Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino
16 de octubre de 2017
Presentamos un protocolo para demostrar un sistema de transferencia génica somática novela utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo de ratón para estudiar la función de genes en la metástasis. El retrovirus aviares se entregan intracardiacally para asegurar la transferencia de genes en las lesiones premalignas, no invasivas de las células β pancreáticas en ratones adultos.
El objetivo general de este procedimiento es identificar y caracterizar los factores metastásicos mediante la transferencia de genes al nuevo RIP-Tag; Modelo de ratón RIP-tva. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis del cáncer, como la identificación de los impulsores y las nuevas dianas terapéuticas. La principal ventaja de este modelo murino de cáncer es la identificación de factores metastásicos mediante la transferencia de genes somáticos a legiones de precursores de células beta pancreáticas.
Comience cosechando un plato de 15 centímetros de células DF1 productoras de virus por ratón que se infecte. Primero, recoja el medio de los platos confluentes de 15 centímetros. A continuación, elimine los restos de la célula mediante centrifugación a baja velocidad en una centrífuga preenfriada durante 10 minutos a 1650 veces G y cuatro grados centígrados.
A continuación, transfiera el sobrenadante viral a tubos de ultracentrífuga de polialómero. Centrifugar en una ultracentrífuga durante 1,5 horas a 9540 veces G y cuatro grados centígrados. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante de los tubos de ultracentrífuga.
Luego agregue PBS al tubo de ultracentrífuga para hacer la suspensión viral final de 100 microlitros por plato de 15 centímetros. Cubra los tubos con una película de laboratorio y vuelva a suspender la bolita viral invisible mediante vórtice durante dos minutos a velocidad media. A continuación, agite los tubos de ultracentrífuga a cuatro grados centígrados durante una hora o toda la noche.
Después de la incubación, transfiera la suspensión viral a un tubo de microcentrífuga y proceda a titular el virus. Comience el procedimiento de titulación asegurándose de que las células DF1 asentadas en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos hayan alcanzado el 30 % de confluencia. Se necesita una placa de doce pocillos para cada determinación de título viral.
Comience una dilución en serie de diez veces de los sobrenadantes virales mezclando primero cinco microlitros de sobrenadante viral con 495 microlitros de medio de crecimiento en un tubo de microcentrífuga para hacer una dilución de diez a dos. Vórtice brevemente durante unos segundos. Luego transfiera 40 microlitros de la décima a la segunda dilución a 360 microlitros de medio de crecimiento en un tubo de microcentrífuga para la diez a la tercera dilución.
Vórtice brevemente durante unos segundos. Continúe este proceso para diluir a diez a la cuarta y de diez a la quinta. A continuación, alícuota 2,25 mililitros de medio de crecimiento en cada uno de los cinco tubos de poliestireno de seis mililitros.
Y etiquétalos de diez a diez, de diez a siete, de diez a octavo, de diez a noveno y de diez a diez, respectivamente. Mezcle 0,25 mililitros de la dilución de diez a la quinta con 2,25 mililitros de medio de crecimiento en el tubo de poliestireno de seis mililitros para la dilución de diez a la sexta. Vórtice brevemente durante unos segundos.
Repita el procedimiento para las diluciones de diez a la séptima, de diez a la octava, de diez a la novena y de diez a la décima. A continuación, retire el medio de cultivo original de las celdas DF1 en las placas de 12 pocillos. Y agregue un mililitro de virus diluido en cada pocillo por duplicado.
Permita que las células crezcan a 37 grados centígrados y 5 CO2 durante al menos siete días. Comience el procedimiento de infección anestesiando primero a un ratón RIP-Tag RIP-tva de siete semanas de edad. Aplique lubricante ocular en ambos ojos para prevenir la sequedad de la córnea.
Afeita el pelo de la cavidad torácica del ratón RIP-Tag RIP-tva, coloca el ratón boca arriba con el pecho hacia arriba sobre un papel absorbente de laboratorio encima de un calentador seguro para acurrucarse. Realice un pellizco en el dedo del pie para verificar si el animal no responde y para confirmar el efecto de la anestesia completa. Extienda las extremidades delanteras y asegúrelas con cinta adhesiva.
Marque el pecho del ratón para la inyección. Marque la ubicación a medio camino entre la escotadura esternal y la parte superior de la apófisis xifoides, y ligeramente a la izquierda anatómicamente del esternón. A continuación, frote la pared torácica anterior con un exfoliante de povidona yodada o un exfoliante de clorhexidina, seguido de una esponja de gasa empapada en alcohol isopropílico al 70% o al 70%.
Extraiga 50 microlitros de aire en una jeringa estéril de insulina de calibre 28.5 para crear espacio entre el émbolo y el menisco de una jeringa de 500 microlitros. Extrae 100 microlitros de virus. El espacio aéreo sin líquido en la pared es crucial para ver el pulso cardíaco.
Mantenga la aguja en posición vertical, sostenga la piel del ratón tensa con una mano e inserte la aguja en el lugar marcado. Cuando aparezca un pulso de sangre de color rojo brillante en la jeringa, deje de avanzar la aguja y fije la profundidad de la aguja en el ratón con una mano. Use la otra mano para empujar cuidadosa y lentamente el émbolo para administrar la suspensión viral durante un período de aproximadamente 60 segundos.
Administre de 10 a 20 microlitros cada vez que aparezca un pulso de sangre de color rojo brillante en la jeringa. La entrada continua de sangre roja oxigenada en el centro transparente de la aguja indica la posición correcta de la aguja en el ventrículo izquierdo. Después del último empujón del saqueo para liberar la suspensión viral y antes de ver el próximo pulso rojo de sangre, retraiga rápidamente la aguja fuera de la cavidad torácica.
Aplique una presión suave sobre el sitio de la inyección durante al menos un minuto para reducir el sangrado. Luego, mueva con cuidado el mouse sobre una almohadilla térmica o debajo de una lámpara de calor hasta que esté completamente consciente. Los ratones RIP-Tag RIP-tva se infectaron con el retrovirus RCASBP-Bcl-xL indicado a las siete semanas de edad y se les practicó la eutanasia a las 16 semanas de edad.
Esta fotografía muestra la tinción representativa de sinaptofisina de tumores neuroendocrinos pancreáticos metastásicos en ganglios linfáticos pancreáticos. Aquí, los ratones RIP-Tag RIP-tva se infectaron con el indicado RCASBP-RHAM B. Esta fotografía muestra la tinción representativa de sinaptofisina de tumores neuroendocrinos pancreáticos metastásicos en ganglios linfáticos pancreáticos. En este caso, la tinción de sinaptofisina se observa en el hígado después de la inyección del virus RCASBP-RHAMM B.
Es importante recordar que el título de más de diez a ocho unidades infecciosas por mililitro se requiere para la infección in vivo de células TVA en proliferación en ratones RIP-Tag, RIP-tva y el rector retroviral RCASBP puede entregar CDNA de hasta 2,5 kilobases. Después del desarrollo de este modelo de ratón, allanó el camino para un cambio de paradigma que descubrió que BCL-xL en realidad promueve la metástasis del cáncer independientemente de su función antiapoptótica.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para un nuevo sistema de transferencia génica somática que utiliza el modelo de ratón RIP-Tag; RIP-tva para investigar las funciones génicas en metástasis. El método implica la administración intracardiaca de retrovirus aviarios para dirigirse a lesiones pancreáticas pre-malignas en células β en ratones adultos.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Terapia Genética
Antecedentes
- Comprender la metástasis del cáncer es fundamental para desarrollar terapias eficaces.
- El modelo de ratón RIP-Tag; RIP-tva permite la transferencia dirigida de genes.
- Los retrovirus aviares pueden utilizarse para una entrega eficiente de genes.
- Este enfoque se centra en lesiones precursoras de células β pancreáticas.
Objetivo del estudio
- Identificar y caracterizar factores metastásicos mediante transferencia génica.
- Explorar posibles dianas terapéuticas en el tratamiento del cáncer.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos que impulsan la metástasis.
Métodos Utilizados
- Recolección de células DF1 para la producción de virus.
- Recopilación y centrifugación del medio de cultivo celular.
- Administración intracardiaca de retrovirus para dirigirse a lesiones diana.
- Caracterización de la función génica en procesos metastásicos.
Resultados principales
- Transferencia exitosa de genes a lesiones en células β pancreáticas.
- Identificación de factores clave implicados en la metástasis.
- Nuevos objetivos terapéuticos potenciales para el tratamiento del cáncer.
- Validación del modelo RIP-Tag; RIP-tva para la investigación del cáncer.
Conclusiones
- El protocolo demuestra un método eficaz para estudiar la metástasis.
- Los hallazgos podrían conducir a avances en las terapias contra el cáncer.
- El modelo RIP-Tag; RIP-tva es una herramienta valiosa para investigaciones futuras.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la identificación sistemática de genes que impulsan la metástasis en un modelo bien definido de tumor neuroendocrino pancreático, abordando una brecha crítica en la validación preclínica de dianas terapéuticas. Al permitir la transferencia génica somática a lesiones premalignas, facilita la desactivación mecanicista de dianas terapéuticas candidatas antes de realizar estudios costosos in vivo. La penetrancia tumoral del 100 % y las etapas definidas de progresión del modelo proporcionan una plataforma reproducible para evaluar la función génica en la metástasis, informando directamente las decisiones de confianza en dianas y de selección de carteras en el descubrimiento de fármacos oncológicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas mediante la comprobación de si genes específicos promueven o suprimen la metástasis in vivo.
- Valor operativo: Utiliza transferencia génica somática para sortear las limitaciones de la línea germinal, permitiendo la evaluación rápida de múltiples candidatos en el mismo fondo genético.
- Valor predictivo: Identifica factores que promueven la metástasis independientemente de la apoptosis, como se demostró con BCL-xL, revelando mecanismos no canónicos que podrían pasar desapercibidos en ensayos estándar.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera líneas celulares isogénicas metastásicas y no metastásicas a partir del mismo fondo tumoral, lo que permite una comparación controlada de la función génica en invasión y colonización.
- Valor operativo: Los vectores retrovirales aviares logran una infección de alta eficiencia en células que expresan TVA, favoreciendo la producción a gran escala de líneas celulares modificadas para ensayos posteriores.
- Preparación para ensayos: Títulos virales >1x10^8 IU/mL garantizan una infección in vivo consistente, proporcionando un punto de referencia cuantitativo para la reproducibilidad experimental entre estudios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Caracteriza factores metastásicos en un modelo que recapitula las etapas de la tumorigénesis humana, desde hiperplasia hasta carcinoma invasivo, mejorando la relevancia traslacional.
- Valor operativo: Permite el seguimiento longitudinal de la metástasis a órganos como el hígado y los ganglios linfáticos mediante inmunohistoquímica, apoyando la validación histopatológica de los efectos génicos.
- Reducción de riesgos: Identifica genes que impulsan la metástasis sin requerir la formación de tumores primarios, centrándose en reguladores auténticos de la metástasis.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la generación de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica, permitiendo específicamente la validación funcional de genes asociados a metástasis identificados mediante estudios ómicos o campañas de cribado.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante estudios de ganancia o pérdida de función en vías metastásicas dentro de un modelo tumoral definido.
- Tamizaje: Genera líneas celulares modificadas genéticamente de forma estandarizada que pueden utilizarse en ensayos de invasión, migración o colonización para priorizar los resultados positivos de los tamizajes primarios.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de la carga metastásica mediante la incidencia tumoral en órganos y la puntuación histopatológica, permitiendo comparaciones estadísticas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona la función génica con la progresión metastásica en un sitio orgánico clínicamente relevante, apoyando la alineación de biomarcadores para su validación posterior.
- Reutilización Empresarial: El modelo RIP-Tag;RIP-tva y el sistema retroviral basado en DF1 pueden reutilizarse en múltiples proyectos, reduciendo los costos de redesarrollo en estudios de metástasis.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al aislar la función metastásica de los genes de sus efectos sobre el crecimiento del tumor primario o la apoptosis.
- Valor operativo: Estandariza la entrega de genes mediante inyección intracardiaca con títulos virales definidos, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios y reduciendo la variabilidad en los ensayos de metástasis.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar al distinguir los verdaderos impulsores de la metástasis de las alteraciones pasajeras, evitando inversiones en falsos positivos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en actividad validada de promoción o supresión de metástasis, mejorando la eficiencia del capital en las líneas de desarrollo oncológico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía de ratón, manipulación viral y protocolos de nivel 2 de bioseguridad para el uso de retrovirus aviares.
- Depende del equipo de ultracentrifugación para la concentración viral y la determinación del título mediante ensayos de infección en células DF1.
- Necesita la estandarización del título viral (>1x10^8 UI/mL) y del volumen de inyección (100 µL) en todos los experimentos para garantizar un enfoque constante de las lesiones.
- Se limita a modelos que expresan TVA; la adaptación a otros sistemas requiere la generación de líneas correspondientes positivas para el receptor.
- La evaluación metastásica depende de la histología de punto final, lo que requiere apoyo especializado de patología para la detección de lesiones en órganos como el hígado y los ganglios linfáticos.
