Análisis de alto rendimiento del comportamiento Locomotor en el ensayo de la isla de Drosophila
5 de noviembre de 2017
La isla es un ensayo novedoso y rentable que puede utilizarse para evaluar el comportamiento locomotor básico de Drosophila melanogaster. Este manuscrito describe algoritmos para el procesamiento automático de datos y cuantificación objetiva de los datos de ensayo isla, haciendo de este ensayo una lectura sensible, de alto rendimiento para grandes pantallas genéticos o farmacológicos.
El objetivo general del ensayo de isla es evaluar el comportamiento locomotor básico de Drosophila melanogaster mediante procesamiento automático de datos y cuantificación objetiva. Este método puede utilizarse para identificar reguladores clave del comportamiento locomotor, como genes implicados en trastornos del movimiento. Asimismo, puede emplearse para probar fármacos que podrían revertir tales defectos.
La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación de alto rendimiento del comportamiento locomotor de Drosophila, lo que la hace adecuada para cribados a gran escala. Decidimos desarrollar esta metodología para poder analizar un gran número de modelos de enfermedades. Necesitábamos un análisis automatizado de datos de imágenes para hacer esto factible.
La demostración visual de este método es muy útil. Varios pasos del procesamiento beta son cruciales y podrían resultar difíciles para los nuevos usuarios, especialmente para aquellos que no están familiarizados con los paquetes de software utilizados. Primero, prepare un mínimo de tres viales por condición experimental como réplicas biológicas.
Cada archivo debe contener aproximadamente 15 moscas del mismo sexo y edad similar. Es importante que las moscas tengan alas intactas. Cree las carpetas para almacenar los experimentos.
Genere estos en una estructura de directorios definida por las condiciones y los réplicas. Por ejemplo, si el experimento tiene dos genotipos con cinco réplicas cada uno, cree una carpeta principal con la fecha del experimento y, dentro de esa carpeta, cree una subcarpeta para cada genotipo. Luego, dentro de las carpetas de genotipo, cree subcarpetas para cada réplica.
A continuación, prepare el aparato de prueba. Añada agua fría con una pequeña cantidad de jabón a la bandeja del baño y coloque la plataforma en el centro del baño, si aún no está fijada en él. Cubra la bandeja y la plataforma con una caja transparente.
Para iluminar la plataforma, coloque una lámpara fría, como LEDs ordinarios de 12 voltios, por encima de ella. Coloque también una cámara web conectada a una computadora directamente encima de la plataforma. En la computadora, abra el software de grabación de imágenes.
Desde el sistema de menú, seleccione la cámara web adecuada como dispositivo de captura. Coloque una mosca muerta sobre la isla para ajustar la configuración de video. Ajuste el brillo, el contraste y el color en el software para que la mosca muerta aparezca negra sobre un fondo blanco.
A continuación, ajuste la configuración de la película lapse para guardar las películas como archivos AVI. Luego, busque el directorio donde deben guardarse los datos y defina el nombre de la película. Guarde estos cambios.
Para la compresión de los datos de imagen, elija el código Intel IYUV. Establezca la velocidad de grabación en un cuadro cada 0,1 segundos y ajuste la velocidad de reproducción correspondiente a 10 imágenes por segundo. Por último, vaya a la configuración avanzada y seleccione Crear una imagen bmp para cada cuadro capturado.
A continuación, navegue hasta el mismo directorio que ha elegido para alojar los archivos AVI y presione aceptar. Antes de comenzar, asegúrese de que la isla esté vacía y limpia. Luego, inicie la grabación en la interfaz de imágenes de lapso de tiempo del software de grabación de imágenes.
Tome un vial que contenga moscas y golpéelo dos o tres veces para hacer que todas las moscas caigan al fondo. Luego, retire rápidamente el tapón del vial y golpee vigorosamente para hacer caer las moscas sobre la plataforma. Todas deberían impactar en la plataforma aproximadamente al mismo tiempo.
Permita que las moscas tarden hasta 30 segundos en abandonar la plataforma, luego detenga la grabación. Si es necesario, retire manualmente cualquier mosca restante de la plataforma. Antes de pasar al siguiente experimento, asegúrese de volver a definir el directorio donde se almacenará el siguiente conjunto de datos.
La primera tarea consiste en producir pilas y proyecciones de las series de imágenes recopiladas. En Fiji, abra el Drosophila Island Assay. En la nueva ventana, ingrese el identificador de la primera serie temporal de imágenes.
A continuación, seleccione únicamente la pila de creación y el submacro de proyección. Haga clic en aceptar y dirija la computadora a la carpeta que contiene todas las subcarpetas con los experimentos individuales del ensayo de islas. Después de procesar los datos, aparecerán dos archivos nuevos en cada subcarpeta experimental individual.
La siguiente tarea consiste en definir la ubicación exacta de la plataforma en las imágenes. Abra la interfaz gráfica y seleccione la casilla definir plataforma. A continuación, elija el directorio donde se almacenan las subcarpetas experimentales.
Se abrirá la imagen de proyección y dos ventanas. En la primera imagen, dibuje un polígono sobre la plataforma de la isla utilizando la herramienta de selección de polígono. No incluya la línea del borde en el perímetro de la plataforma en esta selección.
Agregue la selección a la ventana del administrador de ROI haciendo clic en agregar en la ventana del administrador de ROI. Después de agregar la selección al administrador de ROI, aparecerá como un conjunto de valores. Luego, haga clic en aceptar en la ventana definir la plataforma.
El software avanzará a la siguiente imagen de proyección almacenada en la carpeta. Continúe aplicando la misma ROI para la plataforma a la siguiente imagen de proyección seleccionando la ROI almacenada en el administrador de ROI y confirmando esta ROI en la ventana definir la plataforma. Antes de pasar a la siguiente imagen de proyección, asegúrese de que la plataforma no se haya movido durante el experimento.
Si la posición de la plataforma se movió, haga clic izquierdo en el centro de la selección y arrástrela a la posición requerida. Si el cuadro de selección no coincide con la plataforma, haga clic izquierdo fuera de la selección y delimite una nueva selección para la plataforma utilizando la herramienta de polígono. Agregue esta nueva selección al administrador de ROI.
Luego, verifique la nueva selección haciendo clic en aceptar en la ventana de definición de plataforma, y continúe el procedimiento hasta que todas las imágenes tengan plataformas definidas correctamente. La tarea final antes de procesar los datos es definir el tamaño mínimo para una mosca. Esto se explica en el protocolo de texto.
Para cuantificar las moscas que escapan de la plataforma, primero establezca el tamaño mínimo de la mosca. Luego, indique el número máximo de moscas en un archivo dentro de la serie experimental. Inicie la función de análisis y, cuando se le solicite, seleccione el directorio principal del experimento.
Después de ejecutar la macro, observe que apareció un nuevo archivo de resultados y una nueva pila de imágenes en cada carpeta. Abra estos archivos para asegurarse de que el procedimiento funcionó correctamente. Inicie el paquete de software R o RStudio y abra el script de análisis del ensayo de islas para procesar todos los experimentos simultáneamente.
El script debe editarse correctamente para que el análisis tenga éxito. En la fila 16 del script, inserte la ruta al directorio principal que contiene los experimentos que se analizarán. Inserte la ruta a la carpeta donde se deben almacenar los archivos de resultados del análisis en la fila 19.
Este último debe ser una ubicación diferente al directorio que contiene los datos de imagen que se analizarán. Ahora, ejecute el script desde la barra de herramientas y continúe con el análisis de los resultados. El script de análisis del ensayo de islas exporta un gráfico de líneas para cada condición experimental.
El gráfico muestra el porcentaje de moscas que permanecen en la plataforma a lo largo del tiempo para cada réplica de esa condición. El gráfico de líneas exportado, respuesta de escape: todas las condiciones, resume el promedio y el error estándar de la media de la respuesta de escape en vuelo para las primeras 12 condiciones experimentales presentes en la carpeta principal. Se calcula el área bajo la curva para cada réplica experimental con el fin de determinar si las condiciones experimentales difieren significativamente entre sí.
El área bajo la curva y el valor mediano para cada condición experimental se exportan como una gráfica. Dependiendo del número de condiciones presentes en la carpeta principal, el script realizará una prueba T de Welch no apareada de dos colas para dos condiciones, o un anova con dos correcciones clave para más de dos condiciones. Todos los datos numéricos calculados por el script de análisis del ensayo de islotes también se exportan y guardan como archivos csv o txt en la carpeta de salida de datos.
La ataxia telangiectasia es un trastorno del movimiento de herencia autosómica recesiva causado por mutaciones en el gen ATM. La enfermedad se caracteriza por la aparición temprana de ataxia cerebelosa. Se examinó el efecto de la inhibición ubiquitaria del ortólogo de ATM en Drosophila mediante el ensayo de la isla y se comparó con los controles.
En general, la reducción ubicua del ortólogo de ATM en Drosophila, Tefu, disminuyó significativamente el rendimiento locomotor en el ensayo de la isla en comparación con los controles del fondo genético. El análisis manual de los datos registrados del ensayo de la isla arrojó el mismo resultado que el análisis automatizado. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión sobre cómo realizar el ensayo de la isla, cómo ejecutar la macro del ensayo de la isla en Drosophila y cómo operar el script de análisis del ensayo de la isla.
Al intentar este protocolo, es importante recordar que la calidad de la segmentación de imágenes está correlacionada con la calidad de los videos. Cuanto mejor sea el contraste, más fluido será el análisis. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren la capacidad locomotora en Drosophila con alto rendimiento.
Después de utilizar este ensayo, se pueden emplear otros ensayos, como los que evalúan la geotaxis negativa, para investigar más a fondo los defectos locomotores.
Descripción general
El ensayo de isla es un método novedoso para evaluar el comportamiento locomotor de Drosophila melanogaster mediante procesamiento automatizado de datos. Esta técnica permite el cribado de alto rendimiento para estudios genéticos y farmacológicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis del comportamiento
- Tamizaje genético
Antecedentes
- El ensayo de isla evalúa el comportamiento locomotor básico en moscas de la fruta.
- Identifica reguladores clave de los trastornos del movimiento.
- Este método permite cribados a gran escala de modelos de enfermedades.
- El análisis automatizado de imágenes mejora la eficiencia del procesamiento de datos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo de alto rendimiento para el análisis del comportamiento locomotor.
- Facilitar la identificación de factores genéticos que afectan el movimiento.
- Probar agentes farmacológicos que puedan corregir defectos locomotores.
Métodos Utilizados
- Preparación de condiciones experimentales con réplicas biológicas.
- Configuración del aparato de grabación con iluminación y cámara adecuadas.
- Captura y procesamiento automatizados de imágenes mediante software específico.
- Cuantificación del comportamiento de las moscas basada en parámetros definidos.
Resultados principales
- Implementación exitosa del ensayo de isla para el análisis locomotor.
- Generación de datos cuantificables para pantallas genéticas de gran tamaño.
- Identificación de posibles candidatos a fármacos para trastornos del movimiento.
- Establecimiento de una metodología reproducible para estudios futuros.
Conclusiones
- El ensayo de isla proporciona un marco confiable para estudiar el comportamiento locomotor.
- El procesamiento automatizado mejora la eficiencia de la recolección de datos.
- Este método es adecuado para cribados genéticos y farmacológicos de alto rendimiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo de isla permite la cuantificación automatizada y de alto rendimiento del comportamiento locomotor de Drosophila, abordando un cuello de botella crítico en la validación de dianas para trastornos del movimiento. Al convertir el análisis manual de videos en datos objetivos y reproducibles, este ensayo facilita la realización de cribados escalables de moduladores genéticos y farmacológicos de la función locomotora. Esto sitúa al ensayo como una herramienta informativa desde el punto de vista mecanicista y rentable para reducir los riesgos en programas de descubrimiento en etapas iniciales en el campo de la neurología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la respuesta locomotora de escape como un indicador funcional de los efectos del silenciamiento génico o del tratamiento con fármacos.
- Valor operativo: Facilita la desviación biológica mediante la medición automatizada y objetiva del comportamiento de la mosca en diferentes condiciones genéticas, reduciendo el sesgo del observador en el cribado fenotípico.
- Valor predictivo: Genera métricas de área bajo la curva y respuesta media de escape que facilitan el análisis comparativo y la priorización de dianas con fenotipos locomotores significativos.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera datos estandarizados y resueltos temporalmente sobre la locomoción, lo que permite una evaluación confiable de compuestos en cribados a gran escala de modificadores de trastornos del movimiento.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad del ensayo mediante tuberías automatizadas de procesamiento de imágenes (Fiji y R) que minimizan la variabilidad técnica entre réplicas y lotes experimentales.
- Escalabilidad: Compatible con flujos de trabajo de alto rendimiento debido a la configuración de bajo costo (cámara web, iluminación LED) y compatibilidad con software de código abierto, lo que posibilita su amplia adopción en laboratorios.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad traslacional: Conecta modelos genéticos de Drosophila (por ejemplo, la reducción del ortólogo de ATM) con los mecanismos de trastornos del movimiento en humanos mediante fenotipos locomotores conservados.
- Reducción mecanicista de riesgos: Proporciona lecturas conductuales cuantitativas que ayudan a distinguir déficits motores generales de defectos específicos de coordinación o resistencia, mejorando la confianza en el blanco.
- Alineación preclínica: Permite el análisis de respuesta a la dosis y del curso temporal de agentes farmacológicos, facilitando la evaluación temprana de la eficacia en sistemas relevantes para la enfermedad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo de isla se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos iniciales, ofreciendo un puente de fenotipificación conductual entre la selección genética y el seguimiento mecanicista en programas de neurología.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la validación de dianas al vincular perturbaciones genéticas (por ejemplo, la reducción de ATM) con déficits locomotores cuantificables, permitiendo la interrogación de dianas basada en hipótesis.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante la cuantificación automatizada de la huida de las moscas en el plataforma a lo largo del tiempo, generando lecturas fenotípicas dependientes de la dosis y del tiempo, adecuadas para la selección en bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Exporta valores de área bajo la curva y valores medianos junto con resultados estadísticos (prueba t de Welch o ANOVA), lo que permite comparaciones entre condiciones y la selección de compuestos activos en campañas de cribado.
- Investigación Traducional: Se alinea con el cribado fenotípico en modelos de enfermedad al demostrar defectos locomotores conservados en modelos de Drosophila de ataxia humana, apoyando la continuidad mecanicista.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable y estandarizada para la evaluación locomotora que puede aplicarse a múltiples dianas, genotipos y cribados de compuestos sin necesidad de revalidación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista mediante una cuantificación objetiva y de alta resolución del comportamiento.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante el procesamiento automatizado de datos, minimizando el esfuerzo manual y la variabilidad entre usuarios en ensayos a gran escala.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción (go/no-go) al proporcionar datos fenotípicos cuantitativos tempranos que reducen el riesgo de fracaso en fases avanzadas del desarrollo de neuroterapéuticos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas y compuestos basada en datos estadísticamente robustos de respuesta locomotora, mejorando la eficiencia del capital en las carteras de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere familiaridad con Fiji y R/RStudio para la ejecución de macros y análisis basado en scripts, lo que implica una formación básica en bioinformática o análisis de imágenes.
- Depende de condiciones de adquisición de imágenes consistentes (iluminación, contraste, estabilidad de la plataforma) para garantizar una segmentación precisa de las moscas y una cuantificación confiable entre experimentos.
- Requiere una preparación estandarizada de las moscas (alas intactas, edad, sexo, densidad) para minimizar la variabilidad biológica y asegurar la reproducibilidad del ensayo.
- Incluye pasos manuales de configuración (definición de la región de interés en la plataforma, umbral mínimo del tamaño de la mosca) que deben aplicarse rigurosamente para mantener la integridad de los datos entre lotes.
- Se limita al análisis del comportamiento en plano 2D; no captura el vuelo vertical ni secuencias motoras complejas, por lo que se necesitan ensayos complementarios para un perfilamiento conductual completo.
