Name: Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a aislar poblaciones de células germinales masculinas de mamíferos mediante disociación mecánica de tejido testicular y citometría de flujo con Hoechst. Este protocolo estandarizado facilita estudios comparativos de espermatogénesis.

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Los autores agradecen al hospital animal de la ladera (St. Louis, MO) para los testículos del perro; Jason Arand y el laboratorio del Dr. Ted Cicero en la Universidad de Washington en St. Louis (WashU) por proporcionar testículos de rata y Tabers Brianne para ayudar con la colección; Jared Hartsock y el Dr. Salt&#39;s Lab en WashU para los testículos de cobaya; Y el Dr. Michael Talcott en la División de Medicina Comparada en WashU para el testículo de cerdo en miniatura. Los autores también reconocen Alvin J. Siteman Cancer Center en la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington y Barnes-Jewish Hospital en St. Louis, MO, para el uso del Siteman Flow Cytometry Core, que proporcionó servicio de clasificación de células operado por el personal. El Siteman Cancer Center es apoyado en parte por el NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Esta investigación fue financiada por una beca de doctorado de la FCT [SFRH / BD / 51695/2011 a ACL], subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos [R01HD078641 y R01MH101810 a DFC] y un contrato de investigación de la FCT [IF / 01262/2014 a AML].

Todos los procedimientos descritos a continuación cumplieron con las regulaciones del Comité de Estudios Animales de la Universidad de Washington en St. Louis. 1. Preparaciones para el Protocolo de Disociación Mecánica <ol><li> Pre-humedezca un cartucho de desagregación desechable desechable de 50 μm para disociar un testículo murino completo. NOTA: Este cartucho de desagregación de tejido desechable contiene microcuchillas diseñadas para cortar tejidos y una malla de acero inmóvil con aproximadamente 100 orificios hexagonales. Se dispone de diferentes tamaños de malla para el cartucho de desagregación de tejidos para adaptar este protocolo basado en especies y tipos de células deseados. Se utilizaron cartuchos de 50 mu m para todas las especies de mamíferos mencionadas en este documento. <ol><li> Cargar 1 mL de rojo de fenol helado libre de agua libre de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sobre el cartucho de desagregación de tejido desechable de 50 μm. NOTA: El rojo de fenol puede interferir con la detección de fluorescencia rojaDurante la FACS. </li><li> Aspirar 1x DMEM del cartucho de desagregación de tejidos con una jeringa desechable de 3 ml sin aguja del orificio de la jeringa. </li></ol></li><li> Encienda el sistema de desagregación del tejido pulsando el botón &quot;ON&quot;. Este sistema no requiere tiempo de &quot;calentamiento&quot;. </li><li> Pre-humedezca tres filtros desechables de 40 μm con hielo 1x MEMD. Coloque cada filtro desechable de 40 μm en un tubo cónico de 50 ml. Pipetear 1 mL de 1x DMEM y dejar pasar el líquido. </li><li> Prepare una placa de Petri de 100 mm x 15 mm para la recolección de tejidos testiculares. Pipetear 500 μl de DMEM 1x en la placa de Petri. </li></ol> 2. Preparación de tejido testicular para el protocolo de disociación mecánica <ol><li> Disecar un ratón macho para eliminar con cuidado los testículos enteros frescos o fragmentos testiculares (si se trata de otras especies de mamíferos) con tijeras quirúrgicas y fórceps. NOTA: Asegúrese de que los tejidos estén libres de grasa y necrosis. Fr<html> Los tejidos testiculares generan una calidad superior de la suspensión de una sola célula que los tejidos congelados. <ol><li> Transferir los testículos / fragmentos recogidos a la placa de Petri preparada de 100 mm x 15 mm que contiene 500 μl de 1x DMEM. </li><li> Enjuague suavemente el tejido en 1x DMEM para eliminar los glóbulos rojos (si están presentes). </li></ol></li><li> Retire cuidadosamente la túnica albugínea. El espesor de la túnica albuginea variará en diferentes especies. <ol><li> Coge un extremo del testículo con fórceps. </li><li> Perfore el otro extremo del testículo con un bisturí mientras todavía sostiene el extremo del testículo con fórceps del paso anterior. </li><li> Raspe los túbulos testiculares usando un bisturí mientras todavía sostiene el extremo de un testículo con fórceps del Paso 2.2.1. </li></ol></li><li> Corte los túbulos testiculares en trozos de ~ 2-3 mm 3 usando un bisturí. </li></ol> 3. Obtención de suspensiones de células únicas por disociación mecánica de tejido testicular Los volúmenes de tejidos testiculares de ratones juveniles o no murinos deben ajustarse en consecuencia Los animales menores de edad pueden no contener todas las etapas de las células germinales Algunas especies de mamíferos tienen Los cambios en la composición del tejido testicular durante las estaciones de cría en comparación con la temporada de no apareamiento. <ol><li> Transferir las pequeñas piezas del túbulo testicular al cartucho de desagregación de tejido de 50 μm previamente humedecido usando una pinza y agregar 1 ml de DMEM 1x. </li><li> Cargue el cartucho de desagregación de tejidos en el sistema de desagregación de tejidos y procese durante 5 minutos girando el mando del modo de espera al modo de funcionamiento. </li><li> Retire el cartucho de desagregación de tejidos del sistema de desagregación de tejidos y aspire la suspensión celular con una jeringa desechable de 3 ml sin aguja del orificio de la jeringa. <ol><li> Aspire unas cuantas veces para retirar todo el líquido del cartucho de desagregación del tejido. NoTodos los 1 ml pueden recuperarse del cartucho de desagregación de tejidos. </li></ol></li><li> Pase la suspensión de células aspiradas a través de dos filtros de 40 μm desechables previamente humedecidos. Filtrar dos veces para eliminar cualquier agregado celular. <ol><li> Coloque un filtro de 40 μm previamente humedecido en un tubo cónico de 50 ml. Agregue directamente las células aspiradas en la jeringa al filtro de 40 μm. Pipetar la suspensión de una sola célula de paso con una pipeta desechable. </li><li> Retire el filtro de 40 μm usado previamente humedecido y coloque otro filtro de 40 μm previamente humedecido en el tubo cónico de 50 ml. Pipetear la suspensión de una sola célula recogida en el filtro limpio de 40 μm. </li><li> Recoja la suspensión de una sola célula filtrada con una pipeta desechable limpia. </li></ol></li><li> Pipetar la suspensión de células filtrada de nuevo al cartucho de desagregación de tejido de 50 μm y procesar durante otros 5 minutos en un sistema de desagregación de tejidos. </li><li> Recuperar todo el líquido de los tejidos disaggregatiEn el cartucho. </li></ol> 4. Tinción con Hoechst y yoduro de propidio (PI) <ol><li> Transferir la suspensión celular recuperada del cartucho de desagregación de tejidos de 50 μm a un tubo limpio de 1,5 ml. Se recuperarán aproximadamente 1-1,5 ml de suspensión de una sola célula. </li><li> Divida la suspensión de células únicas recuperada en cuatro tubos de 1,5 ml o 5 ml. <ol><li> Para los primeros tres tubos, pipetee 150 μl de suspensión de una sola célula y resto de suspensión de una sola célula de la pipeta en el último de los cuatro tubos (aproximadamente 550 μl de suspensión de una sola célula). NOTA: La cantidad de suspensión de una sola célula en el último tubo puede variar en función del rendimiento de la recuperación de la suspensión celular en el paso 3.6. </li></ol></li><li> Establezca el primer tubo de los cuatro tubos como control sin teñir para la sesión FACS. </li><li> Preparar suspensiones celulares teñidas con un solo color (PI o Hoechst) como controles. Añadir 2,5 μl de Hoechst o 1 μl de PI a cada tubo (segundo y thiRd). </li><li> Preparar un tubo doble manchado. Esto se usará para recolectar subpoblaciones de células germinales. Añadir 2,5 μL de Hoechst y 1 μL de PI al último tubo. NOTA: Hoechst tiene una vida útil de 2-3 meses. El uso de existencias más antiguas de colorante causará alteraciones significativas durante la sesión de FACS. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Coloque las muestras en un rotador de tubo o invierta los tubos de 1,5 ml cada 5-10 minutos. </li><li> Filtrar la suspensión celular con un filtro previamente humedecido de 40 μm y mantener la solución filtrada sobre hielo y en la oscuridad hasta la sesión FACS. NOTA: El paso de filtración es necesario para prevenir agrupaciones celulares para FACS. Adicionalmente, se puede usar el tratamiento con DNasa (ver Figura 1 ) o sal dipotásica de ácido 2 - naftol - 6,8 - disulfónico (NDA 20 ) para limitar el aglutinamiento celular. Períodos de espera prolongados afectarán a la señal fluorescente detectada durante FACS y pueden resultar en aumento de la muerte celular. </li&gt; </ol> 5. Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) Configuración y purificación de células testiculares <ol><li> Preparar los tubos de recogida FACS. <ol><li> Cubra 5 ml de tubos de polipropileno de fondo redondo o tubos de 1,5 ml con 400 μl de FBS para la recolección de células. Decantar el exceso de FBS después del revestimiento. </li><li> Añadir el medio de recogida FACS (1x DMEM + 10% de suero bovino fetal, FBS) a los tubos: 1 mL para tubos de 5 mL o 100μL para tubos de 1,5 mL. </li></ol></li><li> Establezca las condiciones de clasificación apropiadas en el clasificador de celdas y el software. NOTA: Se pueden utilizar otras máquinas de clasificación de celdas y software de análisis con las estrategias similares de configuración y control descritas a continuación. Las condiciones descritas aquí se adaptaron de Gaysinskaya y Bortvin 2 , Geisinger y Rodriguez-Casuriaga 3 , y Getun, et al. 4 <ol><li> Cargar un láser ultravioleta con 463/2Filtro de paso de banda de 5 nm para detectar el filtro Hoechst blue y 680 nm LP para detectar el rojo Hoechst y detectar PI. </li><li> Utilice un espejo dicroico 555DLP para distinguir la fluorescencia azul de la roja. </li><li> Utilice una boquilla de 70 μm y clasifique las células a una velocidad de 1000-2000 células / segundo. NOTA: La eficiencia de clasificación depende directamente del caudal. Los altos caudales (&gt; 3500 eventos / s) aumentan la velocidad de clasificación, pero resultan en la contaminación de las poblaciones. Véase la referencia 12 para más información. </li></ol></li><li> Establecer puertas utilizando muestras de control. <ol><li> Cargue y ejecute la muestra sin pigmentos. </li><li> Excluir restos celulares basados ​​en el patrón de diagrama FSC vs SSC. Los restos celulares aparecerán en el cuadrante inferior izquierdo de la parcela. Arbitrariamente establecer el umbral de residuos celulares por el usuario o el clasificador de células técnico. </li><li> Puerta en celdas individuales por umbral de ajuste para FSC y ancho de pulso. Diferentes clasificadores de células tienen diferentes maneras de distinguirGuts. Como el ancho de pulso refleja el tiempo que tardan las células en cruzar el láser, las células individuales tienen valores más bajos en comparación con los agregados multicelulares. El umbral de ajuste en un gráfico para FSC vs ancho de pulso se puede utilizar para seleccionar para singlets. </li><li> Ajuste las tensiones óptimas del tubo fotomultiplicador (PMT). </li><li> Utilizar tanto las células sin teñir como las de tinción única para establecer el umbral de la señal de fluorescencia PI o Hoechst. NOTA: Es importante optimizar los voltajes PTM basales para las células de interés a fin de establecer el intervalo de fluorescencia adecuado para cada colorante. Esto es crítico para la detección óptima de la señal y la sensibilidad. Las células de control manchadas y no teñidas se usan para establecer un intervalo de células teñidas negativamente y positivamente con tintes PI y / o Hoechst y minimizar el ruido en las señales. Para obtener más explicaciones sobre la optimización del voltaje PMT utilizando células de control, consulte Gaysinskaya y Bortvin 2 </li><li> Puerta en la célula vivaS basadas en la tinción PI (PI negativo) y FSC. Las células muertas serán positivas para la fluorescencia PI. </li><li> Establezca la puerta de contenido de ADN trazando un histograma del recuento de células basado en la fluorescencia azul de Hoechst. Deberían aparecer 3 picos con concentraciones crecientes de fluorescencia azul de Hoechst, que representan células haploides (1C), diploides (2C) y tetraploides (4C). Set 3 puertas, una para cada pico. </li><li> Observar por lo menos 500.000 eventos en FSC vs SSC parcela antes de proceder a gating en las poblaciones de células germinales. </li></ol></li><li> Puerta diferentes poblaciones de células germinales. <ol><li> Cargar la muestra manchada Hoechst / PI. </li><li> Establecer las primeras 3 puertas de los padres que son comunes a todas las poblaciones. <ol><li> Excluir restos celulares basados ​​en la gráfica FSC vs SSC. Seleccione singlets basados ​​en la trama FSC frente a ancho de pulso. Seleccionar células vivas por gating células PI negativo. </li></ol></li><li> Definir puerta de espermatogonias. </li><li> Plot PI células negativas basadas en fluorescencia Hoechst azul y rojoIntensidades. Las espermatogonias aparecen como una población lateral (ver Figura 1 ). </li><li> Definir las puertas para las poblaciones restantes de células germinales. NOTA: Consulte la figura 1 y la figura complementaria 2 para obtener detalles visuales. </li><li> Plot PI células negativas en la puerta de contenido de ADN. <ol><li> Para los espermátides portar el pico con menor fluorescencia Hoechst (1C). </li><li> Para los espermatocitos II, portar el pico con fluorescencia Hoechst intermedio (2C). </li><li> Para los espermatocitos I, se genera el pico con mayor fluorescencia de Hoechst (4C). </li></ol></li><li> Trazar la intensidad de fluorescencia azul y roja de Hoechst para refinar las poblaciones de espermatocitos y espermátidas de las puertas de contenido de ADN. </li></ol></li><li> Recoger las puertas de subpoblación seleccionadas en los tubos de recolección previamente preparados. Cada testículo tardará un promedio de 45 min a 1,5 h para recoger aproximadamente 0,5-6,0 x 10 6 células para cada subpoblación. NOTA: La exposición prolongada de células a Hoechst maY cambiar ligeramente la ubicación de las poblaciones con el tiempo. Actualiza la configuración después de 20-30 minutos de FACS. El rendimiento máximo para cada subpoblación dependerá de la eficiencia de la etapa de disociación. </li></ol> 6. Evaluación microscópica de células purificadas <ol><li> Las células recogidas por centrifugación a 500-600 xg a 4ºC durante 10 min. </li><li> Se vuelve a suspender el sedimento celular con 1 ml de solución de tampón de fosfato 1x 1x (PBS) enfriada con hielo o 1x DMEM. NOTA: El volumen de resuspensión puede ajustarse según el número de células seleccionadas y la concentración final deseada. </li><li> Pipetee 40 μl de células lavadas sobre un portaobjetos de vidrio limpio y coloque un cubreobjetos. </li><li> Fijar las células restantes con paraformaldehído al 4% (PFA) y almacenar las células fijas a 4 ° C en oscuridad para futuras referencias. <ol><li> Pipetear 100 μl de PFA al 4% directamente en los tubos de recogida. </li><li> Vórtice brevemente los tubos o pipetee pocas veces para asegurar una buena mezcla de la suspensión celular. </li></ol></li><li> Visualizar las diapositivas preparadas en un microscopio equipado con una lámpara UV para detectar la fluorescencia de Hoechst bajo un objetivo de 63X. Consulte la sección Resultados - Evaluación morfológica de poblaciones de células germinales clasificadas - para obtener más detalles sobre cómo identificar tipos específicos de células germinales. </li></ol>

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Todos los autores declaran que no hay intereses en competencia.

Teniendo en cuenta la dinámica de la cromatina altamente conservada durante la espermatogénesis en los mamíferos, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo para aislar las células germinales masculinas en distintas etapas de diferenciación de diferentes tejidos testiculares de mamíferos ( Figura 1 ). Uno de los principales obstáculos en la aplicación de un único flujo de trabajo a diferentes modelos animales es la necesidad de ajustes específicos de la especie, especialmente ...

Dada la ausencia de un sistema in vitro representativo de la progresión de la espermatogénesis y la presencia de gran heterogeneidad celular en los testículos, los estudios de la biología de células germinales masculinas requieren técnicas robustas para aislar poblaciones enriquecidas de tipos celulares específicos. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) ha sido ampliamente utilizada para este propósito 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , ya que proporciona alto rendimiento y pureza y supera otros métodos de aislamiento en el número de tipos de células germinales que puede identificar y Seleccione 6 , 7 , 8 . El principio del análisis de citometría de flujo se basa en la detección de patrones de luz diferenciales después de la excitación por haz láser de células individuales. Como una célula pasa a través del láser que refleja / dispersa la luzEn todos los ángulos, proporcional al tamaño de la célula (dispersión hacia delante, FSC) ya la complejidad intracelular (dispersión lateral, SSC). Ver Ormerod 9 para información detallada sobre citometría de flujo. Las células germinales masculinas experimentan modificaciones específicas en el contenido de ADN, estructura de la cromatina, tamaño y forma a lo largo de diferentes etapas de la espermatogénesis. Por lo tanto, distintas poblaciones de células pueden ser identificados y separados por la combinación de la dispersión de la luz y la tinción del ADN con colorantes fluorescentes [ 10 , 11] . Para este propósito se pueden utilizar varios tintes (revisado en Geisinger y Rodriguez-Casuriaga 3 ), como Hoechst-33342 (Hoechst), que se ha utilizado con frecuencia en el análisis de citometría de flujo de células testiculares durante la última década 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN con luz UV, Hoechst emite fluorescencia azul proporcional al contenido de ADN celular, mientras que la fluorescencia de color rojo refleja la variabilidad en la estructura de la cromatina y la compactación [ 1 , 13 , 14] . Como resultado, las células germinales masculinas en diferentes etapas de diferenciación exhiben patrones específicos durante FACS de suspensiones de células individuales teñidas con Hoechst (Ho-FACS; 1 , 12 ). Curiosamente, debido a un mecanismo de eflujo de colorante que sólo es activo durante la etapa espermatogonal, la intensidad de fluorescencia azul Hoechst no es proporcional al contenido de cromatina en estas células, y se agrupan como una población lateral durante Ho-FACS [ 15] . Además, al combinar la tinción Hoechst con el yoduro de propidio (PI) no permeante, los usuarios pueden discriminar las células vivas (PI negativas) de las células muertas (PI positivas) durante FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Esta estrategia se ha utilizado previamente en citometría de flujo análisis de las células germinales testiculares y optimizado extensivamente en el ratón para discriminar hasta 9 tipos de células germinales, incluyendo las células en 4 diferentes etapas de meiosis I 1, 2, 4, 16. Para los fines de este trabajo, la tinción Hoechst tiene tres ventajas principales. En primer lugar, Ho-FACS se ha aplicado con éxito al aislamiento de células germinales masculinas en el ratón modelo 1 , 2 , 12 , y otros roedores, tales como rata y cobaya 17 , 18 , 19 . En segundo lugar, Hoechst es un colorante permeante a las células y no requiere permeabilización de la membrana, por lo que preservarLa integridad celular. Por último, no se requiere ningún tratamiento con RNasa ya que Hoechst se une preferentemente a las secuencias de ADN poli (d [AT]) 1 , 20 , lo que significa que el ARN se conserva y, además del ADN y las proteínas, puede usarse para estudios moleculares posteriores del germen diferenciación celular. A pesar de la similitud en la ploidía del ADN y / o la capacidad de tinción observada en los análisis de citometría de flujo de especies de mamíferos (revisado en Geisinger y Rodriguez-Casuriaga 3 ), ha habido una gran variabilidad en los protocolos descritos para el aislamiento de células germinales masculinas por citometría de flujo. Diferentes estudios han empleado protocolos específicos para la disociación de tejidos, y se utilizaron distintos colorantes de unión a ADN (solo o en combinación) y FACS en diferentes organismos modelo, principalmente el ratón, la rata y el cobayo. Por lo tanto, la comparación directa de los datos recogidos para diferentes especies puede verse afectada por elLos artefactos técnicos resultantes de la variabilidad entre metodologías. Es importante destacar que la sorprendente conservación de la dinámica de la cromatina a lo largo de la espermatogénesis de los mamíferos (2N-4N-2N-1N) sugiere que un protocolo estandarizado podría aplicarse transversalmente a una variedad de especies de mamíferos. El objetivo de este estudio fue desarrollar un único flujo de trabajo que sea aplicable a diferentes especies de mamíferos, combinando y adaptando técnicas previamente publicadas 2 , 20 . La normalización de un método para el procesamiento de tejidos se logró mediante la disociación mecánica para superar la necesidad de ajustes específicos de la especie necesaria para la digestión enzimática [ 5] . Es de destacar que la disociación mecánica del tejido testicular de roedor se ha demostrado que tiene un mejor comportamiento que la digestión enzimática del tejido 20 y Ho-FACS de suspensiones de células individuales generadas por ambos métodos expResultados comparables 5 . Como prueba de principio, este protocolo describe los parámetros utilizados para aislar hasta 5 poblaciones de células germinales: la espermatogonía (SPG); Primaria (SPC I) y espermatocitos secundarios (SPC II), y espermátides (SPD) - ronda (rSPD) y alargamiento (eSPD). Es importante destacar que es fácil de implementar en el laboratorio, siendo los principales requisitos el sistema para la disociación de tejidos y el acceso a un clasificador de células equipado con un láser UV. Este flujo de trabajo ( Figura 1 ) es rápido y directo y permite el aislamiento simultáneo de 4 poblaciones de células germinales de tejido testicular fresco en menos de 2 h. El tiempo de procesamiento reducido es crucial para mantener la integridad celular para procedimientos posteriores. Además, su exitoso rendimiento en 5 especies diferentes sugiere que podría aplicarse ampliamente en el clado de mamíferos, lo que lo convierte en el método ideal para aislar las células germinales para estudios comparativos de mamíferos biológicos reproductivos masculinosCión. Este protocolo se compone de tres secciones principales, aparte de los pasos preparatorios: (1) la disociación mecánica del tejido testicular y (2) tinción de células testiculares con Hoechst y PI, seguido de (3) clasificación FACS de células espermatogénicas relevantes. Una vez recogidas, estas poblaciones enriquecidas de diferentes células germinales testiculares de mamíferos pueden usarse para una amplia gama de aplicaciones. Este protocolo describe un método de disociación &quot;de tamaño único&quot; para purificar las células germinales masculinas de muchas especies diferentes de mamíferos. Dependiendo del tipo de estudio que los usuarios deseen realizar con las células germinales aisladas, pueden utilizarse otros medios o tampones. Los siguientes pasos del protocolo son para generar suspensiones de células únicas de un testículo entero de murino.

<table><tbody><tr><td>4% paraformaldehído</td><td>VWR</td><td>#15710</td><td>4% PFA, Para la fijación de células clasificadas</td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>BD Biosciences</td><td>#340588;</td><td>Sistema para la disociación de los testículos</td></tr><tr><td>1X Dulbecco modificado Eagle medium</td><td>Life Technologies</td><td>#31053</td><td>DMEM, para la disociación de testículos</td></tr><tr><td>Medicon</td><td>BD Biosciences</td><td>#340591</td><td>Cartucho de desagregación para la disociación de testículos</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>#10082139</td><td>FBS, para la colección FACS Hoechst</td></tr><tr><td>33342</td><td>Invitrogen</td><td>#H3570</td><td>Hoecsht, para la tinción FACS</td></tr><tr><td>40 y micro; filtro de células m</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>#89508-342</td><td>Para disociación de testículos</td></tr><tr><td>100x 15 mm placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>#351029</td><td>Para disección de testículos</td></tr><tr><td>5 mL tubos de polipropileno de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>#352063</td><td>Para la colección FACS</td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos Eppendorf</td><td>VWR</td><td>#20170-650</td><td>Para la colección FACS</td></tr><tr><td>Jeringa innecesaria de 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>#309657</td><td>Para la disociación de los testículos</td></tr><tr><td>50 mL tubo cónico</td><td>MIDSCI</td><td></td>#C50R <td>Para la disociación de los testículos&nbsp;</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Invitrogen</td><td>#L7011</td><td>PI, para tinción FACS</td></tr><tr><td>Clasificador de células MoFlo Legacy</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>para FACS</td></tr><tr><td>Summit Software de clasificación de células</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>para FACS</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Thermo Scientific</td><td>#AM9625</td><td>PBS, para microscopía</td></tr><tr><td>Portaobjetos microscópicos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-544-4</td><td>Para microscopía</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-548-87</td><td>Para microscopía</td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia desechable (3 mL)</td><td>Samco Scientific</td><td>#225</td><td>Para la disociación de testículos</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Roche</td><td>#10104159001</td><td>Para la disociación de testículos</td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica de acero al carbono</td><td>Miltex</td><td>#4-111</td><td>Para disección de testículos</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen</td><td>#C10227</td><td>Para el recuento automático de células</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripán (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>#T8154</td><td>Para la tinción de viabilidad</td></tr></tbody></table>

un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) ha sido uno de los métodos de elección para aislar las poblaciones enriquecidas de células germinales testiculares de mamíferos. Actualmente, permite la discriminación de hasta 9 poblaciones de células germinales murinas con alto rendimiento y pureza. Esta alta resolución en la discriminación y purificación es posible debido a cambios únicos en la estructura de la cromatina y la cantidad a lo largo de la espermatogénesis. Estos patrones pueden ser capturados por citometría de flujo de células germinales masculinas teñidas con colorantes fluorescentes de unión a ADN tales como Hoechst-33342 (Hoechst). En este documento se describe detalladamente un protocolo recientemente desarrollado para aislar células germinales testiculares de mamíferos. En pocas palabras, las suspensiones de células individuales se generan a partir de tejido testicular por disociación mecánica, se tiñen doblemente con Hoechst y yoduro de propidio (PI) y se procesan mediante citometría de flujo. Una estrategia de gating serie, incluida la selección de células vivas (PI negativo) con diferentes contenidos de ADN (Hoechst intensidad), iS utilizados durante la clasificación FACS para discriminar hasta 5 tipos de células germinales. Estos incluyen, con las correspondientes purezas medias (determinadas por la evaluación microscópica): espermatogonias (66%), espermatocitos primarios (71%) y secundarios (85%) y espermátides (90%), (87%) subpoblaciones. La ejecución de todo el flujo de trabajo es sencilla, permite el aislamiento de 4 tipos de células simultáneamente con la máquina FACS apropiada y se puede realizar en menos de 2 h. A medida que el tiempo de procesamiento es crucial para preservar la fisiología de las células ex vivo , este método es ideal para estudios de alto rendimiento a la baja de la biología de células germinales masculinas. Además, un protocolo estandarizado para la purificación multiespecies de células germinales de mamíferos elimina fuentes metodológicas de variables y permite un único conjunto de reactivos para diferentes modelos animales.

Suspensiones de una sola célula por disociación mecánica de tejido testicular La Figura 2 compara suspensiones de células individuales obtenidas por disociación mecánica de tejido testicular de ratón bajo diferentes condiciones. Las muestras obtenidas mediante el procesamiento de tejido fresco, sin teñir ( Figura 2A ) o teñidas con Hoechst ( Figura 2...

Este trabajo describe la estandarización de un método para obtener poblaciones de células germinales purificadas de tejido testicular de diferentes especies de mamíferos. Es un protocolo directo que combina la disociación mecánica de los testículos, la tinción con Hoechst-33342 y el yoduro de propidio, y la clasificación FACS, con amplias aplicaciones en estudios comparativos de la biología reproductiva masculina.

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

El objetivo general de este procedimiento estandarizado es aislar tipos distintos de células germinales masculinas de diferentes especies de mamíferos utilizando un solo protocolo. Este método puede facilitar el estudio molecular de la espermatogénesis mediante el análisis de alto rendimiento de diferentes tipos de células germinales. La principal ventaja de esta técnica es que un único conjunto de reactivos puede aplicarse a diversas especies de mamíferos para el aislamiento simultáneo de cuatro poblaciones diferentes de células germinales masculinas.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando decidimos investigar la evolución de patrones específicos de regulación de la expresión génica en diferentes mamíferos. Chris Holley, un tecnólogo médico del Núcleo de Citometría de Flujo Siteman, demostrará cómo operar el clasificador de células y establecer las compuertas. Comience por desencapsular un único testículo murino y corte el tejido en trozos pequeños.Luego, use pinzas para transferir pequeños fragmentos de tejido a un cartucho de desagregación de tejidos de 50 micrómetros previamente humedecido. Añada un mililitro de medio DMEM al cartucho y coloque el cartucho de desagregación de tejidos en el sistema de desagregación de tejidos. Gire el botón de espera a funcionamiento y procese el tejido durante cinco minutos.Luego retire el cartucho y utilice una jeringa desechable de tres mililitros para aspirar la suspensión celular a través del puerto de la jeringa. Cuando se haya recuperado todo el líquido, filtre las células a través de dos filtros individuales, desechables y previamente humedecidos de 40 micrómetros para eliminar cualquier agregado celular, y devuelva la suspensión al cartucho de desagregación. A continuación, procese las células durante otros cinco minutos.Para teñir las células para la clasificación de células activadas por fluorescencia, recolecte la suspensión celular disociada en un tubo de 1,5 mililitros. Luego transfiera 150 microlitros de células a cada uno de tres nuevos tubos de 1,5 mililitros, agregando el volumen restante a un cuarto tubo de 1,5 mililitros. Dejando el primer tubo como control sin teñir, agregue 2,5 microlitros de Hoechst al segundo tubo, un microlitro de yoduro de propidio al tercer tubo, y tanto Hoechst como yoduro de propidio al cuarto tubo.Después de 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con rotación suave, filtre las suspensiones celulares a través de filtros individuales de 40 micrones previamente humedecidos hacia tubos redondos de fondo de cinco mililitros. A continuación, coloque cuatro tubos de recolección que contengan DMEM suplementado con FBS debajo de las boquillas de clasificación del citómetro de flujo, y cargue el tubo control sin tinción para análisis. Utilice un gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral para excluir los restos celulares, y ajuste el umbral de dispersión directa y el ancho de pulso para permitir el aislamiento de las células individuales.Una selección rigurosa es crucial para optimizar la calidad de la muestra recolectada. Asegúrese de seleccionar células individuales excluyendo los restos celulares y los agregados multicelulares. Utilice las células teñidas individualmente para establecer el umbral de intensidad de fluorescencia de Hoechst y yoduro de propidio en relación con la muestra sin tinción.Luego cargue la muestra experimental doblemente marcada y configure las tres compuertas principales tal como se acaba de demostrar. Una vez establecidas las tres compuertas principales, seleccione las células viables según su ausencia de tinción con yoduro de propidio y determine el contenido de ADN trazando un histograma de recuentos celulares basado en la fluorescencia azul de Hoechst. Establezca una compuerta para cada uno de los tres picos de concentración creciente de fluorescencia azul de Hoechst, que representan las células haploides, diploides y tetraploides, y observe al menos 500.000 eventos en el gráfico de dispersión hacia adelante versus dispersión lateral.Represente gráficamente las células negativas para yoduro de propidio según sus intensidades de fluorescencia azul y roja de Hoechst. Los espermatogonios aparecerán como una población lateral. La intensidad de fluorescencia azul de Hoechst se correlaciona con el contenido de ADN.Por lo tanto, establecer esta compuerta antes de generar los gráficos de Hoechst azul y rojo asegura la selección de las células con la ploidía deseada. Para el aislamiento de espermátidas, delimite el pico haploide y seleccione la población que aparece al graficar la fluorescencia azul y roja de Hoechst. Para el aislamiento de espermatocitos II, delimite el pico diploide y seleccione la población que aparece al graficar la fluorescencia azul y roja de Hoechst.Para el aislamiento de espermatocitos I, seleccione el pico tetraploide y elija la población que aparece cuando se grafican la fluorescencia azul y roja de Hoechst. Luego, separe las subpoblaciones seleccionadas en tubos de recolección individuales para recoger aproximadamente de 0,5 a seis veces 10 a la seis células para cada subconjunto celular. Las suspensiones celulares obtenidas mediante disociación mecánica de tejido fresco, sin teñir o teñidas con Hoechst, muestran la presencia de células individuales en diversas etapas de diferenciación.Es importante destacar que las estructuras celulares parecen estar preservadas, incluyendo las flagelos de los espermatozoides. Después de la exclusión de los restos celulares, el 95 a 98% de las células son células individuales, de las cuales el 86 a 93% están vivas. La representación gráfica de la función de la fluorescencia azul roja de Hoechst durante la citometría de flujo facilita la identificación de poblaciones específicas de células germinales testiculares.Como era de esperar, la población de espermátidas haploides es la más abundante, seguida por las células espermaticas II diploides y los espermatocitos primarios tetraploides, un patrón que se conserva entre especies. El análisis microscópico de las células ordenadas revela que los espermatogonios presentan heterocromatina pericéntrica distintiva, pequeña y redonda, que tiñe intensamente con Hoechst. Los espermatocitos son células más grandes y granulares con núcleos fácilmente identificables que exhiben variaciones de cromatina características de células meióticas en la subpoblación de espermatocito I, y núcleos nucleados o diacéntricos en las subpoblaciones de espermatocito II.Los espermátidos son pequeñas células haploides de forma redonda u ovalada que pueden distinguirse de los espermatogonios por la presencia de cromocentros localizados. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la Hoechst es altamente sensible y genotóxica, y que la resolución de las poblaciones celulares puede mejorarse mediante períodos de incubación más largos según sea necesario.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos ómicos de alto rendimiento para responder preguntas sobre modificaciones epigenéticas o la abundancia y diversidad de transcritos y proteínas dentro de especies de mamíferos en un contexto evolutivo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología reproductiva masculina exploraran los mecanismos reguladores que impulsan la progresión de la espermatogénesis en varias especies de mamíferos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar muestras testiculares para FACS con Hoechst y de cómo identificar y aislar diferentes tipos de células germinales masculinas según su señal de Hoechst.Los colorantes que se unen al ADN, como Hoechst y el yoduro de propidio, pueden ser extremadamente peligrosos. Use siempre equipo de protección personal al manipular estos reactivos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

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Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

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