Name: Inducción y diagnóstico de tumores en Drosophila Imaginal Disc Epitelio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a inducir clones mosaicos tumorales en discos imaginales de Drosophila mediante el sistema GAL4-UAS. Este protocolo permite clasificar etapas del desarrollo tumoral para investigación oncológica.

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Damos las gracias a J. Vaughen por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de JSPS KAKENHI Grant Números 26891025, 15H01500 y la Fundación de Ciencias de Takeda Subvención de investigación a YT

1. Cruces de la mosca y inducción del clon <ol><li> Eliminar todas las moscas en el vial 12 h antes de recoger virgen moscas. </li><li> Anestesiar las moscas en el vial inyectando gas CO 2 y colocar moscas en una almohadilla de mosca de CO 2 . </li><li> Transferir de 10 a 20 hembras virgenes y 10 machos de la almohadilla de mosca de CO 2 a un vial nuevo e incubar durante 1 día a 25 ° C. </li><li> Transferir estas moscas en un vial nuevo e incubar durante 12 h a 25 ° C. NOTA: Deseche el primer vial ya que las hembras virgen no ponen suficientes huevos en el primer día. </li><li> Para líneas enhancer-GAL4, retire las moscas adultas e incube el vial a 25 ° C hasta disección. </li><li> Para la inducción de los clones del mosaico mediante el flip-out-GAL4, retire las moscas adultas e incube el vial durante 2-4 días a 25 ° C. El tiempo de incubación antes del choque térmico depende del propósito experimental. Un choque térmico 2 días después de la deposición del huevo (AED) genera clones de mosaico en segundos inmadurosInstar epitelios imaginal. Un shock térmico después de 3 ó 4 días de DEA genera clones de mosaico en epitelios imaginarios diferenciados de instar temprano a mediados del tercer instar. NOTA: Es importante examinar el efecto del tiempo de choque térmico alterado en los fenotipos tumorigénicos. </li><li> Para la inducción de los clones de mosaico mediante flip-out-GAL4, calentar el vial por inmersión en un baño de agua a 37 ° C durante 10 - 45 min seguido de incubación durante 2 - 3 días a 25 ° C. NOTA: La información del tiempo de choque térmico, el tiempo y el tiempo de incubación en cada experimento se muestran en las leyendas de la figura. </li></ol> 2. Disección de las larvas <ol><li> Recoja las larvas de tercer estadio errantes con una pinza de madera o fórceps romos, genotipo por marcadores fluorescentes apropiados ( por ejemplo , EGFP) bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia y colóquelas en un plato de disección con PBS (solución salina tamponada con fosfato). </li><li> Lavar las larvas en PBS pipeteando con pipetas de transferencia de plástico de 2 ml. </li><li>Pellizque el centro de la larva con una pinza y rompa el cuerpo por la mitad con la otra pinza. </li><li> Pellizque el gancho de la boca de la mitad anterior con una pinza y empuje la boca hacia el cuerpo con la otra pinza para girar el cuerpo de adentro hacia afuera. </li><li> Eliminar los materiales innecesarios, como las glándulas salivales o los cuerpos de grasa con fórceps. </li></ol> 3. Fijación y tinción de anticuerpos <ol><li> Transferir la mitad anterior disecada del cuerpo larval (incluyendo los discos imaginarios del ala) a un tubo plástico de 1,5 ml y fijar en 1 mL de solución Fix (formaldehído 4% en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con rotación suave. PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y tiene un potencial carcinógeno. Use guantes y ropa protectora para evitar el contacto con la piel. NOTA: En esta parte, todas las etapas tienen lugar en un nutator a temperatura ambiente en la oscuridad a menos que se indique lo contrario. </li><li> Quite la solución Fix y deséchela. Lave los tejidos con 1 mL de PBT (0.3% TritEn X-100 en PBS) tres veces durante 15 min cada uno. </li><li> Eliminar el PBT y añadir 1 ml de PBTG (0,2% de suero de bóvidos bovinos y 5% de suero normal de cabra en PBT) para bloquear y nutate 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC. </li><li> Quitar PBTG y añadir la solución de anticuerpo primario diluido apropiadamente con PBTG (véase Tabla de Materiales ) y nutate durante la noche a 4 ° C. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpo primario y lavar los tejidos con 1 mL de PBT tres veces durante 15 minutos cada uno. </li><li> Eliminar PBT y añadir una solución de anticuerpo secundaria debidamente diluida con PBTG (1: 400). Nutate durante 2 h a temperatura ambiente o durante una noche a 4 ° C. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpos secundarios y lavar los tejidos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 minutos cada uno. </li><li> Para teñir F-actina, eliminar PBT y añadir Phalloidin solución diluida adecuadamente en PBS (1:40). A continuación, nutate durante 20 min. Retire la solución de Phalloidin y lave los tejidos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 min cada uno. </li><li> Para contra-tinción de ADN nuclear, eliminar PBT y añadir DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole) solución (0,5 μ g / mL de DAPI en PBS). A continuación, nutate 10 min. PRECAUCIÓN: DAPI tiene potencial carcinógeno. Use guantes y ropa protectora para evitar el contacto con la piel. </li><li> Eliminar la solución DAPI y lavar los tejidos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 minutos cada uno. </li><li> Enjuagar una vez en 1 mL de PBS durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar PBS y añadir 500 μ l de 100% de glicerol como el medio de pre-montaje. </li></ol> 4. Montaje en portaobjetos de microscopio <ol><li> Coloque los tejidos teñidos en una diapositiva de microscopio con una pipeta de transferencia de plástico de 2 ml. </li><li> Transferir los tejidos a gotas de medio de montaje en otra diapositiva de microscopio con fórceps. </li><li> Mantenga presionado el extremo del tejido diseccionado con una pinza y retire los discos antenales del cerebro y los ojos con las otras pinzas. NOTA: Mantenga los cerebros disecados para colocarlos cerca de los discos imaginales del ala. Los cerebros actúan como una plataforma que impide que el cubreobjeto aplaste los discos imaginal del ala. </li><li> Para aislar el ala los discos imaginales mantienen el extremo del tejido disecado con una pinza y rascan suavemente la pared del cuerpo y arrancan los discos con las otras pinzas. NOTA: Si es difícil encontrar discos imaginal del ala, pelar la tráquea desde el lado posterior al lado anterior. Los discos imaginarios del ala se adhieren a la tráquea. </li><li> Cubra suavemente los discos imaginales con un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas; Almacenar a 4 ° C. </li></ol> 5. Microscopía confocal <ol><li> Para adquirir imágenes confocales usando un microscopio confocal, fije los parámetros de adquisición de imágenes, incluyendo el rango de longitud de onda de emisión, intensidad láser, ganancia, offset, velocidad de exploración y tamaño de imagen 24 . NOTA: Para el procedimiento detallado de los ajustes de adquisición de imágenes, consulte el manual de instrucciones suministrado por cada fabricante de microscopio. </li><li> Para capturar solo coSecciones nfocal de un disco imaginal del ala entera, utilice un objetivo 20X. </li><li> Adquiera imágenes tridimensionales mediante escaneo de pilas en z con tamaño de paso de 0,5 a 1,0 μm usando lentes de 40X o 60X. NOTA: Para analizar los fenotipos celulares en alta resolución, un tamaño de imagen debe ser mayor de 512 x 512 píxeles. </li></ol> 6. Análisis de imágenes con ImageJ <ol><li> Utilice Fiji, un software de código abierto ImageJ enfocado en el análisis de imágenes biológicas (https://fiji.sc/) 25 , para adquirir y analizar las imágenes confocal de la z-pila. </li><li> Para obtener secciones verticales, abra las imágenes de pila z en ImageJ y seleccione el elemento de menú &quot;Imagen / pilas / Reslice&quot;. NOTA: Tanto el eje XZ como el eje YZ se pueden seleccionar en el menú Reslice. La sección vertical puede obtenerse también en una dirección arbitraria dibujando una línea recta o rectángulo sobre la imagen de la pila z. </li></ol> 7. Diagnóstico de los fenotipos neoplásicos <ol><li> Abrir la vertical(Eje XZ o YZ) obtenidos a partir de un conjunto de imágenes de pila z y analizar fenotipos morfológicos y tinción de anticuerpos. </li><li> Para el diagnóstico de los fenotipos tumorales, se centran principalmente en los siguientes tres puntos: (1) si una masa celular, incluyendo clones knockdown, se desvía de la capa epitelial principal, (2) si la localización subcelular de las proteínas de unión se altera en esta masa celular , Y (3) si el diámetro de esta masa celular es mayor que 4 células. </li><li> Clasificar los fenotipos tumorales de acuerdo con el diagrama de flujo descrito en la Figura 1 . </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El sistema GAL4-UAS es una de las herramientas genéticas más potentes para la expresión génica dirigida en Drosophila 26 y facilita en gran medida la inducción y el análisis de células tumorales in vivo 4 . Este sistema permite la generación de clones que tienen knockdown de genes supresores de tumores o sobreexpresión de oncogenes dentro de tejido epitelial de tipo salvaje, una situación muy similar a las etapas iniciales de cáncer humano en donde las cé...

Los tejidos epiteliales son sistemas altamente organizados que tienen la notable capacidad homeostática de mantener su organización a través del desarrollo y la renovación celular. Este robusto sistema de auto-organización, sin embargo, se interrumpe progresivamente durante el desarrollo del tumor. Al comienzo del desarrollo del tumor, las células mutantes individuales que surgen de la activación del oncogén o la inactivación del gen supresor del tumor emergen dentro de una capa epitelial. Cuando esta transformada &quot;célula pro-tumor&quot; evade un ambiente supresor, interrumpe la organización epitelial, y comienza la proliferación incontrolada, la tumorigénesis se produce 1 . Durante las últimas décadas, avances tecnológicos sobresalientes en genética y biología molecular han hecho progresos notables en la investigación del cáncer. En particular, los estudios recientes que utilizan los instrumentos de análisis genéticamente mosaico en Drosophila melanogaster , tales como la recombinación mitótica FLP-FRT (recombinante flippase / flase recombinase)ación 2 y flip-out-GAL4-UAS sistemas (secuencia de activación aguas arriba) 3, han contribuido enormemente a una mejor comprensión de los mecanismos genéticos implicados en la formación y metástasis de tumores 4, 5, 6. Los estudios de un grupo de genes supresores de tumores conservados de Drosophila , larvas gigantes letales ( lgl ), discos grandes ( dlg ) y garabatos ( scrib ), resaltaron la relación crítica entre la pérdida de organización epitelial y el desarrollo tumoral, ya que estos genes desempeñan papeles clave En la regulación de la polaridad celular apical-basal y la proliferación celular en los tejidos epiteliales [ 7] . Mientras que los discos imaginarios de Drosophila son normalmente epitelios monocapa, las mutaciones homocigóticas en cualquiera de estos tres genes hacen que las células pierdan estructura y polaridad, no difierenRentizar, sobreproliferar y, finalmente, formar masas amorfas multicapa que se funden con tejidos adyacentes 7 . Del mismo modo, la interrupción de estos genes en los mamíferos está involucrado en el desarrollo de tumores malignos [ 8 , 9] . Los fenotipos neoplásicos exhibidos por los tejidos mutantes han llevado a la clasificación de estos tres genes conservados, genes neoplásicos supresores de tumores (nTSGs) [ 7 , 8] . Sin embargo, cuando homozygous nTSG células mutantes son esporádicos generados en el desarrollo de tipo salvaje discursos imaginales utilizando FLP-FRT mediada por la recombinación mitótica, las células mutantes son eliminados del tejido a través de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) -dependiente apoptosis 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusión 15 </suP&gt; , 16 , o el engolfamiento y la fagocitosis por los vecinos [ 17] . En este epitelio genéticamente mosaico, la apoptosis se detecta principalmente en las células mutantes nTSG localizadas en el límite del clon, lo que sugiere que las células normales adyacentes desencadenar la apoptosis de nTSG células mutantes [ 10 , 11 , 12 , 18] . Estudios recientes en células de mamíferos han confirmado que esta eliminación celular dependiente de la competencia de las células pro-tumor es un mecanismo evolutivo conservado epiteliales de autodefensa contra el cáncer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Un reciente estudio en Drosophila imaginal discos, sin embargo, mostró que mosaico nTSG-knockdown clones induce tumores neoplásicos en especificaIc de los discos imaginal de ala 16 . La formación inicial de tumores se encontró siempre en la región periférica de la &quot;bisagra&quot; y nunca se observó en la región central de la &quot;bolsa&quot; del epitelio del disco de ala, lo que sugiere que el potencial tumorigénico de las células knockdown nTSG depende del entorno local. La región de la bolsa central funciona como una &quot;mancha fría del tumor&quot; donde las células pro-tumor no muestran sobrecrecimiento displásico, mientras que la región bisagra periférica se comporta como un &quot;hotspot tumoral&quot; 16 . En las regiones de bolsa &quot;coldspot&quot;, las células de desmontaje de nTSG se deslaminan desde el lado basal y sufren apoptosis. Por el contrario, como &quot;hotspot&quot; bisagra células poseen una red de estructuras robusto citoesqueleto en sus lados basales, nTSG-knockdown células delaminate desde el lado apical del epitelio e iniciar tumorigenic sobrecrecimiento [ 16] . Por lo tanto, el análisis de los fenotipos tumorales en discos imaginal requiereLa susceptibilidad específica de la región a estímulos tumorigénicos. En este sentido, se describe un protocolo para inducir la formación de tumores neoplásicos en el disco Drosophila imaginal discos utilizando el GAL4-UAS- RNAi sistema por el cual nTSG-knockdown células se generan en el epitelio del disco de ala normal. Aunque estos sistemas experimentales son útiles para estudiar las primeras etapas del cáncer, no se ha descrito claramente un método claro de clasificación para evaluar las etapas de progresión tumoral en epitelios discales imaginarios. Por lo tanto, también proponemos un método de diagnóstico para clasificar los fenotipos clonales pro-tumorales inducidos en el epitelio del disco ala en tres categorías: hiperplasia (acumulación de un número excesivo de células de aparición normal con aumento de la proliferación), displasia (tejido premaligno compuesto de anormalmente aparente Células), y neoplasia (tumor benigno o maligno compuesto de células que tienen un aspecto anormal y un patrón de proliferación anormal).

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes> </solución</td> salina tamponada >con <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfato (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>suero de cabra normal</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>medio de montaje, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-DLG 4F3</td><td>Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas</td><td>4F3 anti-discos grandes, RRID:AB_528203</td><td>diluido en PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>ratón-anti-MMP1 Banco de</td><td>Hibridomas</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 mezclado 1:1:1 y diluido en PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 mezclado 1:1:1 y diluido en PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 mezclado 1:1:1 y diluido en PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-atubulin</td><td>Developmental Estudios Banco de hibridomas</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>diluido en PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Faloidina</td><td>Sondas moleculares</td><td>A22283</td><td>diluido en PBS, 1:40</td></tr><tr><td>anticuerpo IgG anti-ratón en cabra, Alexa Fluor 546</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11030</td><td>diluidas en PBTG, 1:400</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Fly strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>recombinado con UAS-EGFP</td></tr><tr><td>upd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>recombinado con UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-lgl-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>UAS-scrib-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>UAS-RasV12</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Yki3SA</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>hsFLP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>recombinado con UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X cromosoma</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>tercer cromosoma</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>segundo cromosoma</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>tercer cromosoma</td></tr><tr><td>vkg-GFP</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>Trampa de proteínas GFP</td></tr></tbody></table>

inducción y diagnóstico de tumores en<em&gt; drosophila</em&gt; imaginal disc epitelio

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

En las primeras etapas del cáncer, las células mutantes transformadas muestran anormalidades citológicas, comienzan un crecimiento excesivo no controlado y alteran progresivamente la organización tisular. Drosophila melanogaster ha surgido como un modelo experimental popular en el sistema de biología del cáncer para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. En particular, las herramientas genéticas para los discos imaginarios de Drosophila (desarrollo de epitelios en larvas) permiten la creación de células pro tumorales transformadas dentro de un tejido epitelial normal, situación similar a las etapas iniciales del cáncer humano. Sin embargo, un estudio reciente de tumorigénesis en discos imaginarios de alas de Drosophila demostró que la iniciación tumoral depende de la citoarquitectura intrínseca del tejido y del microambiente local, lo que sugiere que es importante considerar la susceptibilidad específica de la región a los estímulos tumorigénicos en la evaluación de fenotipos tumorales en imaginal Discos Para facilitar el análisis fenotípico del progreso tumoralEn discos imaginal, aquí se describe un protocolo para experimentos genéticos utilizando el sistema GAL4-UAS para inducir tumores neoplásicos en discos imaginal de ala. Además, hemos introducido un método de diagnóstico para clasificar los fenotipos de las lesiones clonales inducidas en el epitelio imaginal, como un método de clasificación clara para discriminar las diversas etapas de la progresión tumoral (como la hiperplasia, displasia o neoplasia) no se había descrito anteriormente. Estos métodos podrían aplicarse ampliamente al análisis clonal de fenotipos tumorales en diversos órganos de Drosophila .

Para demostrar la formación de tumores neoplásicos inducidos experimentalmente por RNAi mediada nTSG-knockdown en Drosophila ala imaginal discos, tres diferentes GAL4 conductores se utilizaron para expresar UAS-RNAi para lgl o scrib : (1) sd-GAL4, que impulsa fuerte UAS expresión en el Bolsa de ala y expresión suave en las regiones de bisagra ( Figura 2 y Figura 3A ); (2) <em...

El análisis de clones mosaicos en el epitelio discal imaginario de Drosophila es un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. Aquí se describe un protocolo para inducir tumores en Drosophila ala imaginal discos utilizando el sistema GAL4-UAS, e introducir un método de diagnóstico para clasificar los tumores fenotipos.

Inducción y diagnóstico de tumores en<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epitelio

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

El objetivo general de este procedimiento es generar clones mosaicistas tumorogénicos en discos imaginales en desarrollo de Drosophila, y luego clasificar las lesiones clonales en diversas etapas del desarrollo tumoral. Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en la modelización del cáncer, como por ejemplo cómo inducir tumores de manera consistente y cómo clasificar la etapa de progresión.Las principales ventajas de esta técnica son que la inyección del tumor en los discos imaginales del ala de Drosophila se realiza utilizando una genética de moscas sencilla, y que la clasificación de las etapas del desarrollo tumoral constituye un diagnóstico simple. Junto con Kenta Morimoto, quien demostrará el procedimiento, estará Kimiko Morimoto, una técnica de mi laboratorio. Comience por establecer el cruce genético.12 horas antes de recolectar las hembras vírgenes para el cruce, retire todas las moscas adultas de los viales que contienen pupas maduras. Al día siguiente, prepare un cruce para generar descendencia genéticamente mosaic. Transfiera de 12 a 20 hembras vírgenes y 10 machos a un vial fresco e incube durante un día a 25 grados Celsius.Después de 24 horas, transfiera las moscas a un vial fresco y deseche el primer vial que colonizaron. Después de 12 horas más, comenzarán a estar disponibles los huevos. Cada 12 horas, transfiera los adultos a nuevos viales y utilice la descendencia para el experimento.Después de incubar los frascos con huevos durante dos a cuatro días a 25 grados Celsius, someta a choque térmico las larvas durante diez a 45 minutos, utilizando un baño de agua a 37 grados Celsius, para la inducción de clones mosáicos mediante GAL4 por inversión. El choque térmico aplicado a los dos días de desarrollo generará clones en discos inmaduros. El choque térmico aplicado a los tres o cuatro días de desarrollo generará clones en discos más avanzados.Después del choque térmico, devuelva los viales al incubador a 25 grados Celsius, hasta que estén disponibles las larvas de tercer estadio. Para comenzar, use un palillo de madera o pinzas romas para transferir las larvas de tercer estadio en fase de errancia a una placa de Petri con PBS. Luego, determine su genotipo bajo luz fluorescente para identificar los marcadores fluorescentes adecuados para las larvas mosaicadas.Antes de continuar, lave las larvas con PBS. Luego, bajo un microscopio de disección, use dos pares de pinzas para presionar el centro de la larva y desgarrar el cuerpo por la mitad. A continuación, presione los ganchos bucales mientras empuja la boca hacia el cuerpo, para voltear el cuerpo del revés.Luego, retire los materiales innecesarios, como las glándulas salivales y los cuerpos grasos. Las larvas ya están preparadas para la fijación y la tinción con anticuerpos, lo cual se describe detalladamente en el protocolo escrito. Transfiera las preparaciones teñidas de tejido a una placa microscópica utilizando una pipeta plástica de transferencia de dos mililitros.Luego, utilizando pinzas, transfiera larvas individuales a gotas de medio de montaje sobre un portaobjetos para microscopio. A continuación, usando pinzas, aísle los discos imaginarios. Comience sujetando un extremo del tejido diseccionado y tire del cerebro y de los discos ojo-antenal con las otras pinzas.Mantenga los cerebros listos para su uso. Ahora localice los discos imaginarios de las alas. Los discos imaginarios de las alas están adheridos al lado lateral del tejido diseccionado.A continuación, sujete el tejido con una pinza y raspe suavemente los discos alares. Luego, coloque los cerebros cerca de los discos alares para protegerlos de ser aplastados por la cubreobjetivo. Ahora, cúbrala estructuras suavemente con una cubreobjetivo y selle la cubreobjetivo con esmalte de uñas.Guarde el portaobjetos a cuatro grados Celsius. Después de utilizar un microscopio confocal para adquirir las imágenes en Z-stack confocal, ábralas en ImageJ y utilice el comando Reslice para crear secciones virtuales. Estas pueden realizarse en el eje X-Z, el eje Y-Z o en un plano personalizado.Para crear el plano personalizado, dibuje una línea recta o un rectángulo sobre la imagen de la pila Z y siga las indicaciones para que la computadora genere su corte. Utilice estos cortes para diagnosticar el tejido en busca de fenotipos tumorales. Primero, identifique las masas celulares que se desvían o presentan crecimiento excesivo a partir de la capa epitelial principal.Luego, para cada masa, determine si la localización subcelular de las proteínas de unión parece normal. Otras consideraciones incluyen el tamaño de la masa y cualquier indicación de aumento en la proliferación celular dentro de la masa. De este modo, se identifica el tipo de tumor.En este ejemplo, se clasificaron cuatro clones utilizando secciones verticales generadas por el software de imagen. Dos de ellos se clasificaron como displasia, porque la proteína DLG marcada estaba mal localizada. El clon B tiene menos de cuatro células de tamaño, y el clon C no se desvía del epitelio.Por lo tanto, ni B ni C fueron clasificados como un neoplasma. Las otras dos colonias también mostraron mala localización de DLG y formaron masas celulares tumorales fuera del epitelio. Dado que el tamaño de estas colonias tumorales desplazadas era de más de cuatro células de diámetro, estas colonias fueron clasificadas como neoplásicas.Mediante los métodos descritos, el gen LGL se silenció en las regiones del bolsillo alar y de la articulación, utilizando ARNip dirigido por sd-GAL4. En los controles que carecían del transgén de ARNip, no se observaron alteraciones morfológicas en los discos alares de tercer estadio. En los silenciamientos, se observaron claramente deformaciones epiteliales y crecimientos excesivos tumorogénicos en ciertas partes de la articulación.Sin embargo, no se observó un crecimiento excesivo displásico en la región de la bolsa alar. Esto se correlacionó inversamente con la expresión de MMP1 en esas regiones: una proteína que proporciona capacidad metastásica. Para monitorear la progresión del crecimiento tumoral inducido por la inhibición de LGL, se generaron clones esporádicos que expresan ARNip contra LGL en discos alares, como se describió.Dos días después del choque térmico en larvas de segundo estadio, algunos clones con expresión reducida en la región de la bisagra mostraron desviación desde el lado apical de la capa epitelial. Cuatro días después de la inducción por choque térmico, las lesiones displásicas en la región de la bisagra se volvieron evidentes, lo que sugiere que los clones con expresión reducida de LGL, desplazados desde el lado apical, proliferan en la luz. Siete días después de la inducción por choque térmico, los crecimientos excesivos tumorales dominaron las regiones de la bisagra.Al utilizar sistemas GAL4 de tipo flip-out, es importante recordar examinar el efecto de la modificación del momento del choque térmico sobre los fenotipos clonales, porque el potencial tumorigénico de las células del disco imaginario puede depender de la etapa de desarrollo, de eventos de señalización endógenos o de la diferenciación celular.

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este protocolo demuestra la técnica de disección utilizado para el aislamiento de los discos imaginales de larvas de Drosophila en la tercera etapa de estadio. Métodos para la fijación de los tejidos después de decir y la eliminación de las alas, piernas, ojos y los discos se muestran directamente en un portaobjetos para su visualización posterior.

La disección de los discos imaginales de 3er estadio las larvas de Drosophila

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Drosophila pupa inmunohistoquímica Abdomen

Al teñir discos imaginales de Drosophila, a menudo se realiza una disección aproximada en la que los discos quedan expuestos pero permanecen unidos al cuerpo. Una vez teñidos, los discos de interés se aíslan y se montan. El protocolo de ejemplo muestra un procedimiento para la disección y el montaje del disco imaginal del ala.

Drosophila Disección del disco imaginal de las larvas: un método para observar el desarrollo de los epitelios

Cooperación entre un oncogén activado como RAS V12 y las mutaciones en los genes de polaridad celular como garabateado, resultar en el crecimiento tumoral en Drosophila donde las células tumorales también muestran comportamientos invasivos. Aquí se presenta un protocolo sencillo para la inducción y la observación de los tumores benignos y invasivos.

Un protocolo para la inducción genética y visualización de tumores benignos y invasoras en cefálica Complejos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

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los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Aquí describimos un procedimiento para capturar imágenes en vivo de la gastrulación de Drosophila. Esto nos ha permitido comprender mejor la constricción apical involucrada en el desarrollo temprano y analizar más a fondo los mecanismos que gobiernan los movimientos celulares durante la modificación de la estructura tisular.

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