Name: Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a diseñar y fabricar microarrays de péptidos para perfilar la especificidad de anticuerpos contra histonas y sus modificaciones postraduccionales. Este método mejora el control de calidad en investigación epigenética.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto de Investigación Van Andel y una beca de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (CA181343) a SBR

Los autores no tienen nada que revelar.

La fiabilidad de los anticuerpos en aplicaciones de investigación biomédica es fundamental 46 , 47 . Esto es especialmente cierto en la bioquímica de la cromatina dada la posición de los anticuerpos como herramientas clave para la mayoría de las técnicas desarrolladas para caracterizar la abundancia y distribución de histonas PTMs. El protocolo presentado aquí detalla un oleoducto optimizado para el diseño, fabricación y uso de microarrays de péptidos para anali...

El ADN genómico se empaqueta elegantemente dentro del núcleo de la célula eucariota con proteínas histonas para formar cromatina. La subunidad de repetición de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pares de bases de ADN envueltas alrededor de un núcleo octameric de las proteínas histonas - H2A, H2B, H3 y H4 1 . La cromatina se organiza ampliamente en euchromatina libremente envasada y dominios de heterocromatina fuertemente envasados. El grado de compactación de la cromatina regula la medida en que las máquinas de proteínas pueden acceder al ADN subyacente para llevar a cabo procesos fundamentales basados ​​en el ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación. Los reguladores clave de la accesibilidad del genoma en el contexto de la cromatina son PTMs en la cola no estructurada y los dominios centrales de las proteínas histonas 2 , 3 . Las PTM histonas funcionan directamente influyendo en la estructura de la cromatina 4 e indirectamenteH la contratación de proteínas lectoras y sus complejos macromoleculares asociados que tienen actividades de remodelación, enzimática y andamiaje de la cromatina 5 . Los estudios de la función PTM de las histonas durante las últimas dos décadas sugieren abrumadoramente que estas marcas juegan un papel clave en la regulación del destino celular, el desarrollo de organismos y la iniciación / progresión de la enfermedad. Impulsados ​​por los avances en espectrometría de masas basado en la tecnología proteómica, más de 20 único histone PTMs en más de 80 residuos distintos de histonas se han descubierto [ 6] . En particular, estas modificaciones a menudo se producen en combinaciones, y en consonancia con la hipótesis de &quot;código de histonas&quot;, numerosos estudios sugieren que las proteínas lectoras son dirigidas a regiones discretas de cromatina a través del reconocimiento de combinaciones específicas de histonas PTMs 7 , 8 , 9 . Un desafío clave para avanzar será la asignación de funciones al grDebido a la lista de histonas PTMs y para determinar cómo específicas combinaciones de histonas PTMs orquestar las funciones dinámicas asociadas con la cromatina. Los anticuerpos son los reactivos de la linterna para la detección de PTM histonas. Como tal, más de 1.000 histonas PTM anticuerpos específicos han sido comercialmente desarrollado para su uso en la investigación de la bioquímica de la cromatina. Con el rápido desarrollo de la tecnología de secuenciación de ADN de alto rendimiento, estos reactivos están siendo utilizados ampliamente por investigadores individuales y iniciativas epigenómicas a gran escala ( por ejemplo , ENCODE y BLUEPRINT) en ChIP-seq (inmunoprecipitación de cromatina junto con secuenciación de próxima generación ) De tuberías para generar de alta resolución mapas espaciales de histonas PTM distribución de todo el genoma 10 , 11 . Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la especificidad de los anticuerpos PTM de las histonas puede ser altamente variable y que estos reactivos presentan<html> Las propiedades avorables tales como el reconocimiento de epítopos fuera de objetivo, la fuerte influencia positiva y negativa por PTMs vecinas y la dificultad para discriminar la orden de modificación en un residuo particular ( por ejemplo , mono-, di- o trimetil-lisina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Por lo tanto, es necesario un riguroso control de calidad de los reactivos de anticuerpos específicos de histonas PTM para interpretar con precisión los datos generados con estos valiosos reactivos. La tecnología de microarray permite la interrogación simultánea de miles de interacciones macromoleculares en un formato de alto rendimiento, reproducible y miniaturizado. Por esta razón, una variedad de plataformas de microarrays se han creado para analizar la proteína-ADN 19 ,20, la proteína-proteína 21 , y las interacciones proteína-péptido 22. De hecho, los microarrays de péptidos histona han surgido como una plataforma de descubrimiento informativo para la investigación de la bioquímica de la cromatina, permitiendo el perfilado de alto rendimiento de los escritores, borradores y lectores de histonas PTMs 15 , 23, 24, y también para el análisis de la especificidad del anticuerpo de histona 17, 25. más allá de su aplicación en la cromatina y la epigenética investigación, las matrices de péptidos de histona tienen utilidad potencial como una prueba de diagnóstico / pronóstico para el lupus eritematoso sistémico y otras enfermedades autoinmunes donde anti- Se generan autoanticuerpos de cromatina 26 , 27 . Aquí, describimos una tubería integrada que hemos desarrollado para diseñar, fabricar yPara generar perfiles de especificidad para anticuerpos que reconocen las histonas y sus PTMs. El pipeline es facilitado por ArrayNinja, una aplicación de código abierto de software interactivo que recientemente desarrollamos, que integra las etapas de diseño y análisis de los experimentos con microarrays [ 28] . ArrayNinja funciona mejor en Google Chrome. En resumen, se utiliza una impresora de microarrays de contacto robótico para depositar una biblioteca de péptidos de histona conjugados con biotina en posiciones definidas en portaobjetos de microscopio de vidrio revestidos con estreptavidina. Las matrices se pueden utilizar entonces en un formato de ensayo competitivo y paralelo para interrogar las interacciones anticuerpo-epítopo ( Figura 1 ). La biblioteca de péptidos consiste en cientos de péptidos sintéticos únicos que albergan PTMs (acetilación de lisina, metilación de lisina / arginina y fosforilación serina / treonina) solos y en combinaciones relevantes derivadas en gran medida de conjuntos de datos proteómicos. Métodos de síntesis y validación de péptidos<html> Se detallan en otra parte 23 . Los datos generados a partir de nuestros esfuerzos de detección de anticuerpos PTM de histonas en curso que utilizan esta plataforma de matriz se archivan en un recurso público de la web, la Base de datos de especificidad de anticuerpos de histonas (www.histoneantibodies.com). En particular, los microarrays de péptidos de histona fabricados con variaciones de este protocolo también se han utilizado ampliamente para caracterizar la actividad de los dominios de lectores de PTM de histonas 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 y más recientemente a histona de perfil Actividades de escritor y borrador de PTM 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Representación de dibujos animados del procedimiento escalonado para la detección de anticuerpos en un microarray de péptidos histona. Los péptidos de histona biotinilados que albergan modificaciones postraduccionales definidas (círculos rojos y azules) se co-imprimen con biotina-fluoresceína sobre vidrio revestido con estreptavidina. Las interacciones positivas se visualizan como fluorescencia roja. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Búfer de impresión</td><td>ArrayIt</td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de estreptavidina</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>polipropileno Placa de 384 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-fluoresceína</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>impresora de microarrays de contacto</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Impresora de microarrays Contacto</td></tr><tr>impresora<td>de microarrays</td><td>Gene Machines</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Impresora de microarrays</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer ArrayIt</td><td></td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo de cera hidrofóbico</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge Barrera hidrofóbica Bolígrafo PAP</td></tr><tr><td>de silicona Junta</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de hibridación</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-conejo)</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-ratón)</td></tr><tr><td>Cera Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de microarrays</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>o equivalente Escáner</td></tr><tr><td>de microarrays EipTitan Histone Peptide Microarray</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histone Microarray de péptidos</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified Histone Matriz de péptidos</td><td>Active Motif</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Código de histonas Microarrays de péptidos</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>cera</td> Royal <td>Oak</td><td>GulfWax</td><td>para impresora de cera</td></tr><tr><td>Microarray humidificado cámara de hibridación de portaobjetos</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de alto rendimiento cámara de lavado de portaobjetos</td><td>ArrayIt</td><td>Microscopio HTW</td><td></td></tr><tr><td> centrífuga de corredera</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Péptido de histonas biotiniladas</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>Ejemplo de péptido. Péptidos similares con diversas modificaciones están disponibles en varias fuentes comerciales.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Las modificaciones postraduccionales (PTMs) en las proteínas histonas son ampliamente estudiadas por sus papeles en la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica. La producción en masa y la distribución de anticuerpos específicos de histonas PTMs ha facilitado enormemente la investigación sobre estas marcas. Como los anticuerpos histónicos PTM son reactivos clave para muchas aplicaciones de bioquímica de la cromatina, es necesario un análisis riguroso de la especificidad del anticuerpo para una interpretación precisa de los datos y un progreso continuo en el campo. Este protocolo describe una tubería integrada para el diseño, fabricación y uso de microarrays peptídicos para perfilar la especificidad de los anticuerpos histona. Los aspectos de diseño y análisis de este procedimiento son facilitados por ArrayNinja, un paquete de software interactivo y de código abierto que recientemente desarrollamos para simplificar la personalización de los formatos de impresión en microarrays. Este gasoducto se ha utilizado para examinar un gran número de anticonceptivos de histonas PTM comercialmente disponibles y ampliamente utilizadosS, y los datos generados a partir de estos experimentos están disponibles gratuitamente a través de una base de datos en línea y en expansión Histone Antibody Specificity. Más allá de las histonas, la metodología general aquí descrita puede aplicarse ampliamente al análisis de anticuerpos específicos de PTM.

Este protocolo se ha utilizado para diseñar y fabricar una plataforma de microarrays de péptidos para el análisis de la especificidad de anticuerpos histona PTM. El array consulta una biblioteca de más de 300 características únicas de péptidos (20 - 40 residuos de longitud) que representan muchas de las combinaciones conocidas de PTMs que se encuentran en el núcleo y la variante de las proteínas histonas [ 38] . Este gasoducto ha sido un caballo de batalla para el...

Este manuscrito describe métodos para aplicar la tecnología de microarrays de péptidos a la especificidad de perfiles de anticuerpos que reconocen las histonas y sus modificaciones post-traduccionales.

Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

El objetivo de este video es describir una tubería integrada para el diseño, fabricación y uso de microarreglos de péptidos para caracterizar las especificidades de los anticuerpos contra histonas. Los anticuerpos que reconocen las histonas y sus diversas modificaciones postraduccionales son reactivos clave en la investigación de bioquímica de la cromatina. Dependemos de estas herramientas para profundizar nuestra comprensión de la función de las modificaciones de histonas.Estudios recientes revelan inconsistencias en el comportamiento de los anticuerpos contra histonas. Dado que la elección del anticuerpo es el elemento más crítico en experimentos de epigenética, se exigen medidas rigurosas e integrales de control de calidad para estos reactivos. Aquí, demostramos una metodología integrada que hemos desarrollado para diseñar, fabricar y analizar microarreglos de péptidos con el fin de generar perfiles de especificidad para anticuerpos que reconocen histonas y sus modificaciones postraduccionales.El proceso se facilita mediante Array Ninja, una aplicación informática interactiva de código abierto que desarrollamos, la cual integra las etapas de diseño y análisis de experimentos con microarreglos. Para comenzar con el diseño del portaobjetos, bajo el encabezado Planificar una distribución del portaobjetos, seleccione la impresora de microarreglos que se utilizará. Luego, escriba vacío en el campo de placa de carga y presione enter.Configure el diámetro del punto en 275 micrómetros y el espaciado entre puntos en 100 micrómetros. Complete los parámetros restantes de manera adecuada para el experimento, asegurándose de que el diseño permita réplicas suficientes. En la vista previa del diseño resultante, coloque el cursor sobre cada característica única de péptido en el portaobjetos e ingrese un identificador de característica en el cuadro de texto emergente.Una vez que cada característica única haya sido etiquetada, haga clic en rellenar. Asigne un nombre al diseño de la diapositiva y haga clic en confirmar su placa para guardar el diseño y generar un mapa con las ubicaciones físicas de cada característica en las placas de origen. Guiado por el mapa de la placa de origen, cargue uno a dos microlitros de cada característica peptídica en los pozos designados de una o más placas de pequeño volumen de 384 pozos, diluya cada característica 10 veces con tampón de impresión para microarreglos de proteínas 1x, suplementado con 1 % de albúmina de suero bovino y cinco microgramos por microlitro de biotina marcada con fluoresceína.A continuación, centrifugue las placas a 500 x G a temperatura ambiente durante dos minutos. Luego, vacíe el contenedor de desechos de la impresora de microarreglos. Llene los recipientes del humidificador con la solución lavada con agua destilada estéril.Introduzca los parámetros del portaobjetos de matriz en el software de la impresora de microarrays. Configure el procedimiento de lavado para un lavado de un segundo con inmersión única, el poslavado para reinsertar los pasadores cinco veces, y la humedad al 60 %. Luego, inserte los portaobjetos de vidrio recubiertos en los platillos de sustrato. Cargue los platillos en el elevador de platillos.Inserte las placas fuente en los portaplacas y cargue los portaplacas en el elevador de placas fuente. Ejecute el proceso de impresión y luego retire los platillos de sustrato del instrumento. Bloquee los portaobjetos impresos con tampón de bloqueo para microarreglos de proteínas 1x durante 30 minutos agitando.A continuación, lave las laminillas con solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente y pH 7,6 durante 10 minutos. Repita el lavado con un nuevo lote de PBS. Seque las laminillas por centrifugación durante 30 segundos a temperatura ambiente.A continuación, precaliente un impresor de cera para microarreglos a 85 grados celsius durante 30 minutos, o hasta que la cera se derrita. Luego, inserte una portaobjetos con el lado impreso hacia abajo en el soporte y alinee el soporte con el molde del impresor. Ponga el molde en contacto con la portaobjetos y manténgalo durante dos segundos; después, retire rápidamente la portaobjetos del soporte e inspeccione los bordes de cera para verificar que los arreglos estén adecuadamente encerrados.Almacene los portaobjetos divididos a cuatro grados centígrados, en un área seca y oscura. Para comenzar el procedimiento de hibridación, coloque un portaobjeto con matriz dividida en un recipiente de plástico y cúbralo con tampón de hibridación. Equilibre el portaobjeto durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, agitando a velocidad baja.Seque la laminilla centrifugándola en una centrífuga para microarreglos a temperatura ambiente. Luego, agregue cinco microlitros de cada solución de anticuerpo contra PTM de histona a al menos dos pozos del arreglo e incube a cuatro grados Celsius durante una hora. Tras la incubación, retire la solución de anticuerpo y lave el arreglo con PBS frío tres veces, cinco minutos cada vez, a cuatro grados Celsius.A continuación, incube el arreglo en una solución de anticuerpo secundario conjugado con un colorante fluorescente durante 30 minutos a cuatro grados celsius, en ausencia de luz. Lave la laminilla tres veces con PBS frío como antes.Sumerja la matriz en PBS 0,1x a temperatura ambiente para eliminar la sal en exceso y seque la portaobjetos mediante una breve centrifugación a temperatura ambiente. Imagen la portaobjetos con un escáner de microarrays con una resolución de al menos 25 micrones. Para comenzar el análisis, utilice un software de procesamiento de imágenes para fusionar los archivos de canal único provenientes del escáner de microarrays.A continuación, abra Array Ninja y seleccione la impresora de microarreglos adecuada en el encabezado para cuantificar imágenes. Complete con el nombre del mismo diseño de portaobjetos en el cuadro de diálogo cargar placa y presione enter. Cargue el archivo de imagen fusionada y ajuste el contraste, el brillo y el punto medio según desee.Rellene la resolución del escáner de matriz y ajuste los márgenes superior y lateral para alinear la cuadrícula de diseño del portaobjetos con la imagen. Para analizar un conjunto de pocillos como réplicas o realizar otro análisis selectivo, rellene las coordenadas de los pocillos en los campos iPin, jPin y subA y presione enter. Haga clic para alternar el zoom y mostrar una imagen ampliada del área bajo el cursor.A continuación, haga clic en buscar punto y espere a que finalice el proceso. Repita la función de búsqueda según sea necesario para centrar los círculos de la cuadrícula sobre los puntos de la matriz. Los puntos de referencia se pueden seleccionar presionando la tecla R, y los puntos que muestren residuos o una morfología muy diferente pueden desactivarse presionando la tecla A mientras se coloca el cursor sobre el punto.Una vez que se han seleccionado los puntos de referencia de fondo y se han desactivado los puntos con morfología de poros o contaminación, haga clic en rellenar, seguido de enviar para realizar la cuantificación. Se mostrará un gráfico de barras y una tabla en una nueva página. Las especificidades de unión de dos anticuerpos frente a PTM de histonas se evaluaron utilizando este método.Se descubrió que un anticuerpo contra una PTM de histona diseñado para reconocer la lisina 9 trimetilada en la histona H3 también se une a otros tres grupos de lisina trimetilados. Se observó que la sililación de residuos de lisina adyacentes influye positivamente en el reconocimiento de la lisina 9 en H3. Un anticuerpo contra una PTM de histona dirigido contra la lisina 4 trimetilada en la histona H3 mostró interacción con la lisina 4 metilada una vez y dimetilada en H3. La fosforilación de las tres alaninas adyacentes afectó negativamente la unión en la lisina 4 en este ensayo.Esta metodología se ha utilizado para analizar muchos de los anticuerpos contra histonas más ampliamente utilizados y disponibles comercialmente, y los datos generados a partir de estos experimentos están disponibles gratuitamente a través de la base de datos de especificidad de anticuerpos contra histonas. Se han descrito previamente variaciones de esta metodología para el análisis de lectores, escritores y borradores de histonas, lo que permite adaptar esta plataforma fácilmente para cualquier biblioteca imprimible de interés, más allá de la investigación en epigenética. Varios microarreglos de péptidos de histonas están disponibles comercialmente para usuarios que no tienen acceso al equipo especializado necesario para sintetizar péptidos y fabricar matrices.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este estudio, se describe un protocolo mejorado para una micromatriz anticuerpo multiplexado de alto rendimiento con el método de detección de lectina que se puede utilizar en perfiles de glicosilación de proteínas específicas. Este protocolo incluye nuevos reactivos fiables y reduce significativamente el tiempo, el coste y los requisitos de equipos de laboratorio, en comparación con el procedimiento anterior.

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

Este video muestra una técnica que aplica la tecnología de microarrays de péptidos para perfilar la especificidad de los anticuerpos reconociendo modificaciones postraduccionales (PTM) en péptidos de histonas. Un portaobjetos de microarray que contiene péptidos de histonas conjugados con fluoróforos inmovilizados con combinaciones conocidas de PTM se trata con anticuerpos específicos de PTM diana. Este proceso ayuda a identificar la especificidad del anticuerpo para el objetivo y su posible...

Una tecnología de microarrays de péptidos para el perfil de especificidad de los anticuerpos

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación o diseño. Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala para placas de 384 pocillos. Este formato rentable puede ser muy útil en los campos de desinmunización proteínas y diseño y desarrollo de vacunas.

Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos

El cribado de matrices de péptidos es un ensayo de alto rendimiento para identificar los sitios de interacción proteína-proteína. Esto permite mapear múltiples interacciones de una proteína diana y puede servir como método para identificar sitios para inhibidores que se dirigen a una proteína. Aquí describimos un protocolo para el cribado y análisis de matrices de péptidos.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Los métodos para mapear las interacciones proteína-ADN in vivo se están volviendo cruciales para todos los aspectos de la investigación genómica, pero son laboriosos, costosos y requieren mucho tiempo. Aquí se presenta un sistema robótico de manejo de líquidos disponible comercialmente que automatiza la inmunoprecipitación de cromatina para mapear las interacciones proteína-ADN in vivo con cantidades limitadas de células.

La automatización de experimentos-chip siguientes para generar perfiles epigenéticos en 10.000 células HeLa

Las matrices de péptidos sintetizadas por el método SPOT se pueden utilizar para analizar la especificidad del sustrato de las proteínas lisina metiltransferasas (PKMTs) y para definir el espectro de sustrato de las PKMT para comprender su papel biológico. Este protocolo describe cómo sintetizar matrices de péptidos, metilarlas con PKMT y analizar los resultados.

Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

Aquí, los autores presentan un protocolo simple y eficiente para definir un epítopo antigénico lineal utilizando un anticuerpo monoclonal purificado y escaneo de péptidos a través de hibridación dot-blot. El epítopo identificado puede utilizarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

Desajustes en las secuencias de leucocito humano antígeno (HLA) entre pares de receptores y donante de órganos son la causa principal de rechazo mediada por anticuerpos en el trasplante de órganos. Aquí presentamos el uso de matrices de antígeno personalizados basados en secuencias HLA de donantes individuales para sondear aloanticuerpos HLA de anti-donantes en receptores de órganos.

Personalizada péptido matrices para la detección de aloanticuerpos HLA en trasplante de órganos

Aquí, presentamos un protocolo para la purificación de complejos peptídicos MHC clase I y clase II a partir de líneas celulares de ratón y humanos que proporcionan datos inmunopeptidómicos de alta calidad. El protocolo se centra en la preparación de muestras utilizando anticuerpos disponibles comercialmente.

Inmunopeptidomics: Aislamiento de péptidos asociados a MHC de clase I y II de ratón y humano para el análisis de espectrometría de masas

Recientemente se han identificado variantes genéticas en el miembro humano de la familia Spindlin 4 (SPIN4) en pacientes con sobrecrecimiento óseo, un trastorno novedoso del desarrollo. Se presenta un protocolo y nuevos resultados que describen la identificación bioquímica de histonas modificadas en el contexto de nucleosomas como sustratos de unión a SPIN4.

Identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (SPIN4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas

Aprenda a diseñar y fabricar microarrays de péptidos para perfilar la especificidad de anticuerpos contra histonas y sus modificaciones postraduccionales. Este método mejora el control de calidad en investigación epigenética.

Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

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