</a> PLoS biology. 5 (10), e276(2007).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+formation+of+pancreatic+beta-cell+tumours+in+transgenic+mice+expressing+recombinant+insulin%2Fsimian+virus+40+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes.</a> Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).</li>
<li>Fisher, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+flexible+and+specific+gene+delivery+system+for+production+of+murine+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models.</a> Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).</li>
<li>Orsulic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RCAS-TVA-based+approach+to+designer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models.</a> Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).</li>
<li>Tuveson, D., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+medicine%3A+Cancer+lessons+from+mice+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans.</a> Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).</li>
<li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+promotes+metastasis+independent+of+its+anti-apoptotic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity.</a> Nat Commun. 7, 10384(2016).</li>
<li>Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+and+fall+of+apoptosis+during+multistage+tumorigenesis%3A+down-modulation+contributes+to+tumor+progression+from+angiogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors.</a> Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).</li>
<li>Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptor+plasmids+simplify+the+insertion+of+foreign+DNA+into+helper-independent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors.</a> J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).</li>
<li>Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+in+vivo+expression+of+a+muscle-specific+promoter+by+using+avian+retroviral+vectors+for+gene+transfer+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected].</a> J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).</li>
<li>Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest-directed+gene+transfer+demonstrates+Wnt1+role+in+melanocyte+expansion+and+differentiation+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).</li>
<li>Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+RCAS+vectors+useful+for+functional+genomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses.</a> DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).</li>
<li>Bromberg-White, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNA+sequences+by+using+a+replication-competent+avian+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector.</a> J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).</li>
<li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCAS-RNAi%3A+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).</li>
<li>Huse, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PTEN-regulating+microRNA+miR-26a+is+amplified+in+high-grade+glioma+and+facilitates+gliomagenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo.</a> Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).</li>
<li>Ahronian, L. G., Lewis, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+RCAS+virus+from+DF1+chicken+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+tumor+progression+factors+by+somatic+gene+transfer+into+a+mouse+model%3A+Bcl-xL+promotes+islet+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion.</a> PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).</li>
<li>Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+for+hyaluronan-mediated+motility+isoform+B+promotes+liver+metastasis+in+a+mouse+model+of+multistep+tumorigenesis+and+a+tail+vein+assay+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).</li>
<li>Guernet, A., Grumolato, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+editing+of+the+genome+for+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling.</a> Methods. , (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, hemos descrito un modelo de ratón poderoso, RIP-Tag; RIP-tva, lograr el parto génica somática mediante retrovirus aviares para la identificación y caracterización de factores metastáticos. Aunque RIP-Tag; RIP-tva ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos, metástasis factores identificados en este modelo de ratón también pueden promover la metástasis de otros tipos de cáncer.
Nuestro enfoque tiene la ventaja de introducir cambios genéticos somát...

Mayoría de los cánceres se deben a mutaciones somáticas 1. Modelos de ratón modificados genéticamente convencional (GEMM) han proporcionado penetraciones importantes en la contribución de las alteraciones genéticas específicas en tumorigenesis 2. Sin embargo, tienen varias limitaciones. El mayor inconveniente de estos modelos es que no replican la naturaleza esporádica de la formación de tumores en seres humanos, en el que sólo algunas células en un tejido adquirirán alteraciones genéticas. Las mutaciones en ratones transgénicos y knockout son germinales con potencial de afectar el desarrollo. Por otra parte, generar estos modelos de ratón es costoso y desperdiciador de tiempo.
La metástasis es un problema importante en el campo del cáncer. Modelado de metástasis ha sido difícil en GEMM. La metástasis espontánea es rara en el ratón. Penetrancia es variable y latencia es largo en GEMM de metástasis 3. Metástasis experimentales modelos utilizan la inyección directa de células en la circulación de ratones, por lo que se eliminan los primeros pasos en la cascada metastásica.
Para superar algunas de las limitaciones en el estudio de factores metastásicos en modelos de ratón, hemos desarrollado un modelo de ratón de Alfredo, RIP-Tag; RIP-tva4. La estrategia se basa en combinar el uso de un modelo del ratón de la progresión del tumor altamente sincronizada, RIP-Tag 5y el receptor para el virus de la leucosis aviar subgrupo-A, tva 6,7. Esta etiqueta de RIP ; RIP-tvamodelo de ratón permite genes a introducirse somáticamente en una cepa de ratón Alfredo sola. Con el antígeno T de SV40 suprime las funciones supresora de tumor de Rb y p53, ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos en una manera similar a la tumorigénesis humana, con etapas incluyendo hiperplasia, angiogénesis, adenoma y carcinoma invasor. Este modelo de Etiqueta de corte ha sido muy instructivo para la comprensión de las características distintivas del cáncer, no limitado a tumores neuroendocrinos pancreáticos. También se ha utilizado en ensayos preclínicos 8.
Presentamos un protocolo para la transferencia génica somática a través de la inyección de intracardiacally de retrovirus aviar en RIP-Tag; RIP-tva ratones. Exitosa infección con retrovirus aviares RCASBP derivados requiere activamente proliferante de las células diana. Por lo tanto, elegimos RIP-Tag; RIP-tva ratones en 7 semanas de edad, cuando la hiperplasia se desarrolla en aproximadamente el 50% de los islotes pancreáticos. Inyección intracardiaca ventricular izquierdo de virus de alto título es necesaria para lograr una eficiencia de infección del 10-20% 4. Este método reduce la dilución significativa de partículas virales en circulación antes de virus lleguen a islotes pancreáticos.
Usando este acercamiento, previamente hemos demostrado que Bcl-xL promueve la metástasis del cáncer independiente de su anti-apoptotic función 4,9. Esta función de anti-apoptosis-independiente metastásica no se observó cuando Bcl-xL se expresa a través de un transgén en todas las células β pancreáticas a lo largo de la ontogenia tumorígeno en RIP-Tag; RIP-Bcl-xL ratón modelo 10. Por lo tanto, nuestro modelo de ratón ofrece una oportunidad única de identificar y caracterizar las funciones de genes cuando se expresa en una etapa posterior de tumorigénesis. Porque 2-4% de los islotes se convierten en tumores en la RIP-Tag; RIP-tva Alfredo ratones sin infección viral y no todas las lesiones premalignas son infectados con el retrovirus aviares derivado de RCASBP, pueden identificar solamente los factores que confieren una ventaja selectiva sobre el curso natural de la tumorigénesis. En particular, factores metastáticos serán más fácilmente reconocidos por este método, debido a metástasis a ganglios linfáticos pancreáticos o de otros órganos no ocurre normalmente en RIP-Tag; RIP-tva ratones.

<table><tbody><tr><td>Plásmido RCASBP-Y DV</td><td>Addgene</td><td>11478</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido RCAS-RNAi</td><td>Addgene</td><td>15182</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS-/-, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Superfect</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de polialómero</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm Nalgene Filtros con membrana PES Jeringas</td> de insulina <td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td></td><td></td>329461</tr><tr><td>sinaptofisina</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-S284</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidasa, IgG de conejo)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa AmpliTaq con tampón II</td><td>Life Technologies</td><td>N8080153</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq ADN polimerasa</td><td>Bioline</td><td>BIO-21106</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela rip-etiqueta; rip-tva modelo murino

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Cáncer metastásico representa el 90% de las muertes en pacientes con tumores sólidos. Hay una necesidad urgente de entender mejor las causas de la metástasis del cáncer e identificar nuevas dianas terapéuticas. Para investigar los eventos moleculares que conducen a la progresión de cáncer primario a metástasis, hemos desarrollado un modelo de ratón de Alfredo, RIP-Tag; RIP-tva. En este modelo de ratón, el promotor de la insulina de rata (RIP) conduce la expresión del antígeno T de SV40 (Tag) y el receptor para el subgrupo un virus de la leucosis aviar (tva) en las células β pancreáticas. Los ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos con penetrancia de 100% a través de etapas bien definidas que son similares a la tumorigénesis humana, con etapas incluyendo hiperplasia, angiogénesis, adenoma y carcinoma invasor. Porque RIP-Tag; RIP-tva ratones no desarrollan enfermedad metastásica, alteraciones genéticas que promueven la metástasis pueden ser identificados fácilmente. Transferencia génica somática en tva-expresar, proliferando β pancreática las lesiones premalignas se logra a través de la inyección intracardiaca de retrovirus aviares que la alteración genética deseada. Un título de &#62; 1 x 108 unidades infecciosas por ml se considera apropiado para la infección en vivo . Además, retrovirus aviares pueden infectar líneas celulares derivadas de tumores en RIP-Tag; RIP-tva ratones con alta eficiencia. Las líneas celulares también pueden utilizarse para caracterizar los factores metastáticos. Aquí se demuestra cómo utilizar este modelo de ratón y líneas para evaluar las funciones de genes candidatos en metástasis de tumor de la célula.

La tasa de infección en vivo y en vitro de RIP-Tag; RIP-tva las células del tumor por los virus de RCASBP ~ 20% y el ~ 80% respectivamente son 20. En la etiqueta de RIP ; RIP-tva modelo del ratón, aproximadamente 4% de los islotes pancreáticos 400 en cada ratón naturalmente se convertirán en tumores 20; por lo tanto hay una cantidad suficiente de células del tumor en cada ratón para análisis histológico y ...

Presentamos un protocolo para demostrar un sistema de transferencia génica somática novela utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo de ratón para estudiar la función de genes en la metástasis. El retrovirus aviares se entregan intracardiacally para asegurar la transferencia de genes en las lesiones premalignas, no invasivas de las células β pancreáticas en ratones adultos.

Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar y caracterizar factores metastásicos mediante la transferencia génica en el nuevo modelo de ratón RIP-Tag;RIP-tva. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis del cáncer, como la identificación de los factores impulsores y de nuevas dianas terapéuticas. La principal ventaja de este modelo de ratón con cáncer es la capacidad de identificar factores metastásicos mediante la transferencia génica somática en lesiones precursoras de células beta pancreáticas.Comience por cosechar una placa de 15 centímetros de células DF1 productoras de virus por cada ratón que se va a infectar. Primero, recoja el medio de las placas de 15 centímetros con confluentes. Luego elimine los restos celulares mediante centrifugación a baja velocidad en una centrífuga preciclada durante 10 minutos a 1650 ×g y 4 grados centígrados.A continuación, transfiera el sobrenadante viral a tubos de ultracentrifugación de polialón. Centrifugue en una ultracentrífuga durante 1,5 horas a 9540 ×g y 4 grados centígrados. Retire tanto sobrenadante como sea posible de los tubos de ultracentrifugación.Luego, agregue PBS al tubo de ultracentrífuga para obtener una suspensión viral final de 100 microlitros por placa de 15 centímetros. Cubra los tubos con película de laboratorio y re-suspenda el pellet viral invisible mediante vortex durante dos minutos a velocidad media. A continuación, agite los tubos de ultracentrífuga a cuatro grados centígrados durante una hora o durante la noche.Después de la incubación, transfiera la suspensión viral a un tubo de microcentrífuga y proceda a titular el virus. Comience el procedimiento de titulación asegurándose de que las células DF1 sembradas en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos hayan alcanzado una confluencia del 30%. Se necesita una placa de doce pocillos para cada determinación del título viral.Inicie una dilución seriada decimal de los sobrenadantes virales mezclando primero cinco microlitros de sobrenadante viral con 495 microlitros de medio de crecimiento en un tubo de microcentrífuga para obtener una dilución de diez a la segunda. Vortexee brevemente durante unos segundos. Luego, transfiera 40 microlitros de la dilución de diez a la segunda a 360 microlitros de medio de crecimiento en un tubo de microcentrífuga para obtener la dilución de diez a la tercera.Vortex durante unos segundos brevemente. Continúe este proceso para diluir hasta diez a la cuarta y diez a la quinta. A continuación, alícuota 2,25 mililitros de medio de crecimiento en cada uno de cinco tubos de poliestireno de seis mililitros.Y etiquételos como diez a la sexta, diez a la séptima, diez a la octava, diez a la novena y diez a la décima, respectivamente. Mezcle 0,25 mililitros de la dilución diez a la quinta con 2,25 mililitros de medio de crecimiento en el tubo de poliestireno de seis mililitros para la dilución diez a la sexta. Agite brevemente en vórtex durante unos segundos.Repita el procedimiento para diluciones de diez a la séptima, diez a la octava, diez a la novena y diez a la décima. A continuación, retire el medio de cultivo original de las células DF1 en las placas de 12 pocillos y agregue un mililitro de virus diluido en cada pocillo por duplicado.Deje crecer las células a 37 grados Celsius y 5 % de CO2 durante al menos siete días. Comience el procedimiento de infección anestesiando primero un ratón RIP-Tag RIP-tva de siete semanas de edad. Aplique lubricante ocular en ambos ojos para prevenir el secado corneal.Afeite el vello de la cavidad torácica del ratón RIP-Tag RIP-tva, coloque al ratón boca arriba con el tórax hacia arriba sobre papel absorbente para banco de laboratorio colocado encima de una almohadilla térmica segura. Realice una compresión en el dedo del pie para verificar la falta de respuesta del animal y confirmar el efecto completo de la anestesia. Extienda las extremidades delanteras y fíjelas con cinta adhesiva.Marque el pecho del ratón para la inyección. Marque la ubicación a mitad de camino entre la escotadura esternal y la parte superior del proceso xifoides, y ligeramente hacia la izquierda desde el punto de vista anatómico respecto al esternón. Luego, limpie la pared torácica anterior con una solución antiséptica de povidona yodada o con una solución de clorhexidina, seguida de una gasa empapada en isopropanol al 70% o etanol al 70%.Introduzca 50 microlitros de aire en una jeringa estéril de insulina de calibre 28,5 para crear un espacio entre el émbolo y el menisco de una jeringa de 500 microlitros. Aspire 100 microlitros de virus. El espacio de aire sin líquido en la pared es crucial para observar el pulso cardíaco.Mantenga la aguja en posición vertical, tense la piel del ratón con una mano e inserte la aguja en el lugar marcado. Cuando aparezca un pulso brillante de sangre de color rojo en la jeringa, deje de avanzar la aguja y fije la profundidad de la misma en el ratón con una mano. Utilice la otra mano para empujar cuidadosa y lentamente el émbolo y administrar la suspensión viral durante aproximadamente un período de 60 segundos.Administre 10-20 microlitros cada vez que aparezca un pulso de sangre roja brillante en la jeringa. La entrada continua de sangre roja oxigenada en el conector transparente de la aguja indica la posición correcta de la aguja en el ventrículo izquierdo. Después del último empujón del émbolo para administrar la suspensión viral y antes de observar el siguiente pulso rojo de sangre, retire rápidamente la aguja de la cavidad torácica.Aplique presión suave sobre el sitio de inyección durante al menos un minuto para reducir el sangrado. Luego, traslade cuidadosamente el ratón a una almohadilla calefactora o bajo una lámpara de calor hasta que recupere completamente la conciencia. Los ratones RIP-Tag RIP-tva fueron infectados con el retrovirus RCASBP-Bcl-xL indicado a las siete semanas de edad y sacrificados a las 16 semanas de edad.Esta fotografía muestra la tinción representativa de sinaptofisina en tumores neuroendocrinos pancreáticos metastásicos en ganglios linfáticos pancreáticos. Aquí, los ratones RIP-Tag RIP-tva fueron infectados con el RCASBP-RHAM B indicado. Esta fotografía muestra la tinción representativa de sinaptofisina en tumores neuroendocrinos pancreáticos metastásicos en ganglios linfáticos pancreáticos. Aquí, la tinción de sinaptofisina se observa en el hígado tras la inyección del virus RCASBP-RHAMM B.Es importante recordar que se requiere un título mayor de diez a la ocho unidades infecciosas por mililitro para la infección in vivo de células TVA proliferantes en el ratón RIP-Tag RIP-tva, y que el receptor retroviral RCASBP puede entregar ADNc hasta de 2,5 kilobases. Tras el desarrollo de este modelo de ratón, se allanó el camino hacia un hallazgo paradigmático: que BCL-xL promueve en realidad la metástasis del cáncer de forma independiente a su función antiapoptótica.

identification-characterization-metastatic-factors-gene-transfer-into

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video describe el protocolo para la inyección intracardíaca de retrovirus en el ratón transgénico para asegurar la transferencia de genes a las lesiones pancreáticas β premalignas en proliferación. Este método también puede ayudar a evaluar las funciones de los genes candidatos en la metástasis tumoral.

Administración intracardíaca de vectores virales: una técnica para inyectar vectores virales por vía intracardíaca para estudiar la metástasis pancreática en un modelo murino

La activación de mutaciones latentes con adenovirus Cre en los resultados del sistema ductal de mama en un cáncer de mama metastásico clínicamente relevante. La incorporación de un promotor YFP permite el seguimiento de las células tumorales metastásicas distales. Este modelo es útil para estudiar la metástasis latentes, la inmunidad anti-tumoral, y para el diseño de nuevas inmunoterapias para tratar el cáncer de mama.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Se describe un método relativamente simple para ex vivo de imágenes en vivo de las interacciones célula-estroma tumoral dentro de la metástasis de pulmón, utilizando reporteros fluorescentes en ratones. Uso de hilado de disco microscopía confocal, esta técnica permite la visualización de células vivas durante al menos 4 horas y podría adaptarse para estudiar otras condiciones inflamatorias pulmonares.

Ex vivo de imágenes en vivo de metástasis pulmonar y su microambiente

Aquí describimos el modelo y el enfoque para estudiar las funciones de los macrófagos alveolares pulmonares en la metástasis del cáncer. Para demostrar el papel de estas células en la metástasis, se utilizó el modelo singénico (4T1) de cáncer de mama junto con la depleción de macrófagos alveolares con liposomas de clodronato.

El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

Los modelos preclínicos que evalúan la terapia adyuvante dirigida a la metástasis del cáncer de mama están ausentes. Para tratar esto, se desarrolló un modelo murino de metástasis de adenocarcinoma mamario pulmonar de novo , en el que se pueden evaluar las terapias administradas en la configuración adyuvante (resección postquirúrgica de tumores primarios) en cuanto a eficacia en el impacto de metástasis pulmonares previamente sembradas.

Procedimientos quirúrgicos y metodología para un modelo murino preclínico De Novo Metástasis del cáncer mamario

Se describe un protocolo para la preclínica en vivo rastreo de metástasis del cáncer. Se basa en un reportero con radionúclidos-fluorescencia combina el sodio yoduro symporter, detectado por tetrafluoroborato de no invasivo [18F]-PET y una proteína fluorescente para la confirmación de racionalización ex vivo . El método es aplicable para la preclínica en vivo de la célula de seguimiento más allá de la biología del tumor.

Gen reportero de radionúclido-fluorescencia de imagen para seguir la progresión del Tumor en modelos de roedores Tumor

Describimos en detalle un modelo de tumor de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal clínicamente relevante (CRLM) y la influencia de la reperfusión de isquemia hepática (I/R) en el crecimiento tumoral y la metástasis. Este modelo puede ayudar a entender mejor los mecanismos subyacentes promoción inducida por cirugía del crecimiento metastásico hepático.

Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.

Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo de membrana corioalantoica intravital de pollitos rápido y cuantitativo

Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.

Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

Aprende a identificar factores metastásicos mediante transferencia génica somática en el modelo murino RIP-Tag; RIP-tva. Este método permite estudiar lesiones precursoras de células β pancreáticas y descubrir nuevas dianas terapéuticas contra el cáncer.

Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino (Video) | JoVE Journal

Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino

Explorar más videos