Name: Combinación de imágenes Raman y Análisis Multivariante para visualizar Lignina, Celulosa y Hemicelulosa en el Muro de la Célula Vegetal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprende a visualizar lignina, celulosa y hemicelulosa en paredes celulares vegetales mediante imagen Raman y análisis multivariante. Este método no destructivo permite estudiar la composición química de la biomasa vegetal con mínima preparación de muestra.

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Damos las gracias al Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2016YDF0600803) por el apoyo financiero.

1. Preparación de la muestra <ol><li> Corte un pequeño bloque de tejido (aproximadamente 3 mm x 3 mm x 5 mm) de la muestra de la planta ( por ejemplo, un tallo de álamo). </li><li> Sumerja el tejido en agua desionizada hirviendo durante 30 min. Se transfiere inmediatamente a agua desionizada a temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Repita este paso hasta que el tejido se hunde en el fondo del recipiente, lo que indica que el aire en el tejido se ha eliminado y que el tejido se ha ablandado. Nota: Para las muestras que se hunden en el fondo antes de este paso, repita este ciclo generalmente 3-5 veces. </li><li> Preparar alícuotas de polietilenglicol (PEG) de 20, 50, 70, 90% (v / v) en agua desionizada, así como PEG puro y mantener las soluciones a 65 ° C. </li><li> Incube el tejido en una serie de baños graduados de PEG para desplazar el agua y permitir que el PEG se infiltre. Nota: Típicamente, se utiliza PEG con un peso molecular de 2.000 (PEG2000) para incrustar. <ol><li> Procesar el tejido con g(C) 70% de PEG durante 2 h, (d) 90% de PEG durante 2 h, y (b) 50% de PEG durante 1,5 h, (E) 100% de PEG durante 10 h. </li></ol></li><li> Precalentar un casete a 65 ° C en un horno. Vierta el PEG que contiene el bloque en el casete y luego coloque el bloque de tejido en la posición deseada utilizando pinzas precalentadas o agujas. </li><li> Enfriar lentamente el cassette y almacenar el tejido a RT hasta su uso. </li><li> Diseccionar el bloque de PEG que contiene el tejido objetivo en un pequeño bloque (aproximadamente 1 cm x 1 cm x 2 cm) usando una cuchilla de afeitar afilada y montarlo en el micrótomo. </li><li> Cortar secciones delgadas del bloque de PEG (típicamente 3-10 μm). </li><li> Enjuague la sección con agua desionizada en un cristal de reloj 10 veces para eliminar el PEG del tejido. </li><li> Sumergir las secciones con tolueno / etanol (2: 1, v / v) durante 6 h para eliminar los extractos. Preparar el líquido de reacción mezclando 65 ml de agua desionizada, 0,5 ml de ácido acético y 0,6 g de cloro sódicoRito en un vaso de precipitados. Añadir una sección y 3 ml de líquido de reacción a un vial de 5 ml. Atornille la parte superior del vial. </li><li> Calentar el vial en un baño de agua a 75 ° C durante 2 h para eliminar la lignina del tejido. Enjuague la sección con agua desionizada en un cristal de reloj 10 veces. </li><li> Transferir la sección no tratada / deslignificada a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Despliegue la sección cuidadosamente con pinceles o agujas. Retire el agua desionizada extra con papel de seda. </li><li> Sumergir la sección en D 2 O. Cubrir la muestra con un protector de vidrio. Sellar el protector con esmalte de uñas para evitar la evaporación del D 2 O. </li></ol> 2. Adquisición Espectral <ol><li> Abra el software de operación del instrumento del microscopio Raman confocal. Encienda el láser (longitud de onda = 532 nm), enfoque en la superficie del silicio cristalino con un objetivo de microscopio 100X y haga clic en el botón de calibración para calibrar el instrumento. </li><li> Cambiar el instrumentoAl modo de microscopio óptico y encienda la lámpara del microscopio. Montar el portaobjetos del microscopio sobre el escenario, con el revestimiento de la cubierta frente al objetivo. </li><li> Ver la muestra con un objetivo de microscopio 20X y localizar el área de interés. Aplique aceite de inmersión a la cubreobjetos y cambie al objetivo del microscopio de inmersión (60X, apertura numérica NA = 1.35). Enfoque en la superficie de la muestra. </li><li> Cambie el instrumento al modo de prueba Raman y apague la lámpara del microscopio. </li><li> Elija un área de asignación mediante una herramienta rectangular. Alterar el tamaño del paso para determinar el número de espectros obtenidos. Nota: Tenga en cuenta el tamaño del paso (generalmente mayor que el diámetro del punto calculado por la apertura numérica del objetivo, teóricamente 1.22λ / NA). Los tamaños debajo de esto resultarán en sobremuestreo. </li><li> Establezca los parámetros espectrales óptimos para obtener la mejor relación señal-ruido (SNR) y calidad espectral en un tiempo de adquisición apropiado (generalmente &lt;8 h), depeLa adecuación de la muestra. En general, introduzca los parámetros de imagen en el software del instrumento de la siguiente manera: láser (532 nm), filtro (100%), agujero (300), hendidura (100), espectrómetro (1.840 cm -1 ), ranuras (1200t) Aceite 60X) y tiempo de adquisición (2 s). </li><li> Guarde los datos espectrales antes de procesar los datos y convertirlos a un formato universal ( por ejemplo, archivos TXT). </li></ol> 3. Análisis de datos <ol><li> Cargar los datos espectrales (archivos TXT) en el software de análisis de datos ( por ejemplo, Matlab). Aplicar una técnica de reducción de ruido en el conjunto de datos para mejorar la SNR ( por ejemplo, el algoritmo de Savitzsky-Golay o el algoritmo wavelet) </li><li> Utilice muestras no tratadas para producir las imágenes de lignina y polisacáridos. Para la obtención de imágenes de lignina, considere el pico espectral alrededor de 1.600 cm -1 debido a la vibración de estiramiento simétrica del anillo aromático. Para la obtención de imágenes de polisacáridos (incluyendo celulosa y hemicelulosa), utilice el pico espectral aAlrededor de 2.889 cm -1 debido a los tramos CH y CH 2 . </li><li> Utilizar muestras deslignificadas para generar las imágenes de celulosa y hemicelulosa. Realizar la auto-modelación de la curva de resolución (SMCR) en los espectros adquiridos para discriminar los espectros de celulosa y hemicelulosa y la imagen de sus distribuciones. </li><li> Realizar análisis de componentes principales (PCA) y análisis de agrupamiento en los datos adquiridos para distinguir los espectros Raman de diferentes capas de pared celular. </li></ol>

<ol><li>Gonzalo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Enzymes+Involved+in+Lignin+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation.</a> J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).</li>
<li>Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosatella%2C+AA+%22Ionic+Liquids+in+the+Biorefinery+Concept%3A+Challenges+and+Perspectives%22">Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives</a>. , Wiley. 38-64 (2016).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+tissue+specific+compositions+of+bioenergy+feedstocks+Through+hyperspectral+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%22%5BJournal%5D)">Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging.</a> Bio. 108 (2), 286-295 (2009).</li>
<li>Tolstik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+prediction+of+HCC+tissues+by+Raman+imaging+with+identification+of+fatty+acids+as+potential+lipid+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).</li>
<li>Schrader, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchrader%2C+B+%22Infrared+and+Raman+spectroscopy%3A+methods+and+applications%22">Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications</a>. , John Wiley and Sons. (2008).</li>
<li>Gierlinger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+plant+cell+walls+by+confocal+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).</li>
<li>Luca, A. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).</li>
<li>Schlücker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+comparison+of+point%2C+line%2C+and+wide-field+imaging+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies.</a> Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).</li>
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<li>Cheng, H. J., Hsiau, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003259101000046X">The study of granular agglomeration mechanism.</a> Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+removing+spectral+contaminants+to+improve+analysis+of+Raman+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data.</a> Sci. Rep. 6, 39891(2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La pared celular de la planta es un compuesto que se organiza en varias capas, incluyendo la esquina de la celda (CC), la pared secundaria (SW, con las capas S1, S2 y S3) y la lámina central compuesta (CML, Pared), lo que hace difícil obtener una superficie plana durante la preparación de la muestra. Por lo tanto, las muestras de plantas, especialmente hierba, que tiene una estructura más complicada que la madera, a menudo necesitan solidificarse para permitir una sección fina. PEG es una matriz dura ideal para el corte...

La biomasa vegetal es el recurso renovable más abundante de la Tierra; está compuesta principalmente de lignina, celulosa y hemicelulosa; y se considera una fuente atractiva de bioenergía y productos químicos de base biológica1. Desafortunadamente, puede resistir la degradación y conferir estabilidad hidrolítica o robustez estructural a la pared celular de la planta. Dicha resistencia es atribuible al área de superficie accesible, el tamaño de partícula de biomasa, el grado de polimerización, la cristalinidad de la celulosa y la lignina protectora2. Por lo tanto, una comprensión completa de la naturaleza estructural y química de la pared celular de la planta es importante desde el punto de vista de la biología y la química de las plantas, así como desde el de la utilización comercial. Los análisis de química húmeda de uso común, como la cromatografía, la espectrometría de masas y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear, solo proporcionan datos de composición promedio de la muestra medida. Además, estos métodos son invasivos y destruyen la estructura original del tejido vegetal3. 
La técnica de imagen Raman es una poderosa herramienta para la visualización no destructiva de información química resuelta espacialmente4. Utiliza una luz láser para causar una dispersión inelástica con un fotón y se basa en los cambios en la polarizabilidad que surgen de las vibraciones moleculares. En este caso, el agua provoca una dispersión Raman débil, lo que hace que este enfoque sea adecuado para investigaciones in situ de muestras biológicas5. La aplicación de la técnica de imagen Raman a la pared celular de la planta puede dilucidar la estructura y composición de las paredes celulares de la planta en su estado nativo, con la resolución a escala de la célula individual e incluso de las capas de la pared celular6. Un análisis de imágenes Raman típico de la pared celular de una planta generalmente consta de tres pasos: 1) preparación de la muestra, 2) adquisición espectral y 3) procesamiento de datos. 
Aunque una de las principales ventajas de las imágenes Raman es la capacidad de lograr espectros sin etiquetas y no destructivos con una preparación mínima de la muestra, el corte físico de la muestra sigue siendo necesario para exponer la superficie de interés. Este proceso debe realizarse con cuidado para obtener una superficie plana, ya que la técnica depende de mantener el foco óptico7. La adquisición espectral requiere un equilibrio entre la calidad de la imagen y los tiempos de adquisición extensos8. El procesamiento de datos tiene como objetivo extraer eficazmente la información química de los datos de la imagen, especialmente para los componentes con estructuras químicas similares, como la celulosa y la hemicelulosa. Debido a la fuerte superposición espectral, los espectros exactos son difíciles de discernir. En este caso, el análisis multivariante es un enfoque sencillo para descubrir de manera efectiva la información estructural y química que se esconde9. Este trabajo presenta un protocolo general que describe el uso de imágenes Raman para visualizar los componentes principales en las paredes celulares de las plantas, incluyendo lignina, celulosa y hemicelulosa.

<table><tbody><tr><td>Microtomo</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM430</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Raman Confocal</td><td>Horiba Jobin Yvon</td><td>Xplora</td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td>Shanghai ZHICHENG</td><td>ZXFD-A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

combinación de imágenes raman y análisis multivariante para visualizar lignina, celulosa y hemicelulosa en el muro de la célula vegetal

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

La aplicación de la imagen Raman a la biomasa vegetal está aumentando porque puede ofrecer información espacial y composicional sobre soluciones acuosas. El análisis no suele requerir una preparación extensiva de la muestra; La información estructural y química se puede obtener sin etiquetado. Sin embargo, cada imagen Raman contiene miles de espectros; Esto plantea dificultades al extraer información oculta, especialmente para componentes con estructuras químicas similares. Este trabajo introduce un análisis multivariado para abordar esta cuestión. El protocolo establece un método general para visualizar los componentes principales, incluyendo lignina, celulosa y hemicelulosa dentro de la pared celular de la planta. En este protocolo, se describen procedimientos para la preparación de muestras, adquisición espectral y procesamiento de datos. Es altamente dependiente de la habilidad del operador en la preparación de la muestra y en el análisis de los datos. Mediante el uso de este enfoque, una investigación Raman puede ser realizada por un usuario no especialista paraH-calidad de datos y resultados significativos para el análisis de la pared celular de la planta.

La Figura 1 presenta una visión general de un sistema micro-Raman típico para la imagen Raman de una pared celular de una planta. Como ejemplo, los espectros Raman originales del álamo ( Populus nigra L.) tienen deriva y espigas de línea de base significativas ( Figura 2a ). Después de realizar el método de preprocesamiento automático para el conjunto de datos de imágenes Raman (APRI), estos dos contaminantes espectrale...

Este protocolo tiene como objetivo presentar un método general para visualizar la lignina, la celulosa y la hemicelulosa en las paredes celulares de las plantas usando imágenes Raman y análisis multivariante.

Combinación de imágenes Raman y Análisis Multivariante para visualizar Lignina, Celulosa y Hemicelulosa en el Muro de la Célula Vegetal

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

El objetivo general de este experimento es presentar un método general para visualizar la lignina, la celulosa y la hemicelulosa en la pared celular de las plantas mediante imágenes Raman y análisis multivariado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biomasa vegetal, como cómo se distribuyen los principales componentes químicos en la pared celular de las plantas. La principal ventaja de esta técnica es que se puede obtener información libre de manipulaciones y no destructiva sobre la muestra con una preparación mínima de la misma.Para comenzar, corte un pequeño bloque de tejido de la muestra vegetal. Sumerja el tejido en agua desionizada hirviendo durante 30 minutos. Luego, transfiéralo inmediatamente a agua desionizada a temperatura ambiente durante 30 minutos.Repita este paso hasta que el tejido se hunda hasta el fondo del recipiente, lo que indica que se ha eliminado el aire del tejido y que este se ha ablandado. Prepare alícuotas de PEG y agua desionizada al 20%, 50%, 70% y 90%, así como PEG puro. Mantenga las soluciones a 65 grados Celsius.Incube el tejido en una serie de baños de PEG de concentración creciente para desplazar el agua y permitir

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La biomasa vegetal es uno de los principales de carbono-neutral recurso renovable que podría ser utilizado para la producción de biocombustibles. La biomasa vegetal se compone principalmente de las paredes celulares, un material compuesto estructuralmente complejos denomina lignocelulosa. Aquí se describe un protocolo para un análisis exhaustivo del contenido y la composición de la lignina polifenólicos.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

La biomasa vegetal es uno de los principales de carbono-neutral recurso renovable que podría ser utilizado para la producción de biocombustibles. La biomasa vegetal se compone principalmente de las paredes celulares, un material compuesto estructuralmente complejos denomina lignocelulosa. Aquí se describe un protocolo para un análisis exhaustivo del contenido y la composición de los hidratos de carbono de pared derivados.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte II: Los hidratos de carbono

Un método basado en la microscopía confocal de Raman que se presenta ofrece sin etiquetas de visualización de la lignina en las paredes celulares vegetales y comparación de lignificación en los diferentes tejidos, muestras o especies.

Sin etiquetas In situ Imágenes de lignificación de las paredes celulares vegetales

Se evalúan la estructura de la pared celular de la planta y los rasgos químicos para identificar las materias primas ideales para biocombustibles y biomateriales. Los métodos estándar tienen limitaciones cuando se aplican a grandes conjuntos de datos. Estos métodos de pretratamiento de alto rendimiento, sacarificación enzimática y espectrometría de masas de haz molecular de pirólisis comparan un gran número de muestras de biomasa con una disminución del tiempo y el costo experimental.

Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

La celulosa cristalina es un componente importante de la pared celular de la planta. Sin embargo, su cuantificación a una resolución celular es técnicamente desafiante.  Aquí, reportamos el uso de la tecnología de luz polarizada y secciones transversales de raíces para obtener información de la composición de la pared celular a una resolución espacio-temporal.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

BLISS, un etiquetado de dos protocolos para estudiar la dinámica de la lignificación, fue desarrollado. Con sintética monolignol reporteros y una combinación secuencial de bioorthogonal SPAAC y CuAAC haga clic en reacciones, esta pavimenta la manera a un análisis profundo de los factores que regulan la biogénesis de lignina en la plantade la metodología.

Visualización dinámica de lignificación en plantas con la química Click: doble etiquetado es felicidad!

Este protocolo describe una configuración original que combina mediciones de vida útil espectral y fluorescencia para evaluar la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) entre las sondas fluorescentes a base de rodamina y el polímero de lignina directamente en secciones gruesas de la planta.

Medición de interacciones entre sondas fluorescentes y lignina en secciones de plantas por sFLIM basado en autofluorescencia nativa

Este protocolo presenta un enfoque multimodal que combina la espectroscopia Raman y la microscopía de fase tomográfica para el fenotipado no invasivo y sin etiquetas de células vivas de cáncer de mama humano. Incluye una línea de análisis fácil de usar y sin sesgos humanos para un análisis morfoquímico rápido y cuantitativo, que proporciona información molecular y estructural detallada con aplicaciones en la investigación del cáncer y la biología celular.

Un marco de imágenes multimodal para avanzar en el fenotipado de células vivas de cáncer de mama sin etiquetas

En este manuscrito se presentan los métodos de oxidación periodato y reticulación de glutaraldehído para la inmovilización covalente de anticuerpos en discos de papel. Se evaluó la actividad de unión de los anticuerpos inmovilizados. Sobre la base de estos resultados, se utilizó un método de reticulación de glutaraldehído para desarrollar un nuevo inmunoensayo en papel para la detección de inmunoglobulinas G (IgG).

Covalente La unión de anticuerpos a los discos de papel de celulosa y sus aplicaciones en-simple vista colorimétricos inmunoensayos

Se presenta un protocolo para la extracción completa de lípidos, metabolitos y proteínas de tejidos biológicos utilizando una muestra.

Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

Aprende a visualizar lignina, celulosa y hemicelulosa en paredes celulares vegetales mediante imagen Raman y análisis multivariante. Este método no destructivo permite estudiar la composición química de la biomasa vegetal con mínima preparación de muestra.

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