Name: Aislamiento de Pericitos Tipo I y Tipo II de Músculos Esqueléticos de Ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a aislar pericitos tipo I y tipo II de músculos esqueléticos de ratón mediante FACS. Este protocolo permite la separación simultánea sin transgenes específicos, facilitando el estudio de sus diferencias biológicas.

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Este trabajo fue apoyado parcialmente por una beca del Fondo-A-Fellow de la Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) y la Beca de Desarrollo Científico de la American Heart Association (16SDG29320001).

Wildtype y Nestin-GFP ratones transgénicos se alojaron en la instalación de animales en la Universidad de Minnesota. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Minnesota y estaban de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Disección muscular y aislamiento monocelular <ol><li> Euthanize ratones adultos (6-10 semanas, ambos hombres y mujeres) con tribromoetanol (250 mg / kg, ip) y esterilizar su piel abdomen con etanol al 70%. NOTA: Se utilizó tribrometanol en lugar de ketamina para anestesia / eutanasia, ya que se sabe que la ketamina interactúa con los receptores NMDA, lo que podría tener un impacto en el estudio. </li><li> Coloque los ratones en decúbito supino y utilice un bisturí para realizar una incisión horizontal en la piel abdominal. Pele la piel a mano, tirando en direcciones opuestas para exponer los músculos de los miembros posteriores. </li><li> ColeccionarT los músculos de ambos miembros traseros usando fórceps y tijeras. Almacenarlos en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) suplementada con penicilina-estreptomicina al 1% (P / S) sobre hielo. </li><li> Lave los músculos de la extremidad posterior disecados en PBS enfriado con hielo suplementado con P / S al 1% dos veces y transfiéralos a una placa estéril de 10 cm. </li><li> Cuidadosamente disecar fuera de los nervios, vasos sanguíneos y tejido conectivo de los músculos con pinzas y tijeras bajo un microscopio de disección con un aumento de 2X. </li><li> Picar finamente y picar los músculos en trozos pequeños (1-2 mm 3 ) con tijeras y cuchillas estériles. Si es necesario, agregue una pequeña cantidad de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) para asegurar que los músculos no se sequen. </li><li> Romper mecánicamente el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo a través de una pipeta serológica de 10 ml 10 veces. </li><li> Añadir la solución de digestión recién hecha (DMEM suplementado con colagenasa de tipo 2 al 0,2%) a la mezcla. Incubar a 37 ° C durante 2 h con gentlAgitación a 35 revoluciones / min. </li><li> Triturar usando una aguja de 18 G para homogeneizar la mezcla. A continuación, centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y luego resuspender el sedimento en tripsina / EDTA al 0,25%. Incubar a 37 ° C durante 10 min. Repita el paso de centrifugación dos veces más. </li><li> Añadir 10 ml de DMEM suplementado con 20% de suero bovino fetal (FBS) a la solución y centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón de lisis de glóbulos rojos (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM y EDTA 0,1 mM). </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón de clasificación (HEPES 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM y BSA al 1% en PBS libre de Ca / Mg2 + , pH 7,0). Filtrar la mezcla a través de un filtro de células de 40 μm para obtener una suspensión de una sola célula. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 mL de tampón de clasificación. </li><li> Cuenta losNúmero de células con un hemocitómetro y diluir la suspensión de una sola célula a 5 x 106 / ml en tampón de clasificación. </li></ol> 2. Coloración y clasificación de células <ol><li> Prepare los controles y la muestra como se describe en la Tabla 1 . Mancha la suspensión de una sola célula con los respectivos anticuerpos en hielo durante 30 min, como se describe en la Tabla 1 . </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min y lavar los gránulos dos veces con tampón de clasificación. </li><li> Añadir DAPI a las soluciones monocelulares, como se indica en la Tabla 1. Utilizar 5 μg / mL de DAPI (concentración final) para el control de un solo color de DAPI y 1 μg / mL de DAPI para el control de PDGFRβ-PE-FMO y la muestra. Mantenga todos los tubos en hielo durante todo el experimento. </li><li> Encienda el clasificador y el software. Escanee e inserte un chip de clasificación de 100 μm cuando se le solicite. </li><li> Realice la configuración automática ( es decir, la alineación de las virutas , la calibración de gotas, la calibración de la corriente lateral y el calibración del retardo de clasificaciónOn) cargando las cuentas de configuración automática cuando se le solicite. </li><li> Cuando finalice la configuración automática, vaya a la pestaña &quot;Experimento&quot;, haga clic en &quot;Nuevo&quot; y seleccione &quot;Plantilla en blanco&quot; en &quot;Plantillas públicas&quot;. </li><li> En &quot;Ajustes de medición&quot;, ingrese &quot;DAPI&quot; para &quot;FL1&quot;, &quot;Nestin-GFP&quot; para &quot;FL2&quot; y &quot;PDGFRβ&quot; para &quot;FL3.&quot; Desmarque las casillas de &quot;FL4&quot; - &quot;FL6&quot;. </li><li> Marque las casillas para activar los láseres 405, 488 y 561 y haga clic en &quot;Crear nuevo experimento&quot;. </li><li> Seleccione la opción &quot;Comenzar Compensación Wizard&quot; y siga las instrucciones del software &quot;Compensation Wizard&quot; para configurar la compensación. <ol><li> Cargue el control sin color y haga clic en &quot;Inicio&quot;. Haga clic en &quot;Detector &amp; Threshold Settings&quot; y ajuste la ganancia del sensor de los detectores FSC y BSC para colocar la población en la escala. </li><li> AnuncioSólo los niveles de ganancia de los canales de fluorescencia FL1-FL3 para colocar las poblaciones negativas en el lado izquierdo de los histogramas. Haga clic en el botón &quot;Grabar&quot; para grabar los datos. </li><li> Cargue controles de un solo color uno por uno cuando se le solicite. Haga clic en &quot;Iniciar y grabar&quot; para grabar los datos. Ajustar las puertas para las poblaciones positivas en los histogramas. Haga clic en Siguiente.&quot; </li><li> Vaya a &quot;Calcular matriz&quot; en la pestaña &quot;Compensación&quot; y haga clic en &quot;Calcular&quot; en el panel &quot;Calcular ajustes de compensación&quot; para realizar la compensación. Haga clic en &quot;Finalizar&quot; para salir del &quot;Asistente de Compensación&quot;. </li></ol></li><li> Cargue el control PDGFRβ-PE-FMO y haga clic en &quot;Inicio&quot;. Dibuje una puerta de polígono (Puerta A) alrededor de las celdas de interés bajo la trama &quot;Todos los eventos&quot;. </li><li> Haga doble clic dentro de la puerta A para crear una trama secundaria. Cambie el eje Y a DAPI y dibuje una puerta polígono (Puerta B) alrededor de células vivas (DAPI bajo ). Haga doble clic en iNside Puerta B para crear una trama infantil. Cambiar el eje X a FSC-H y el eje Y a FSC-W y dibujar una puerta de polígono (Puerta C) alrededor de los singlets para eliminar dobletes. </li><li> Haga doble clic dentro de la puerta C para crear una trama secundaria. Cambiar el eje X a Nestin-GFP y el eje Y a PDGFR β-PE. Haga clic en el botón &quot;Grabar&quot; para grabar los datos. </li><li> Cargue la muestra y repita los pasos 2.11-2.12. Después de la grabación, haga clic en &quot;Pausa&quot; para conservar la muestra. </li><li> Definir los límites de gating para PDGFR β + y Nestin-GFP + células basadas en el PDGFR β-PE-FMO control. Dibujar puertas para el PDGFRβ + Nestin-GFP - y PDGFRβ + Nestin-GFP + poblaciones. </li><li> En &quot;Método de clasificación&quot;, seleccione &quot;Tubos de 2 vías&quot; y asigne las células &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP-&quot; y &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; a los tubos colectores izquierdo y derecho.Espectacularmente. Montar los tubos de recogida de 15 mL en la etapa de recogida y hacer clic en el botón &quot;Cargar Colección&quot;. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Reanudar&quot; para mantener la muestra funcionando. Haga clic en &quot;Start Sort&quot; para recoger las células PDGFRβ + Nestin-GFP - (tipo I) y PDGFRβ + Nestin-GFP + (tipo II pericytes). </li></ol> 3. Análisis después de la clasificación <ol><li> Centrifugar las células clasificadas a 500 xg durante 5 min, resuspender el gránulo en 1 mL de medio pericítico (véase Tabla de Materiales ) y contar la densidad celular utilizando un hemocitómetro. </li><li> Los pericitos tipo I y tipo II de semillas en cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina (PDL) a ~ 1 x 104 células / cm2. Crecer en medio pericíto durante 3 días a 37 ° C con 5% de CO 2 . </li><li> El día 3, examinar la morfología del pericito (bajo contraste de fase) y endógeno Nestin-GFP expresión utilizando un fluorescente microAlcance (láser de excitación: 488 nm, filtro de excitación: 470/40 nm, y filtro de emisión: 515/30 nm). Tomar imágenes bajo un objetivo 20X (0.45 NA). </li><li> Sustituir el medio pericítico por medio adipogénico (medio basal MSC de ratón + suplemento estimulante adipogénico) y miogénico (DMEM + 2% de suero de caballo) para iniciar diferenciación adipogénica y miogénica, respectivamente, tal como se ha descrito previamente 20 . Cambie el medio cada 2-3 días. </li><li> Se fijan las células al día 17 (14 días después de la diferenciación adipogénica / miogénica) en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Precaución, PFA es un carcinógeno. </li><li> Realizar inmunocitoquímica contra la perilipina (marcador de adipocitos) y S-myosin (myotube maduro / marcador de miofibra), como se describe en publicaciones anteriores 19 , 20 . <ol><li> Lavar las células fijas 3 veces en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir tampón de bloqueo (PBSSuplementado con suero de burro al 5%, BSA al 3% y Triton X-100 al 0,3%) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Incubar las células con anticuerpos anti-perilipina (2 μg / mL) y / o anti-S-miosina (2 μg / mL) a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar las células 3 veces en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Incubar las células con anticuerpos Anti-conejo Alexa 555 (4 μg / mL) y / o Alexa555 anti-ratón (4 μg / mL) a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar las células 3 veces en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Montar las células inmunoestimuladas con medio de montaje que contenga DAPI (ver tabla de materiales). Examinar la expresión de perilipina y S-miosina usando un microscopio fluorescente (láser de excitación: 543 nm, excitación de 540/45 nm y emisión de 600/50 nm) y tomar imágenes bajo un objetivo 40X (0.60 NA). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+recruitment+after+injury%3A+lessons+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine.</a> Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Relaix, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+are+essential+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+the+cell+on+the+edge+returns+centre+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage.</a> Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).</li>
<li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Pax7+and+Pax3+in+adult+regenerative+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis.</a> J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+migration+of+myogenic+cells+injected+into+pre-irradiated+muscles+of+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice.</a> J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+myoblast+transfer%3A+a+possible+therapy+for+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies.</a> Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Tamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+CD34%2B%2F45-+and+CD34-%2F45-+stem+cells+are+situated+hierarchically+upstream+of+Pax7%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat Commun. 2, 499(2011).</li>
<li>Mitchell, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+non-satellite+cell+muscle+resident+progenitor+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development.</a> Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).</li>
<li>Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+skeletal+muscle+resident+progenitors+and+their+cell+fate+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials.</a> Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).</li>
<li>Kostallari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+the+myovascular+niche+promote+post-natal+myofiber+growth+and+satellite+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence.</a> Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li>
<li>Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+regulates+PDGFRbeta%28%2B%29+cell+stemness+and+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development.</a> Nat Commun. 7, 11415(2016).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+pluripotent+cells+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier.</a> Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+microvascular+pericytes+exhibit+multipotential+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
<li>Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28(2017).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+multitasking+cells+in+the+regeneration+of+injured%2C+diseased%2C+and+aged+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle.</a> Front Aging Neurosci. 6, 245(2014).</li>
</ol>

Todos los autores no tienen ningún conflicto de interés para divulgar.

Los pericitos son células perivasculares multipotentes 22 , 23 localizadas en la superficie abluminal de los capilares 21 , 26 . En los músculos esqueléticos, los pericitos son capaces de diferenciarse a lo largo de las vías adipogénicas y / o miogénicas 19 , 20 , 24 . Estudios recientes revelaron dos subpoblaci...

La distrofia muscular es un trastorno músculo-degenerativo que no tiene tratamientos efectivos hasta el momento. El desarrollo de terapias que promueven la regeneración tisular siempre ha sido de gran interés. La regeneración y reparación de los tejidos después del daño dependen de las células madre / células progenitoras residentes 1 . Las células satélite son células precursoras miogénicas comprometidas que contribuyen a la regeneración muscular 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Su uso clínico, sin embargo, se ve obstaculizado por su limitada migración y baja tasa de supervivencia después de la inyección, así como por su disminución de la capacidad de diferenciación después de la amplificación in vitro [ 8 , 9 , 10 , 11] . Además de satelliLos músculos esqueléticos también contienen muchas otras poblaciones celulares con potencial miogénico 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , tales como las células intersticiales positivas al receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGFRβ). Existen pruebas que demuestran que las células PDGFRβ + derivadas de los músculos son capaces de diferenciarse en células miogénicas y de mejorar la patología y la función muscular 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFR β predominantemente etiquetas pericitas 21 , que son las células perivasculares con pluripotencia [ 22 , 23] . Además de PDGFRβ, muchos otros marcadores, incluyendo Neuron-Glial 2 (NG2) y CD146, también se utilizan para iDentify pericytes 21 . Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que ninguno de estos marcadores es pericítico-específico [ 21] . Estudios recientes revelaron dos subtipos de pericitos musculares, denominados tipo I y tipo II, que expresan diferentes marcadores moleculares y realizan funciones distintas 19 , 24 , 25 . Bioquímicamente, los pericitos de tipo I son NG2 + Nestin - , mientras que los pericitos de tipo II son NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funcionalmente, los pericitos tipo I pueden experimentar diferenciación adipogénica, contribuyendo a la acumulación de grasa y / o fibrosis, mientras que los pericitos de tipo II pueden diferenciarse a lo largo de la vía miogénica, contribuyendo a la regeneración muscular 19 , 24 , 25 . Estos resultados demuestran que: (1) los pericitos de tipo I pueden bE dirigidos al tratamiento de trastornos degenerativos grasos / fibrosis, y (2) los pericitos tipo II tienen un gran potencial terapéutico para la distrofia muscular. Una mayor investigación y caracterización de estas poblaciones requiere un protocolo de aislamiento que permita la separación de los pericitos de tipo I y II con un alto nivel de pureza. Actualmente, el aislamiento de las subpoblaciones de pericitos se basa en NG2-DsRed y Nestin-GFP doble-transgénicos ratones [ 19 , 24] . La disponibilidad de ratones NG2-DsRed y la calidad de la mayoría de los anticuerpos NG2 limitan el uso generalizado de este método. Dado que todos los pericitos NG2 + también expresan PDGFRβ en los músculos esqueléticos 19 , 20 , 24 , la hipótesis de que NG2 puede ser sustituido por PDGFR β para el aislamiento de los pericitos y sus subpoblaciones. Este trabajo describe un protocolo basado en FACS queUtiliza tinción PDGFRβ y la señal Nestin-GFP. Este método es menos exigente para los investigadores porque: (1) no requiere el fondo NG2-DsRed y (2) utiliza anticuerpos PDGFRβ comercialmente disponibles, que están bien caracterizados. Además, permite el aislamiento simultáneo de pericitos de tipo I y II con alta pureza, lo que permite investigar más a fondo la biología y el potencial terapéutico de estas subpoblaciones de pericitos. Después de la purificación, estas células se pueden cultivar en cultivo, y sus morfologías pueden visualizarse. Este trabajo también muestra que los pericitos tipo I y tipo II aislados utilizando este método, como los purificados a partir de ratones doblemente transgénicos, son adipogénicos y miogénicos, respectivamente.

<table><tbody><tr><td>Clasificador de células</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de configuración automática</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento pericito</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Medio basal (ratón)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento estimulante adipogénico (ratón)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo 2</td><td>Worthington LS004176</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina / EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;-PE Anticuerpo</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de perilipina</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo S-miosina</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-anti-conejo& nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anticuerpo anti-ratón</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 18 g</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta serológica</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp</td><td>eBeads eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de pericitos tipo i y tipo ii de músculos esqueléticos de ratón

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Los pericitos son células multipotentes perivasculares que muestran heterogeneidad en diferentes órganos o incluso dentro del mismo tejido. En los músculos esqueléticos, existen al menos dos subpoblaciones pericíticas (llamadas tipo I y tipo II), que expresan diferentes marcadores moleculares y tienen distintas capacidades de diferenciación. Utilizando ratones doblemente transgénicos NG2-DsRed y Nestin-GFP, se han aislado con éxito los pericitos de tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) y de tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ). Sin embargo, la disponibilidad de estos ratones doblemente transgénicos impide el uso generalizado de este método de purificación. Este trabajo describe un protocolo alternativo que permite el aislamiento fácil y simultáneo de los pericitos tipo I y tipo II de los músculos esqueléticos. Este protocolo utiliza la técnica de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y objetivos PDGFR β, en lugar de NG2, junto con la señal de Nestin-GFP. Después del aislamiento, el tipo I y tyLos pericitos pe II muestran morfologías distintas. Además, los pericitos tipo I y II aislados con este nuevo método, como los aislados de los ratones doblemente transgénicos, son adipogénicos y miogénicos, respectivamente. Estos resultados sugieren que este protocolo puede usarse para aislar las subpoblaciones pericíticas de los músculos esqueléticos y posiblemente de otros tejidos.

Los parámetros FACS, incluyendo la intensidad del láser y la compensación del canal, se corrigen en base a los resultados del control sin color y de los controles de un solo color. El control PDGFR beta - PE - FMO se usa para establecer el gating para la población PDGFR beta - PE + ( Figura 1A ). Entre las células PDGFR β-PE, dos poblaciones que representan Nestin-GFP + y Nestin-GFP - células están claramente separados ( <s...

Este trabajo describe un protocolo basado en FACS que permite el aislamiento fácil y simultáneo de pericitos tipo I y tipo II de los músculos esqueléticos.

Aislamiento de Pericitos Tipo I y Tipo II de Músculos Esqueléticos de Ratón

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar subpoblaciones de pericitos a partir de músculos esqueléticos utilizando FACS. Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales en el campo de la biología de los pericitos, como cuál es la diferencia biológica entre los pericitos de tipo I y tipo II. La principal ventaja de este protocolo es que permite el aislamiento simultáneo de pericitos de tipo I y tipo II sin necesidad de utilizar el transgén NG2 dsRED.Las aplicaciones de este protocolo no se limitan a los músculos esqueléticos. También puede utilizarse para aislar pericitos de otros órganos, como el cerebro. Para comenzar, primero obtenga el tejido deseado de un ratón transgénico nestina-GFP, y luego lave el tejido dos veces en PBS frío con hielo que contenga antibióticos.Luego, transfiera las muestras a una placa estéril de 10 centímetros. A continuación, utilizando tijeras y hojas estériles, corte los músculos en trozos finos de uno a dos milímetros cúbicos. Si es necesario, agregue una pequeña cantidad de DMEM para evitar que el tejido se seque.Pipetee el tejido hacia arriba y hacia abajo a través de una pipeta serológica de 10 milímetros para romperlo mecáni

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra un método para aislar pericitos cerebrales del cerebro de un ratón. Las células aisladas se cultivan en medios específicos de pericitos para promover la proliferación de pericitos.

Aislamiento y cultivo de pericitos cerebrales de ratón

Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de...

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

El aislamiento y cultivo de una población pura de células satélite quiescentes, una población de células madre de músculo, es esencial para la comprensión de la biología de células madre del músculo y la regeneración, así como el trasplante de células madre para terapias en la distrofia muscular y otras enfermedades degenerativas.

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Hemos desarrollado una técnica novedosa y reproducibles para aislar los cultivos primarios de células musculares lisas de las arterias pulmonares (PASMC) a partir de ratones tan jóvenes como de P7, permitiendo de ese modo un mejor estudio de las vías de señalización implicadas en la contracción de las células del músculo liso neonatal y relajación.

El aislamiento de la arteria pulmonar células musculares lisas de los ratones recién nacidos

Las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos (MMEC) forma la pared interna de los capilares musculares y regulan ambos, intercambio de moléculas de líquidos y migración de las células (inmunes) entre sangre y tejido muscular. Aislamiento de MMEC murino primario, como se describe aquí, permite completa investigaciones in vitro de la "unidad myovascular".

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

Hemos optimizado un protocolo para aislar y purificar los pericitas cardíacos murinos para la investigación básica y la investigación de su biología y potencial terapéutico.

Aislamiento y Purificación de Pericitas Cardíacos Murinos

Presentamos un protocolo para la extracción de pericitas cerebrales murinas. Basado en una extracción de pericita orientada al enriquecimiento libre de antibióticos, este protocolo es una herramienta valiosa para estudios in vitro que proporcionan alta pureza y alto rendimiento, disminuyendo así el número de animales experimentales utilizados.

Un método de alta salida para aislar los pericytes cerebrales del ratón

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

Este protocolo describe el aislamiento de células madre musculares y progenitores fibroadipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. El protocolo incluye la disección de un solo músculo, el aislamiento de células madre mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, la evaluación de la pureza mediante tinción de inmunofluorescencia y la medición cuantitativa de la entrada en fase S mediante un ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales

Para obtener pericitos corticales cerebrales de ratón que cumplan con las demandas del scRNA-seq, presentamos un protocolo FACS críticamente optimizado basado en la selección CD13⁺/CD31⁻. Nuestros refinamientos clave mejoran significativamente la viabilidad celular y la integridad del ARN, permitiendo un perfil transcriptómico fiable.

Aislamiento de pericitos de tejido cortical de ratón usando FACS para secuenciación unicelular

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Aprende a aislar pericitos tipo I y tipo II de músculos esqueléticos de ratón mediante FACS. Este protocolo permite la separación simultánea sin transgenes específicos, facilitando el estudio de sus diferencias biológicas.

Aislamiento de Pericitos Tipo I y Tipo II de Músculos Esqueléticos de Ratón

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