Combinación de imágenes Raman y Análisis Multivariante para visualizar Lignina, Celulosa y Hemicelulosa en el Muro de la Célula Vegetal

El objetivo general de este experimento es presentar un método general para visualizar la lignina, la celulosa y la hemicelulosa en la pared celular de la planta mediante imágenes Raman y análisis multivariante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biomasa vegetal, como por ejemplo cómo se distribuyen los principales componentes químicos en la pared celular de la planta. La principal ventaja de esta técnica es que se puede obtener información no destructiva y sin trabajo sobre la muestra con una preparación mínima de la muestra.

Para empezar, corta un pequeño bloque de tejido de la muestra de la planta. Sumerja el pañuelo en agua desionizada hirviendo durante 30 minutos. Luego, transfiéralo inmediatamente a agua desionizada a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Repita este paso hasta que el pañuelo se hunda hasta el fondo del recipiente, lo que indica que se ha eliminado el aire del pañuelo y que el tejido se ha ablandado. Prepare 20%, 50%, 70% y 90 alícuotas de PEG y agua desionizada, así como PEG puro. Mantenga las soluciones a 65 grados centígrados.

Incubar el tejido en una serie de baños de PEG graduados para desplazar el agua y permitir que el PEG se infiltre. Secar al 20 % de PEG durante una hora, al 50 % de PEG durante una hora y media, al 70 % de PEG durante dos horas, al 90 % de PEG durante dos horas y al 100 % de PEG durante 10 horas. A continuación, precalienta un casete a 65 grados centígrados en un horno.

Vierta el bloque de tejido que contiene PEG en el casete y, a continuación, coloque el bloque de tejido en la posición deseada con pinzas o agujas precalentadas. Enfríe lentamente el casete y guarde el pañuelo a temperatura ambiente hasta su uso. Diseccione el bloque PEG que contiene el tejido objetivo en un bloque pequeño con una cuchilla de afeitar afilada.

Monta el pequeño bloque de PEG en el micrótomo y corta secciones delgadas del bloque de PEG. Luego, enjuague las secciones con agua desionizada en una clase de reloj 10 veces para eliminar el PEG del tejido. A continuación, sumerja las secciones con tolueno y etanol durante seis horas para eliminar los extractivos.

Prepare el líquido de reacción mezclando 65 ml de agua desionizada, 0,5 ml de ácido acético y 0,6 g de cloruro de sodio en un vaso de precipitados. Agregue una sección y 3 mL de líquido de reacción a un vial de 5 mL. Enrosque la parte superior del vial.

A continuación, calienta el vial al baño maría a 75 grados centígrados durante dos horas para eliminar la lignina del tejido. Enjuague la sección con agua desionizada en un vidrio de reloj 10 veces. A continuación, transfiera la sección sin tratar y sin lignificar a un portaobjetos de microscopio de vidrio.

Desdobla la sección con cuidado con pinceles o agujas. Retire el exceso de agua desionizada con papel de seda. Luego, sumerja la sección en óxido de deuterio.

Cubra la muestra con un cubreobjetos de vidrio. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para evitar la evaporación del óxido de deuterio. Abra el software de funcionamiento del instrumento del microscopio Raman confocal.

Encienda el láser y concéntrese en el servicio del cristal y el silicio con un objetivo de microscopio de 100x. Haga clic en el botón de calibración para calibrar el instrumento. Cambie el instrumento al modo de microscopio óptico y encienda la lámpara del microscopio.

Monte el portaobjetos del microscopio en la platina, con el cubreobjetos orientado hacia el objetivo. Visualice la muestra con el objetivo del microscopio 20x y localice el área de interés. Cambie al objetivo del microscopio de inmersión.

Aplique aceite de inmersión en el cubreobjetos y luego concéntrese en la superficie de la muestra. A continuación, cambie el instrumento al modo de prueba Raman y apague la lámpara del microscopio. Elija un área de representación cartográfica mediante una herramienta rectangular.

Modifique el tamaño del paso para determinar el número de espectros obtenidos. Tenga en cuenta que el tamaño del paso debe ser mayor que el diámetro del punto, calculado por la apertura numérica del objetivo. Los tamaños inferiores a este darán lugar a un sobremuestreo.

Establezca los parámetros espectrales óptimos para obtener la mejor relación señal-ruido y calidad espectral, y un tiempo de adquisición adecuado en función de la idoneidad de la muestra. Generalmente, ingrese los parámetros de imagen en el software del instrumento utilizando una longitud de onda láser de 532 nanómetros, un filtro de 100%un orificio de 300, una rendija de 100, un espectrómetro de 1840 centímetros inversos, ranuras de 1200T, un objetivo de aceite de 60x y un tiempo de adquisición de dos segundos. Guarde los datos espectrales antes del procesamiento de datos y convierta los datos a un formato universal antes de continuar con el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.

Aquí se muestran los espectros Raman originales de la pared celular del álamo. Dos señales de ruido principales, que incluyen derivas de referencia y picos cósmicos, se desbordan en los canales junto con las señales reales. Estos deben eliminarse antes del análisis de datos.

Se puede aplicar una técnica de reducción de ruido como el algoritmo de Savitzky-Golay o el algoritmo de ondículas para eliminar estas señales de ruido. Para la obtención de imágenes de lignina, considere el pico espectral alrededor de 1600 centímetros inversos debido a la vibración de estiramiento simétrico del anillo aromático. Para la obtención de imágenes de polisacáridos, utilice el pico espectral alrededor de 2889 centímetros inversos debido a los tramos CH y CH2.

Sin embargo, las imágenes Raman de celulosa y hemicelulosa no se pueden generar directamente. La deslignificación es un procedimiento necesario para exponer las características espectrales de los mismos. Por lo general, somos nuevos en este método.

Nos cuesta mucho, porque requiere formación en el manejo y la apariencia del corte de muestras y el análisis de datos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo adquirir información química sobre la pared celular de la planta utilizando métodos in situ. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el pretratamiento químico, para responder a preguntas adicionales, como la recalcitrancia de la pared celular de la planta.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la naturaleza estructural interna y la topoquímica dentro de la pared celular de la planta, también se puede aplicar a otras muestras biológicas.