Combinación de imágenes Raman y Análisis Multivariante para visualizar Lignina, Celulosa y Hemicelulosa en el Muro de la Célula Vegetal
10 de junio de 2017
Este protocolo tiene como objetivo presentar un método general para visualizar la lignina, la celulosa y la hemicelulosa en las paredes celulares de las plantas usando imágenes Raman y análisis multivariante.
El objetivo general de este experimento es presentar un método general para visualizar la lignina, la celulosa y la hemicelulosa en la pared celular de la planta mediante imágenes Raman y análisis multivariante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biomasa vegetal, como por ejemplo cómo se distribuyen los principales componentes químicos en la pared celular de la planta. La principal ventaja de esta técnica es que se puede obtener información no destructiva y sin trabajo sobre la muestra con una preparación mínima de la muestra.
Para empezar, corta un pequeño bloque de tejido de la muestra de la planta. Sumerja el pañuelo en agua desionizada hirviendo durante 30 minutos. Luego, transfiéralo inmediatamente a agua desionizada a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Repita este paso hasta que el pañuelo se hunda hasta el fondo del recipiente, lo que indica que se ha eliminado el aire del pañuelo y que el tejido se ha ablandado. Prepare 20%, 50%, 70% y 90 alícuotas de PEG y agua desionizada, así como PEG puro. Mantenga las soluciones a 65 grados centígrados.
Incubar el tejido en una serie de baños de PEG graduados para desplazar el agua y permitir que el PEG se infiltre. Secar al 20 % de PEG durante una hora, al 50 % de PEG durante una hora y media, al 70 % de PEG durante dos horas, al 90 % de PEG durante dos horas y al 100 % de PEG durante 10 horas. A continuación, precalienta un casete a 65 grados centígrados en un horno.
Vierta el bloque de tejido que contiene PEG en el casete y, a continuación, coloque el bloque de tejido en la posición deseada con pinzas o agujas precalentadas. Enfríe lentamente el casete y guarde el pañuelo a temperatura ambiente hasta su uso. Diseccione el bloque PEG que contiene el tejido objetivo en un bloque pequeño con una cuchilla de afeitar afilada.
Monta el pequeño bloque de PEG en el micrótomo y corta secciones delgadas del bloque de PEG. Luego, enjuague las secciones con agua desionizada en una clase de reloj 10 veces para eliminar el PEG del tejido. A continuación, sumerja las secciones con tolueno y etanol durante seis horas para eliminar los extractivos.
Prepare el líquido de reacción mezclando 65 ml de agua desionizada, 0,5 ml de ácido acético y 0,6 g de cloruro de sodio en un vaso de precipitados. Agregue una sección y 3 mL de líquido de reacción a un vial de 5 mL. Enrosque la parte superior del vial.
A continuación, calienta el vial al baño maría a 75 grados centígrados durante dos horas para eliminar la lignina del tejido. Enjuague la sección con agua desionizada en un vidrio de reloj 10 veces. A continuación, transfiera la sección sin tratar y sin lignificar a un portaobjetos de microscopio de vidrio.
Desdobla la sección con cuidado con pinceles o agujas. Retire el exceso de agua desionizada con papel de seda. Luego, sumerja la sección en óxido de deuterio.
Cubra la muestra con un cubreobjetos de vidrio. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para evitar la evaporación del óxido de deuterio. Abra el software de funcionamiento del instrumento del microscopio Raman confocal.
Encienda el láser y concéntrese en el servicio del cristal y el silicio con un objetivo de microscopio de 100x. Haga clic en el botón de calibración para calibrar el instrumento. Cambie el instrumento al modo de microscopio óptico y encienda la lámpara del microscopio.
Monte el portaobjetos del microscopio en la platina, con el cubreobjetos orientado hacia el objetivo. Visualice la muestra con el objetivo del microscopio 20x y localice el área de interés. Cambie al objetivo del microscopio de inmersión.
Aplique aceite de inmersión en el cubreobjetos y luego concéntrese en la superficie de la muestra. A continuación, cambie el instrumento al modo de prueba Raman y apague la lámpara del microscopio. Elija un área de representación cartográfica mediante una herramienta rectangular.
Modifique el tamaño del paso para determinar el número de espectros obtenidos. Tenga en cuenta que el tamaño del paso debe ser mayor que el diámetro del punto, calculado por la apertura numérica del objetivo. Los tamaños inferiores a este darán lugar a un sobremuestreo.
Establezca los parámetros espectrales óptimos para obtener la mejor relación señal-ruido y calidad espectral, y un tiempo de adquisición adecuado en función de la idoneidad de la muestra. Generalmente, ingrese los parámetros de imagen en el software del instrumento utilizando una longitud de onda láser de 532 nanómetros, un filtro de 100%un orificio de 300, una rendija de 100, un espectrómetro de 1840 centímetros inversos, ranuras de 1200T, un objetivo de aceite de 60x y un tiempo de adquisición de dos segundos. Guarde los datos espectrales antes del procesamiento de datos y convierta los datos a un formato universal antes de continuar con el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.
Aquí se muestran los espectros Raman originales de la pared celular del álamo. Dos señales de ruido principales, que incluyen derivas de referencia y picos cósmicos, se desbordan en los canales junto con las señales reales. Estos deben eliminarse antes del análisis de datos.
Se puede aplicar una técnica de reducción de ruido como el algoritmo de Savitzky-Golay o el algoritmo de ondículas para eliminar estas señales de ruido. Para la obtención de imágenes de lignina, considere el pico espectral alrededor de 1600 centímetros inversos debido a la vibración de estiramiento simétrico del anillo aromático. Para la obtención de imágenes de polisacáridos, utilice el pico espectral alrededor de 2889 centímetros inversos debido a los tramos CH y CH2.
Sin embargo, las imágenes Raman de celulosa y hemicelulosa no se pueden generar directamente. La deslignificación es un procedimiento necesario para exponer las características espectrales de los mismos. Por lo general, somos nuevos en este método.
Nos cuesta mucho, porque requiere formación en el manejo y la apariencia del corte de muestras y el análisis de datos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo adquirir información química sobre la pared celular de la planta utilizando métodos in situ. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el pretratamiento químico, para responder a preguntas adicionales, como la recalcitrancia de la pared celular de la planta.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la naturaleza estructural interna y la topoquímica dentro de la pared celular de la planta, también se puede aplicar a otras muestras biológicas.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo presenta un método para visualizar la lignina, la celulosa y la hemicelulosa en las paredes celulares de las plantas mediante imágenes Raman y análisis multivariante. Esta técnica proporciona información no destructiva sobre la composición química de la biomasa vegetal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Vegetal
- Investigación de Biomasa
- Química Analítica
Antecedentes
- Comprender la composición de la pared celular vegetal es fundamental para la utilización de la biomasa.
- La imagen por espectroscopía Raman permite la obtención de mapas químicos detallados de los tejidos vegetales.
- El análisis multivariante facilita la interpretación de datos complejos procedentes de imágenes.
- Este método minimiza la preparación de la muestra y es no destructivo.
Objetivo del estudio
- Visualizar la distribución de los principales componentes químicos en las paredes celulares de las plantas.
- Proporcionar un método libre de mano de obra para analizar la biomasa vegetal.
- Mejorar la comprensión de la estructura y composición de la pared celular vegetal.
Métodos Utilizados
- Extraer bloques pequeños de tejido de muestras vegetales.
- Sumergir el tejido en agua desionizada hirviendo durante 30 minutos.
- Transferir el tejido a agua desionizada a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Utilizar imágenes Raman para la visualización y análisis multivariante para la interpretación de datos.
Resultados principales
- Visualización exitosa de lignina, celulosa y hemicelulosa.
- Patrones de distribución demostrados de los componentes químicos en las paredes celulares.
- Proporcionó un método no destructivo para analizar tejidos vegetales.
- Facilitó investigaciones posteriores en aplicaciones de biomasa vegetal.
Conclusiones
- El método es eficaz para estudiar la composición de la pared celular vegetal.
- La imagen Raman combinada con análisis multivariado ofrece información valiosa.
- Este enfoque puede avanzar la investigación en biología vegetal y en el uso de la biomasa.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la visualización no destructiva y sin etiquetas de la lignina, la celulosa y la hemicelulosa en las paredes celulares de las plantas, lo que apoya la eliminación de riesgos mecanicistas en la conversión de biomasa y el desarrollo de materiales basados en biología. Al proporcionar datos espacialmente resueltos sobre la composición química, facilita la validación de objetivos para la ingeniería enzimática y la optimización de pretratamientos. El enfoque reduce la dependencia de ensayos destructivos y mejora la confianza predictiva en los flujos de trabajo de cribado inicial de biomasa.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la arquitectura de la pared celular vegetal para orientar hipótesis sobre la recalcitrancia de la biomasa y la accesibilidad de enzimas.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas mediante la correlación de la distribución química con los resultados de digestibilidad enzimática.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera resultados espectrales cuantitativos que pueden estandarizarse para el cribado de alto rendimiento de variantes de biomasa.
- Valor operativo: Facilita la preparación del ensayo mediante una preparación reproducible de muestras y una variabilidad mínima dependiente del operador tras la capacitación.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Proporciona información relevante sobre sistemas de enfermedades al vincular la composición de la pared celular con rasgos fenotípicos en el rendimiento de biomasa y la eficiencia del procesamiento.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la escala preclínica al ofrecer datos composicionales consistentes y sin marcadores en diferentes conjuntos de muestras.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, facilitando la caracterización temprana de la biomasa y permitiendo decisiones basadas en datos en las líneas de desarrollo de enzimas y tratamientos previos.
- Biología de descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre barreras estructurales a la descomposición de la biomasa mediante la visualización directa de redes lignina-polisacárido.
- Selección: Proporciona mapas químicos listos para ensayos y con resolución espacial que permiten comparar cambios inducidos por tratamientos o genéticos en la composición de la pared celular.
- Análisis: Genera resultados multivariantes que cuantifican la distribución y co-localización de componentes, posibilitando comparaciones objetivas entre distintas condiciones experimentales.
- Investigación traslacional: Se conecta con la validación preclínica al proporcionar referencias composicionales para evaluar la idoneidad de la biomasa en rutas de biocombustibles o bioproductos.
- Reutilización empresarial: Establece una plataforma de imagen y análisis reutilizable, aplicable a múltiples materias primas de biomasa y etapas de proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la selección de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la recalcitrancia de la biomasa.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y escalabilidad mediante protocolos definidos de adquisición espectral y procesamiento de datos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avanzar/no avanzar en el desarrollo de cepas o pretratamientos de biomasa al proporcionar una evaluación temprana de riesgos composicionales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos de biomasa basada en perfiles estructurales y composicionales validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en espectroscopía Raman, análisis multivariado de datos y manejo de tejidos vegetales.
- Depende del acceso a microscopios Raman confocales con longitudes de onda láser y objetivos adecuados.
- Necesita una estandarización entre equipos para la preparación de muestras, seccionado e interpretación de datos para garantizar la reproducibilidad.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diversas especies vegetales o tipos de tejidos con distinta complejidad de las paredes celulares.
- Limitado por la necesidad de delignificación para resolver las señales de celulosa y hemicelulosa, lo que añade pasos al procedimiento y posibles variaciones.
