Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

El objetivo general de este procedimiento es obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de músculo esquelético adulto. Estas células se utilizan para estudios funcionales, como la evaluación de la diferenciación miogénica y la medición de la entrada de calcio operada por el almacén. La principal ventaja de esta técnica es que permite un aislamiento rápido, sencillo y reproducible de mioblastos primarios humanos.

Estos mioblastos son los nuevos ex-vivo para estudiar la señalización del calcio durante la regeneración muscular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo muscular, como la identificación de los canales iónicos y los factores de transcripción involucrados durante la diferenciación muscular. Este método puede proporcionar información sobre las funciones de los genes durante la diferenciación miogénica humana.

También se puede aplicar a otros estudios, como el potencial del uso de células madre miogénicas para tratar las distrofias musculares. Transfiera la muestra de músculo a una placa estéril de seis centímetros, lave la muestra con PBS dos veces. Retire cualquier resto de tejido adiposo y pese la muestra.

A continuación, agregue tripsina y pique el músculo en trozos de menos de dos milímetros de tamaño. Una vez picado, use una pipeta de 10 mililitros para transferir el tejido a una botella de disociación de 200 mililitros que contenga una barra agitadora, luego continúe recolectando tejido picado en solución de tripsina hasta que la botella de disociación se llene a 90 mililitros. Ahora, incuba el tejido en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 60 minutos con una agitación suave.

Después de una hora, agregue 10 mililitros de FCS para detener la reacción y homogeneizar la mezcla mediante trituración. Ahora, cargue filtros de 70 micras en dos tubos de 50 mililitros y pase la mitad de la suspensión celular a través de cada filtro pipeteando la suspensión en los filtros. A continuación, haga una suspensión de las células en el medio de crecimiento y coloque 200.000 células en placas de seis centímetros con cuatro mililitros de medio.

Incubar las placas, cambiando el medio cada tres días. Después de cinco a siete días, las células deben estar confluentes en un 70% a un 80%, luego teñirlas. Para comenzar, enjuague la placa de células confluentes con PBS.

A continuación, añade un mililitro de solución de tripsina y deja que la enzima actúe durante tres minutos. Detenga la reacción agregando dos mililitros de medio y recoja las células en un tubo de 15 mililitros. Luego, gire las células hacia abajo y vuelva a suspenderlas en un mililitro de medio.

A continuación, tome un recuento de células mientras almacena las células en hielo. Para el análisis de los hechos, cargue siete tubos con 100.000 celdas cada uno. Cargue las celdas restantes en un octavo tubo para clasificarlas.

Lave las células con un mililitro de tampón de fax frío, luego centrifugue los tubos y aspire y deseche el sobrenadante. Vuelva a añadir 200 microlitros de tampón fax con los anticuerpos adecuados y deje que las células se incuben en hielo durante 30 minutos. Después de 30 minutos, vuelva a lavar las celdas y vuelva a suspenderlas en 500 microlitros de tampón de fax, luego clasifique las celdas con un citómetro de flujo.

Después de excluir las células hematopoyéticas CD45 positivas, separe las células CD45 negativas en función de la expresión de CD56. A continuación, diríjase a la población CD56 positiva para CD34, CD144 y CD146. Vuelva a analizar una fracción de la población clasificada, para comprobar la pureza.

Ahora, extraiga los mioblastos humanos y lávelos con cinco mililitros de medio. Luego vuelva a suspenderlos en un mililitro de medio. Transfiera la suspensión a una placa de seis centímetros con cuatro mililitros de medio e incube la placa a 37 grados centígrados con 7% de dióxido de carbono.

Para este procedimiento, se cultivan mioblastos y se fabrica un medio de transvección fresco. Incube el medio a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Durante la incubación del medio, prepare los mioblastos.

Primero, enjuáguelos una vez con PBS. A continuación, tripsinizar las células adherentes. Detenga la reacción agregando dos mililitros de medio.

Luego, recoja las células en un tubo de 50 mililitros. Gíralos y vuelve a suspenderlos en un mililitro de medio. Para cada transvección, prepare 500.000 células en 200 microlitros de medio.

A cada 500 microlitros de medio de transvección, agregue una alícuota de 200 microlitros de celdas y luego mezcle usando solo dos golpes de la pistola de pipetas. Luego, deje que las reacciones continúen durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, transfiera las reacciones a placas de cultivo de 3,5 centímetros, cada una de las cuales contiene un cubreobjetos de vidrio.

A continuación, agregue 1,3 mililitros de medio para obtener un volumen final de dos mililitros e incube los platos. Después de 48 horas de diferenciación, las células se pueden inmunoteñir o analizar mediante imágenes de calcio. Para cualquiera de las dos opciones, primero lave cuidadosamente las celdas dos veces usando un mililitro de PBS a temperatura ambiente para lavar.

Trate de evitar desprender los miotubos. Para obtener una imagen de calcio, cubra las células lavadas con dos fura-2 AM micromolares más un ácido treónico micromolar en un medio que contenga calcio. Luego, déjalos incubar durante unos 30 minutos antes de mezclar.

A continuación, lave las células dos veces con un medio que contenga calcio no modificado y luego incube durante 10 a 15 minutos para la esterificación. Ahora, retire el cubreobjetos de una placa de cultivo e instálelo en la cámara experimental. Cargue la cámara con medio que contenga calcio, colóquela bajo un microscopio y luego inicie el registro de datos.

Fura-2 se excita alternativamente a 340 y 380 nanómetros. La luz de emisión se recoge a 510 nanómetros. Bucear en las imágenes de 340 nanómetros nanométricos por las imágenes de 380, proporciona las proporciones de imagen ya que las fluctuaciones y la concentración de calcio son relativamente bajas, adquieren una relación de imagen cada dos segundos.

Después de dos o tres minutos, reemplace el medio con medio libre de calcio. Luego, durante uno o dos minutos, monitoree la actividad del calcio operado almacenado en las células. A continuación, agregue un micromolar de thapsigargin a las células para agotar sus reservas internas de calcio.

Espere de ocho a 10 minutos, luego, reemplace rápidamente el medio con el medio que contiene calcio y registre durante cinco minutos mientras el calcio ingresa a las células a través de los canales sucesivos. Después de finalizar el experimento, analice las imágenes. Seleccione un área donde no haya células para la región uno, que define el fondo, luego, seleccione un área en el citoplasma para la región dos.

Las dos regiones se pueden dibujar en cualquiera de las imágenes de la serie. A continuación, vaya a la pestaña ejecutar experimentos y seleccione imágenes de referencia para los canales 340 y 380, seleccione la región uno y luego haga clic en restar fondo. Ahora, ejecute todo el experimento para eliminar el fondo de todas las imágenes.

Una vez completado, haga clic en la opción de registro de datos para abrir una hoja de cálculo en la que se registran los datos de tiempo y proporción. Las células musculares se cultivaron, se expandieron y se clasificaron por fax. Los mioblastos representaron más del 60% de la población analizada.

A continuación, los mioblastos humanos primarios se cultivaron en un medio de diferenciación y se inmunoteñieron para el factor de transcripción de las proteínas de cadena pesada MEF2 y miosina. La mayoría de las células expresaron la cadena pesada de miosina y formaron miotubos con valores de índice de fusión de alrededor del 60%, el otro 40% de las células permanecieron como células mononucleadas indiferenciadas, también conocidas como células de reserva. El experimento de entrada de calcio operado por almacén descrito se realizó con éxito en las células diferenciadas.

La realización del mismo experimento en células transvectadas con ARN interferente pequeño, dirigido contra canales permeables al calcio de la familia TRPC, muestra que la caída tuvo un impacto medible en la entrada de calcio operada por la tienda. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar los mioblastos humanos del músculo esquelético adulto. Utilizamos estas células para estudiar las etapas sucesivas de la diferenciación muscular y, en particular, la desactivación de los factores de transcripción y los canales de calcio.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de tres horas si se realiza correctamente. Es un método rápido, sencillo y reproducible que obtiene el rendimiento de mioblastos humanos. Al intentar este procedimiento, es importante evitar que los cultivos de mioblastos alcancen la plena confianza, ya que habrá una diferenciación espontánea no deseada.