Name: Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a aislar mioblastos humanos de músculo esquelético adulto para evaluar la diferenciación miogénica y medir la entrada de calcio almacenada. Este método rápido y reproducible permite estudiar la señalización de calcio durante la regeneración muscular.

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subsidio número 310030-166313), la Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires, la Fondation Marcel Levaillant y la Fondation pour la recherche ostéo-articulaire.

Las muestras de músculo humano (tejidos obtenidos de músculos semitendinosos) se recogieron durante la cirugía ortopédica en pacientes sanos como residuos quirúrgicos. Todos los métodos relacionados con el estudio en seres humanos se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos de las Autoridades Sanitarias Reguladoras suizas y aprobados por la Comisión Cantonal de Ética de la Investigación de las Autoridades Cantonales de Ginebra, Suiza (protocolo CER n ° 12-259) . Se obtuvieron consentimientos informados y escritos de todos los sujetos adultos involucrados en el estudio. 1. Aislamiento de los mioblastos del músculo esquelético humano <ol><li> Durante todos los procedimientos, mantenga condiciones estériles trabajando bajo una capa de cultivo de tejidos de nivel II y usando medio estéril y tampones estériles. Nota: Este procedimiento se puede aplicar a muchos músculos esqueléticos humanos. </li></ol> 2. Protocolo de disociación <ol><li> Transferir muestras de músculo (2 - 3 g) en un estéril de 6 cmplato. </li><li> Lavar las muestras musculares con 5 - 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Repetir el lavado. </li><li> Retire los tejidos conectivos y adiposos usando tijeras curvas y una abrazadera. </li><li> Pesar la muestra muscular (ver paso 2.13) y transferirla a una nueva placa estéril de 6 cm. </li><li> Añadir 5 ml de tripsina-EDTA al 0,05%. </li><li> Usando tijeras, cortar y picar el tejido muscular en pedazos pequeños (menos de 2 mm). </li><li> Usando una pipeta serológica de 10 ml, transfiera el músculo picado a una botella de disociación de 200 ml que contiene una barra magnética. Repita este paso hasta que 90 mL de tripsina-EDTA al 0,05% se hayan transferido con todos los músculos picados a la caja de disociación. Cerrar la botella de disociación e incubar a 37 ° C durante 60 minutos bajo agitación suave. </li><li> Retire la botella de disociación del baño de calentamiento y detenga la reacción enzimática añadiendo 10 ml de suero fetal de ternera (FCS, 10% de volumen final) a la botella de disociación. Homogeneizar la mezcla con una pipeta. </li><li> DeberesSon dos tubos de 50 ml con un filtro de células de 70 μm en cada uno. Pase la mitad de la suspensión de células a través del filtro de células en cada tubo pipeteando hacia arriba y hacia abajo sobre el filtro hasta que pase la suspensión. </li><li> Centrifugar los tubos a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células con 10 ml de medio de crecimiento (GM, Tabla 1 ) y pasar las células a través de un tamiz de células de 40 μm colocado en un tubo de 50 ml. Centrifugar el tubo a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células con 10 ml de GM y centrifugar el tubo a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células con 1 mL de GM y contar las células utilizando una cámara de Neubauer. Nota: Por lo general, se debe cosechar un rendimiento de 3 x 10 5 células por g de músculo. El rendimiento se calcula dividiendo el número de células por el peso del músculo biopSy (paso 2.4). </li><li> Ponga 2 x 10 5 células en una placa de 6 cm estéril que contiene 4 ml de GM y se incuba a 37 ° C y 7% de CO2. Prepare tantas placas como sea necesario. </li><li> Cambie el GM después de 3 días. Nota: Las células recién disociadas necesitan tiempo para adherirse a la placa de cultivo. Además, el primer tiempo de duplicación de células miogénicas es de alrededor de 50 - 60 h. Después de la primera división, el tiempo de duplicación es alrededor de 20 h. </li><li> Después de 5 - 7 días, cuando las células alcanzan una confluencia del 70-80% (alrededor de 1,5 x 10 6 células / por placa de 6 cm), comienzan la tinción de anticuerpos y la clasificación celular (paso 3). </li></ol> 3. Tinción de anticuerpos y clasificación de células <ol><li> Después de enjuagar una vez con PBS, incubar las células adherentes (en la placa de 6 cm) con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 3 min (o incubar a 5% de CO 2 ). Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de GM y recoger las células en 15 ml de tubo. Después de la centrifugación (200 xg durante 5 min), resUspend las células en 1 ml de GM. </li><li> Cuente las células usando una cámara Neubauer. </li><li> Realice los siguientes procedimientos en hielo. Nota: El procedimiento para establecer la compensación de fluorescencia correcta en el citómetro es esencial y debe ser similar en cualquier citómetro. Los tubos 1 y 2 se usan como controles negativos. Los tubos 3 - 7 se usan para establecer la compensación en el citómetro durante el primer experimento ( Tabla 2 ). La concentración final utilizada para cada anticuerpo y su isotipo correspondiente debe ser la misma (alrededor de 1 μg / 10 6 células). </li><li> Despacho 1 x 10 5 células por tubo (tubo de 5 ml) para los tubos 1 - 7 ( Tabla 2 ). Coloque la suspensión celular restante en el tubo 8 para la clasificación celular. </li><li> Lavar las células con 1 ml de tampón FACS frío (PBS-5% FCS). Cerrar y centrifugar los tubos a 200 xg y 4 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 200 μl de tampón FACS por tubo. Añadir anticuerpos alDe acuerdo con la Tabla 2 . Incubar en hielo durante 30 min. </li><li> Lavar las células: añadir 1 mL del tampón FACS a cada tubo. Cerrar y centrifugar los tubos a 200 xg y 4 ° C durante 5 min. Aspirar y desechar el sobrenadante. Repita este paso una vez más. </li><li> Resuspender las células en 500 μ l de FACS buffer. Cerrar los tubos y mantenerlos en hielo hasta la clasificación celular. Prepare 4 tubos de 1,5 ml, cada uno de los cuales contiene 500 μl de GM, que es necesario para recoger las células durante la clasificación celular. Mantenerlos en hielo. </li><li> Clasificar los mioblastos humanos por citometría de flujo ( Figura 1 ). Después de excluir células hematopoyéticas positivas para CD45, separar células CD45-negativas basadas en la expresión de CD56. A continuación, se muestra la población CD56-positiva para CD34, CD144 y CD146 (los mioblastos humanos se definen como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-). Realizar una pequeña fracción de la población de células clasificadas para verificar la pureza. </li><li> Piscina de los tubos que contienen myobla humanosPts en un tubo de 15 mL y lavar una vez añadiendo 5 mL de GM. Centrifugar el tubo a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de GM y placa de las células en una placa no revestida de 6 cm que contiene 4 ml de GM (2 x 10 5 células por placa). Incubar a 37 ° C y 7% de CO 2 . </li></ol> 4. Mantenimiento celular <ol><li> Cambiar la mitad del medio de cultivo cada 2 días. Quitar 2 ml de GM de edad de la placa de cultivo y agregar 2 ml de GM. Nota: Los mioblastos producen factores de crecimiento que son beneficiosos para las condiciones de cultivo. </li><li> Trypsinize las células cuando alcanzan 70 - 80% confluencia para evitar la pre-diferenciación. Después de enjuagar una vez con PBS, incubar las células adherentes (en la placa de 6 cm) con 1 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 3 min. Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de GM y recoger las células en un tubo de 15 ml. Después de la centrifugación (200 xg durante 5 min), resusLas células en 1 ml de GM. </li><li> Contar las células y preparar placas de 6 cm con 2 x 10 5 células por placa en 4 ml de GM. </li><li> Mantener los mioblastos humanos hasta 6 pases o congelarlos en GM que contenga DMSO al 10%, 1 x 106 células por ml. Congele las células en una caja de congelación progresiva (1 ° C / min); Para almacenamiento a largo plazo, coloque las células en nitrógeno líquido. </li></ol> 5. Transfección de Myoblastos Humanos con siRNA Nota: Los mioblastos se transfectan usando reactivo de transfección comercial dos días antes de la inducción de la diferenciación. El efecto de ARNsi específico contra un gen siempre se compara con el efecto de un ARNsi de control. Los ARNsi son ARN bicatenarios que deben mantenerse en hielo y manipulados con guantes. <ol><li> Obtener una monocapa confluente de 70 - 80% de mioblastos humanos en una placa de 6 cm (alrededor de 1,5 x 106 células). Nota: 5 x 10 5 células por transfección se necesitan para obtener una estafaMonocapa fluida de mioblastos transfectados después de 2 días en GM. </li><li> Prepare los cubreobjetos de vidrio (descritos para la imagen de calcio en el paso 7). </li><li> GM caliente, tripsina-EDTA al 0,05% y PBS a 37ºC. </li><li> Realice todos los pasos siguientes en una campana de cultivo de tejidos de nivel II para mantener la esterilidad. </li><li> En un tubo de 1,5 ml, envíe 500 μl de medio de suero reducido, 3 μl de reactivo de transfección y 1 μl de ARNsi a 20 μM. Mezclar suavemente y mantener a temperatura ambiente (RT) durante 15 - 20 min. </li><li> Durante este tiempo de incubación, preparar los mioblastos para la transfección. Después de enjuagar una vez con PBS, incubar las células adherentes (en la placa de 6 cm) con 1 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 3 min. Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de GM y recoger las células en un tubo de 15 ml. Después de la centrifugación (200 xg durante 5 min), resuspender las células en 1 ml de GM. </li><li> Cuente las células usando una cámara Neubauer. </li><li> Resuspender 5 x 10 5 célulasEn 200 μl de GM para cada transfección ( es decir, para 2 transfecciones, resuspender en 400 μl). </li><li> Añadir 200 μl de la suspensión celular a cada 500 μl de la mezcla de siRNA-transfectante. Pipetar dos veces y dos veces e incubar durante 5 min a RT. </li><li> Añadir el 700 μ l (células + siRNA-transfectante) a un plato de 3,5 cm de cultivo que contiene un cubreobjetos de vidrio. Añadir GM para obtener un volumen final de 2 ml. </li><li> Después de 24 h a 37 ° C y 7% de CO 2 , sustituir completamente el medio con 2 ml de GM fresco. Después de otras 24 h, está habitualmente presente una monocapa confluente de células transfectadas; Si es así, inducir la diferenciación de los mioblastos sustituyendo el GM por 2 mL de medio de diferenciación (DM, Tabla 1 ). </li><li> Realizar experimentos de imágenes de calcio 24 - 48 h después de la inducción de la diferenciación o sobre la proliferación de mioblastos. Nota: La inmunofluorescencia suele realizarse 48 h después de la inducción de la diferenciación. </li></ol> 6. ImmUnofluorescence Tinción de marcadores de diferenciación Nota: La tinción con inmunofluorescencia se realiza después de 48 h en DM, pero también puede realizarse en otros tiempos de diferenciación. Myogenin y MEF2 son proteínas nucleares que sólo se expresan en células diferenciadas (antes de la fusión en miotubos), y su tinción permite la evaluación del proceso de diferenciación. La cadena pesada de miosina (MyHC) sólo se expresa en miotubos y se utiliza para estimar el tamaño del miotubo y el índice de fusión (número de núcleos en miotubos / número total de núcleos). <ol><li> Después de 48 h en DM, lavar la monocapa confluente de células diferenciadas dos veces con 1 ml de PBS a RT. Haga esto cuidadosamente para evitar desprendimiento de los myotubes. </li><li> Fijar las células con 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 15 minutos a RT. Lavar las células con PBS dos veces, durante 5 min cada una. </li><li> Permeabilizar las células con 1 mL de PBS que contiene 0,25% de Triton X-100 durante 45 min y lavar 3 veces con 1 mL de PBS. </li><li> BloquearPecific por incubación de las células en PBS suplementado con 0,2% de Tween-10 y 2% de suero de cabra (solución de bloque) durante 30 min a RT. </li><li> Preparar anticuerpos primarios diluidos en solución de bloque (600 μL por placa de 3,5 cm). Nota: Se utilizan los siguientes anticuerpos primarios: anti-myogenin de ratón (1: 600), anti-MEF2 de conejo (1: 300) y anticuerpo anti-MyHC de ratón (MF20, 1: 1.000). Es posible mezclar en la misma solución de bloqueo, la cadena pesada de anti-miosina de ratón o la anti-miogenina de ratón, con anti-MEF2 de conejo. </li><li> Eliminar la solución de bloque y añadir 600 μL de soluciones de anticuerpos primarios por placa de 3,5 cm e incubar durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada. </li><li> Lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS. Incubar durante 1 hora a RT en una cámara oscura con 600 μl de los anticuerpos secundarios preparados en la solución de bloque, como sigue: Alexa 488 de cabra anti-ratón (1: 1.000), Alexa 546 de cabra anti-conejo (1: 1.000) Y DAPI (1:50, solución madre a 15 μM). CAUTION: DAPI es un compuesto tóxico que debe manejarse con guantes. </li><li> Aspirar y lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS. </li><li> Coloque cubreobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje de alcohol polivinílico con una solución antifading. Manténgalas a 4 ° C y protegidas de la luz hasta visualizar las células. </li></ol> 7. Imágenes de calcio <ol><li> Cultivo previo, preparar cubreobjetos de vidrio de 25 mm de diámetro. Coloque los cubreobjetos en etanol al 70% durante 48 h para eliminar la grasa y la suciedad de la superficie, lo que reduce la adherencia celular a la cubreobjetos. </li><li> Después de enjuagar los cubrealimentos varias veces con agua, volver a ponerlos en agua y esterilizarlos (esterilizados en autoclave). </li><li> Coloque un cubreobjetos por placa de cultivo de 3,5 cm y déjelos secar. Guarde las placas de Petri para experimentos adicionales o utilícelas inmediatamente. </li><li> Añadir los mioblastos transfectados (5 - 6 x 10 5 células) al cubreobjetos de vidrio. Nota: Los experimentos se realizan 24 - 48 h después de la inducción de differentiatiOn, o en mioblastos proliferantes. </li><li> Para realizar la formación de imágenes de Ca 2+ , lavar las células 2 veces con PBS o directamente con el medio utilizado para los experimentos (medio que contiene calcio, Tabla 3 ). Cargar las células con 2 μ M Fura-2 / AM más 1 μ M de ácido plurónico durante unos 30 minutos en la oscuridad a RT. Nota: El ácido plurónico ayuda a solubilizar Fura-2. Fura-2 / AM y ácido plurónico se disuelven en el medio que contiene calcio. </li><li> Lavar las células dos veces en el mismo medio pero sin Fura-2 / AM y ácido plurónico y dejarlas en la oscuridad durante 10-15 minutos adicionales para permitir la desesterificación de Fura-2 / AM. </li><li> Si la eficiencia de carga de Fura-2 es demasiado baja, agregue más Fura-2 ( por ejemplo, 4 μM) y / o incube las células durante más tiempo ( por ejemplo, 40 minutos). </li><li> Retire el cubreobjetos de la placa de cultivo e instálelo en la cámara experimental. Añadir ~ 1 ml de medio que contiene calcio (dependiendo del volumen del experiCámara mental). Instálelo en la etapa del microscopio e inicie la grabación. Nota: La sonda fluorescente sensible al Ca2 + Fura-2 se excita alternativamente a 340 nm y 380 nm, y la luz de emisión se recoge a 510 nm. Como las fluctuaciones de la concentración de Ca2 + son relativamente lentas, adquieran una relación cada 2 s. </li><li> Para activar SOCE, se utiliza el siguiente protocolo clásico de reabsorción de tapsigargina / Ca 2+ : dejar las células durante 2-3 min en medio que contiene calcio. Reemplace el medio con medio libre de calcio durante 1-2 min. <ol><li> Añadir 1 μ M thapsigargin para agotar los almacenes internos de calcio. Nota: La tapsigargina es un bloqueador irreversible de la actividad de la bomba de Ca2 + ATPasa del retículo sarco-endoplásmico (SERCA). Después de 8-10 minutos, reemplace rápidamente el medio con el medio que contiene calcio. Ca 2 + entrará en las células a través de los canales SOCE. Espere alrededor de 5 minutos antes de terminar los experimentos. PRECAUCIÓN: Thapsigargin es un compuesto tóxico que debe ser manipulado con guantes. </li></ol></li></ol> 8. Ca 2+ Análisis de Medición Nota: Realice el análisis con el software de adquisición. <ol><li> Abra el experimento. Dibuje la región 1 en un área donde no hay células (región de fondo) y dibuje las otras regiones en el citoplasma de las células a analizar (las regiones se pueden dibujar en cualquier imagen: el 340-nm, el 380-nm, O la relación imagen). Vaya a &quot;Ejecutar experimentos&quot;&gt; &quot;Imágenes de referencia&quot;. Bajo los canales 340 y 380, seleccione &quot;región 1&quot; y luego haga clic en &quot;Restar fondo&quot;. </li><li> Ejecute todo el experimento (F4: adelante) para asegurarse de que nada interfiera con la región de fondo, como una mancha de polvo fluorescente que viaja a través de la región de fondo y que las celdas no se mueven durante el tiempo de los experimentos. Nota: Las regiones de interés seleccionadasNo debe incluir áreas oscuras; De lo contrario, el valor de la relación será ruidoso, ya que parte del fondo se incluirá en la medición. </li><li> Haga clic en &quot;Registrar datos&quot; y vuelva a reproducir todo el experimento. Nota: Esto abrirá una hoja de cálculo en la que se registrará el tiempo y la relación. También es posible guardar las longitudes de onda individuales de 340 nm y 380 nm. </li><li> Para obtener información sobre el SOCE, extraiga los dos parámetros importantes del experimento: la amplitud de la re-adición de Ca 2+ y la pendiente de la fase de entrada del Ca 2+ ( Figura 3 ). </li><li> Obtener la amplitud restando el valor de la relación justo antes de la re-adición de Ca 2+ de la amplitud máxima de la elevación de Ca 2+ . Obtener la pendiente máxima ajustando una regresión lineal de los primeros segundos después de la re-adición de Ca 2+ . Nota: El área bajo la curva de la respuesta thapsigargin es también un parámetro informativo para extracT, ya que refleja la cantidad de calcio libre almacenado en el SR. </li></ol>

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<li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Associated+Methylation+Suppresses+SPRY1%2C+Leading+to+a+Failure+of+Re-quiescence+and+Loss+of+the+Reserve+Stem+Cell+Pool+in+Elderly+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle.</a> Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).</li>
<li>Bettadapur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Culture+of+Aligned+Skeletal+Myotubes+on+Micromolded+Gelatin+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels.</a> Sci Rep. 6, 28855(2016).</li>
<li>Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+is+a+new+actin-binding+splice+variant+involved+in+fast+repetitive+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release.</a> J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).</li>
<li>Sauc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+traps+and+gates+Orai1+channels+without+remodeling+the+cortical+ER%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER.</a> J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).</li>
<li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+measurements+in+organelles+with+Ca2%2B-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

El aislamiento y cultivo de mioblastos humanos a partir del músculo esquelético adulto ofrece un modelo in vitro para estudiar la diferenciación muscular y la regeneración muscular. En este artículo, proporcionamos un protocolo que permite la purificación de altos rendimientos de mioblastos humanos de una manera simple y costo-limitada. Además, esta técnica proporciona resultados fiables y reproducibles en términos de porcentaje de mioblastos aislados y su eficacia de diferencia...

Los músculos esqueléticos humanos están compuestos de grupos de fibras musculares contráctiles, multinucleadas, resultantes de la fusión de células precursoras miogénicas. Los músculos esqueléticos tienen la capacidad de regenerarse después de la lesión gracias a la presencia de SC, las células madre del músculo esquelético situadas entre la membrana plasmática de las miofibras (sarcolemma) y la lámina basal. En el músculo no lesionado, los SC están presentes en su mayoría en estado de reposo. En respuesta al estrés mecánico oa la lesión, los SC se activan (mioblastos), proliferan y experimentan diferenciación para formar nuevas miofibras o auto-renovación para reponer el grupo SC 1 , 2 . A lo largo de los años, se desarrollaron varias técnicas para aislar los CS y su progenie, los mioblastos, de las biopsias del músculo esquelético. Con la mayor comprensión de los marcadores de superficie celular expresados ​​en estas células y la metodología de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 3, 4 , 5 , ahora es posible aislar poblaciones puras de mioblastos humanos a partir de muestras musculares. La señalización del calcio regula el desarrollo del músculo esquelético, la homeostasis y la regeneración. En particular, la entrada de Ca2 + que se activa después del agotamiento de la tienda intracelular, llamada SOCE, es de gran importancia 6 para estos procesos. Tras la estimulación celular, disminuye el nivel de Ca 2 + en el retículo endo / sarcoplasmático (ER / SR), lo que a su vez activa los canales de Ca 2+ de la membrana plasmática que permiten la entrada de Ca 2+ para rellenar el ER / SR 7 . Las dos principales proteínas implicadas en SOCE son el ER / SR Ca 2 + -sensing stromal interacción molécula 1 (STIM1) de proteínas y la membrana plasmática Ca 2 + canal Orai1. El músculo esquelético expresa abundantemente estas dos proteínas, así como otras proteínas de las mismas familias (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 y varios canales permeables al Ca2 + de la familia canónica de potencial transitorio del receptor (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2 + entrada a través de la vía SOCE es de gran importancia para la formación muscular / regeneración [ 14] . Mutaciones de STIM1 o Orai1 proteínas tienen efectos nocivos sobre la función muscular, lo que conduce principalmente a la hipotonía muscular [ 15] . Los modelos animales con deterioro de SOCE también muestran menor masa muscular y fuerza, junto con una mayor fatigabilidad 6 , 16 , 17 . Como se mencionó, otras proteínas STIM y Orai, así como muchos canales TRPC, se expresan en el músculo esquelético, y sus funciones respectivas no se han determinado hasta el momento. GolpeandoSu nivel de expresión, es posible investigar sus implicaciones en SOCE y sus funciones durante la diferenciación del músculo esquelético humano. La medición de SOCE puede realizarse utilizando dos enfoques diferentes: registros de corriente electrofisiológica y mediciones de Ca 2+ . La electrofisiología es ciertamente un método más directo, ya que mide la corriente de interés y su firma electrofisiológica asociada. Sin embargo, esta técnica es muy difícil de aplicar a las células musculares, principalmente debido al gran tamaño de las células musculares y el pequeño tamaño de la corriente SOCE endógena. La obtención de imágenes de Ca 2+ citosólica es técnicamente muy accesible, pero la medida es más indirecta, ya que el nivel de Ca 2+ medido en el citosol refleja tanto la entrada de Ca 2+ como el re-bombeo fuera de la célula o en los almacenes internos. Una metodología que incluye el aislamiento de mioblastos a partir de pequeñas piezas de skel humanoEtal después de digestión enzimática, amplificación y FACS se explica en este trabajo. Se describe el proceso de diferenciación muscular y el protocolo de inmunofluorescencia para seguir la expresión de marcadores de diferenciación con el tiempo 18 . Finalmente, se explican las medidas de SOCE y el papel de diferentes canales iónicos en la señalización de Ca 2+ y en la diferenciación del músculo esquelético.

<table><tbody><tr><td>Jamón' s F10</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31550-023</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>Lote 41G5532K</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>O5482</td><td></td></tr><tr><td>fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EGF Corning 354001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexametanona</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Creatina</td><td>Sigma</td><td>27900</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtro de celdas</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filtro de celdas</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; mL tubo</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15&nbsp; tubo mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5&nbsp; Tubo mL (FACS)</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo: OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de transfectancia: RNAiMax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1756064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Fluka</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-MyHC *</td><td>DSHB</td><td>MF20&nbsp;</td><td>concentrar</td></tr><tr><td>Ratón anti-miogenina</td><td>BD Pharmigen</td><td>556358</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-MEF2</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>C-21</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón Alexa488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo Alexa 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti humano CD56-Alexa488</td><td>BD Pharmingen</td><td>557699</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti humano CD146-PECy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>562135</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti humano CD45-PE-CF594</td><td>BD Pharmingen</td><td>562279</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti humano CD34-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>345804</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti humano CD144-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ratón IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557702</td><td></td></tr><tr><td>Ratón PECy7 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>ratón PE-CF594 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>ratón APC IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>550854</td><td></td></tr><tr><td>ratón PE IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>556650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>ATENCIÓN:&nbsp; compuesto tóxico</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fluka</td><td>762400</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>PRECAUCIÓN: compuesto tóxico&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes de relación: Metafluor 6.3</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*&nbsp;: MF 20 fue depositado en el DSHB por Fischman, D.A.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Las células satélites (SC) son células madre musculares localizadas entre la membrana plasmática de las fibras musculares y la lámina basal circundante. Son esenciales para la regeneración muscular. Tras la lesión, que se produce con frecuencia en los músculos esqueléticos, SCs se activan. Proliferan como mioblastos y se diferencian para reparar lesiones musculares. Entre los muchos eventos que tienen lugar durante la diferenciación muscular, citosólico Ca 2 + señales son de gran importancia. Estas señales de Ca 2+ surgen de la liberación de Ca2 + desde internas Ca 2 + tiendas, así como de entrada de Ca2 + desde el espacio extracelular, particularmente la entrada de Ca2 + store-operado (SOCE). Este artículo describe una metodología utilizada para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de muestras musculares recogidas después de la cirugía ortopédica. El tejido se digiere mecánica y enzimáticamente y las células se amplifican y luego se clasifican por citometría de flujo de acuerdo con la presencia deFic marcadores de membrana. Una vez obtenidos, los mioblastos humanos se expanden y se comprometen a diferenciarse eliminando factores de crecimiento del medio de cultivo. Los niveles de expresión de los factores de transcripción específicos y la inmunofluorescencia in vitro se utilizan para evaluar el proceso de diferenciación miogénica en condiciones de control y después de silenciar las proteínas implicadas en la señalización de Ca 2 + . Finalmente, detallamos el uso de Fura-2 como una sonda ratiométrica de Ca 2+ que proporciona mediciones confiables y reproducibles de SOCE.

Después de la disociación enzimática de una muestra de músculo humano, las células se amplificaron en GM. Los mioblastos humanos, definidos como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, se obtuvieron después de FACS. Los mioblastos representaron más del 60% de la población analizada ( Figura 1 ). Los mioblastos humanos primarios fueron repoblados, crecidos hasta confluencia, y cultivados en DM durante 48 h. Después de la inmunotinción para la expresión del factor de transcripción ...

Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .

Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de músculo esquelético adulto. Estas células se utilizan en estudios funcionales, como la evaluación de la diferenciación miogénica y la medición de la entrada de calcio regulada por el almacén. La principal ventaja de esta técnica es que permite un aislamiento rápido, sencillo y reproducible de mioblastos primarios humanos.Estos mioblastos son el nuevo modelo ex vivo para estudiar la señalización del calcio durante la regeneración muscular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo muscular, como la identificación de los canales iónicos y los factores de transcripción implicados durante la diferenciación muscular. Este método puede proporcionar información sobre las funciones génicas durante la diferenciación miogénica humana.También puede aplicarse a otros estudios, como el potencial del uso de células madre miogénicas para tratar las distrofias musculares. Transfiera la muestra muscular a una placa estéril de seis centímetros, lave la muestra dos veces con PBS. Elimine cualquier tejido adiposo residual y pese la muestra.A continuación, agregue tripsina y pique el músculo en trozos más pequeños que dos milímetros. Una vez picado, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir el tejido a un frasco de disociación de 200 mililitros que contenga una barra de agitación, y continúe recolectando tejido picado en la solución de tripsina hasta que el frasco de disociación se llene hasta 90 mililitros. Ahora, incube el tejido en un baño de agua a 37 grados celsius durante 60 minutos con agitación suave.Después de una hora, agregue 10 mililitros de SFC para detener la reacción y homogenice la mezcla mediante trituration. A continuación, coloque filtros de 70 micrones sobre dos tubos de 50 mililitros y pase la mitad de la suspensión celular por cada filtro, pipeteando la suspensión hacia los filtros. Luego, prepare una suspensión de las células en medio de crecimiento y siembre 200.000 células en placas de seis centímetros con cuatro mililitros de medio.Incube las placas, cambiando el medio cada tercer día. Después de cinco a siete días, las células deben tener una confluencia del 70 % al 80 %, luego, tiéñalas. Para comenzar, enjuague la placa de células confluentes con PBS.Luego, agregue un mililitro de solución de tripsina y deje que la enzima actúe durante tres minutos. Detenga la reacción agregando dos mililitros de medio y recoja las células en un tubo de 15 mililitros. Luego, centrifugue las células y resuspenda en un mililitro de medio.A continuación, realice un recuento celular mientras almacena las células en hielo. Para el análisis de datos, cargue siete tubos con 100.000 células cada uno. Coloque las células restantes en un octavo tubo para su clasificación.Lave las células con un mililitro de tampón fax frío, luego centrifugue los tubos y aspire y deseche el sobrenadante. Añada nuevamente 200 microlitros de tampón fax con los anticuerpos apropiados y deje que las células incuben en hielo durante 30 minutos. Después de 30 minutos, lave las células nuevamente y resuspenda en 500 microlitros de tampón fax, luego separe las células utilizando un citómetro de flujo.Después de excluir las células hematopoyéticas positivas para CD45, separe las células negativas para CD45 según la expresión de CD56. Luego, seleccione la población positiva para CD56 en función de CD34, CD144 y CD146. Vuelva a analizar una fracción de la población ordenada para verificar la pureza.Ahora, aspire los mioblastos humanos y lávelos con cinco mililitros de medio. Luego, resuspenda los mioblastos en un mililitro de medio. Transfiera la suspensión a una placa de seis centímetros con cuatro mililitros de medio e incube la placa a 37 grados centígrados con 7% de dióxido de carbono.Para este procedimiento, tenga mioblastos cultivados y prepare medio de transfección fresco. Incube el medio a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Durante la incubación del medio, prepare los mioblastos.Primero, enjuáguelos una vez con PBS. Luego, retire las células adherentes mediante tripsinización. Detenga la reacción añadiendo dos mililitros de medio.Luego, recoger las células en un tubo de 50 mililitros. Centrifugarlas y re-suspenderlas en un mililitro de medio. Para cada transfección, preparar 500.000 células en 200 microlitros de medio.A cada 500 microlitros de medio de transfección, añada un alícuota de 200 microlitros de células y luego mezcle utilizando únicamente dos movimientos del pistón de la pipeta. A continuación, deje que las reacciones transcurran durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, transfiera las reacciones a placas de cultivo de 3,5 centímetros, cada una conteniendo un cubreobjetos de vidrio.A continuación, agregue 1,3 mililitros de medio para obtener un volumen final de dos mililitros e incube las placas. Después de 48 horas de diferenciación, las células pueden ser inmunomarcadas o analizadas mediante imágenes de calcio. Para cualquiera de las dos opciones, primero lave cuidadosamente las células dos veces usando un mililitro de PBS a temperatura ambiente para lavar.Intente evitar la separación de los miotubos. Para una imagen de calcio, cubra las células lavadas con dos micromoles de fura-2 AM más un micromol de ácido treónico en medio que contenga calcio. Luego, déjelas incubar durante aproximadamente 30 minutos antes de mezclar.A continuación, lave las células dos veces con medio que contiene calcio sin modificar y luego, incúbelas durante 10 a 15 minutos para la esterificación. Ahora, retire el cubreobjetos de una placa de cultivo e instálelo en la cámara experimental. Cargue la cámara con medio que contiene calcio, colóquela bajo un microscopio y luego, comience la grabación de datos.Fura-2 se excita alternativamente a 340 y 380 nanómetros. La luz de emisión se recoge a 510 nanómetros. Al dividir las imágenes de 340 nanómetros por las imágenes de 380 nanómetros, se obtienen las relaciones de imágenes; como las fluctuaciones y la concentración de calcio son relativamente bajas, se adquiere una relación de imágenes cada dos segundos.Después de dos o tres minutos, reemplace el medio por un medio sin calcio. Luego, durante uno o dos minutos, supervise la actividad del calcio operado por depósitos en las células. A continuación, agregue una concentración de un micromolar de tapsigargina a las células para agotar sus reservas internas de calcio.Espere de ocho a 10 minutos, luego reemplace rápidamente el medio con el medio que contiene calcio y registre durante cinco minutos mientras el calcio entra en las células a través de los canales suc. Después de finalizar el experimento, analice las imágenes. Seleccione un área donde no haya células para la región uno, que define el fondo; luego, seleccione un área en el citoplasma para la región dos.Las dos regiones pueden dibujarse sobre cualquiera de las imágenes de la serie. A continuación, vaya a la pestaña de ejecución de experimentos y seleccione las imágenes de referencia para los canales 340 y 380, seleccione la región uno y luego haga clic en restar fondo. Ahora, ejecute todo el experimento para eliminar el fondo de todas las imágenes.Una vez finalizado, haga clic en la opción de registrar datos para abrir una hoja de cálculo en la que se registran el tiempo y los datos de la relación. Las células musculares se cultivaron, expandieron y clasificaron mediante fax. Los mioblastos representaron más del 60 % de la población analizada.Los mioblastos humanos primarios se cultivaron luego en medio de diferenciación y se inmunotizaron para el factor de transcripción MEF2 y las proteínas de cadena pesada de miosina. La mayoría de las células expresaron la cadena pesada de miosina y formaron miotúbulos con valores del índice de fusión de aproximadamente 60 %; el otro 40 % de las células permaneció como células mononucleadas indiferenciadas, también conocidas como células de reserva. El experimento descrito de entrada de calcio regulada por el agotamiento de reservas se realizó con éxito en las células diferenciadas.Realizar el mismo experimento en células transfectadas con ARN de interferencia pequeño, dirigido contra canales permeables al calcio de la familia TRPC, muestra que el silenciamiento tuvo un impacto medible en la entrada de calcio regulada por el agotamiento de reservas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar mioblastos humanos a partir del músculo esquelético adulto. Utilizamos estas células para estudiar los pasos sucesivos de la diferenciación muscular y, en particular, la desactivación de los factores de transcripción y los canales de calcio.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de tres horas si se lleva a cabo correctamente. Es un método rápido, sencillo y reproducible que permite obtener el rendimiento de mioblastos humanos. Al intentar este procedimiento, es importante evitar que los cultivos de mioblastos alcancen la confluencia total, ya que se produciría una diferenciación espontánea no deseada.

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Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La extensión de la tienda que funciona con...

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Las células musculares se encuentran entre las células eucariotas más complejas. Presentamos un protocolo para la diferenciación in vitro de miofibras altamente maduras que permite la manipulación genética y la obtención de imágenes claras durante todas las etapas de desarrollo.

Diferenciación in vitro de las fibras maduras de imágenes en vivo

Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.

Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (&lt;50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Aquí se describen los métodos utilizados para estudiar el efecto funcional de las mutaciones RYR1 expresadas endógenamente en los linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y las células satélite derivadas de biopsia muscular diferenciadas en miotubos.

Caracterización funcional de variantes de RYR1 humanas expresadas endógenamente

Este manuscrito describe un protocolo detallado para producir matrices de microtejidos 3D del músculo esquelético humano y ensayos de función in situ mínimamente invasivos aguas abajo, incluidos análisis de fuerza contráctil y manejo de calcio.

Evaluación de las métricas funcionales de la salud del músculo esquelético en microtejidos del músculo esquelético humano

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Aprenda a aislar mioblastos humanos de músculo esquelético adulto para evaluar la diferenciación miogénica y medir la entrada de calcio almacenada. Este método rápido y reproducible permite estudiar la señalización de calcio durante la regeneración muscular.

Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

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