Name: 人成肌细胞的分离，造血分化的评估和存储操作的钙进入测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解从成人骨骼肌分离人成肌细胞的方法，用于评估肌源性分化和测量钙库操纵性钙内流。该技术可快速、简便且可重复地获得原代成肌细胞，为研究肌肉再生过程中的钙信号传导和基因功能提供重要工具。

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本工作由瑞士国家科学基金会（资助号 310030-166313）、瑞士肌肉疾病研究基金会、“Marcel Levaillant 基金会”以及骨关节研究基金会资助。

人体肌肉样本（取自半腱肌的组织）是在健康患者接受骨科手术期间作为手术废弃物收集的。所有涉及人体研究的方法均遵循瑞士卫生监管机构的指南和规定，并由瑞士日内瓦州当局的州伦理研究委员会批准（方案编号 CER n° 12-259）。所有参与研究的成年受试者均签署了知情且书面的同意书。
1. 从人骨骼肌中分离成肌细胞
<ol>
	<li>所有操作过程中，均需在二级组织培养罩内进行，并使用无菌培养基和无菌缓冲液，以维持无菌条件。 
	注意：本方法可适用于多种人体骨骼肌。</li>
</ol>
2. 解离方案
<ol>
	<li>将肌肉样本（2 - 3 g）转移至无菌的6 cm培养皿中。</li>
	<li>用5 - 10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗肌肉样本，重复清洗一次。</li>
	<li>使用弯头剪刀和钳子去除结缔组织和脂肪组织。</li>
	<li>称量肌肉样本（见步骤2.13），并将其转移至新的无菌6 cm培养皿中。</li>
	<li>加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>使用剪刀将肌肉组织剪切成小块（小于2 mm）。</li>
	<li>用10 mL移液管将剪碎的肌肉组织转移至含有磁力搅拌子的200 mL解离瓶中。重复此步骤，直至所有剪碎的肌肉组织及共计90 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液均转移至解离瓶中。盖紧解离瓶，于37 °C温和振荡条件下孵育60分钟。</li>
	<li>从水浴中取出解离瓶，加入10 mL胎牛血清（FCS；终浓度10%）以终止酶反应。用移液管混匀混合物。</li>
	<li>准备两个50 mL离心管，每个管上放置一个70 µm细胞筛网。将细胞悬液的一半通过移液反复吹打滤膜，使其完全滤过筛网进入离心管中，另一管同法操作。</li>
	<li>在200 × g、20 °C条件下离心5分钟；吸除并弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL生长培养基（GM；表1）重悬细胞，并将细胞悬液通过置于一个50 mL离心管上的40 µm细胞筛网过滤。在200 × g、20 °C条件下离心5分钟；吸除并弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL GM重悬细胞，在200 × g、20 °C条件下离心5分钟；吸除并弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL GM重悬细胞，使用血细胞计数板进行细胞计数。 
	注意：通常每克肌肉可获得约3 × 105个细胞。得率计算方法为将细胞总数除以肌肉活检样本的重量（见步骤2.4）。</li>
	<li>将2 × 105个细胞接种于含4 mL GM的无菌6 cm培养皿中，置于37 °C、7% CO2条件下培养。根据需要制备相应数量的培养皿。</li>
	<li>3天后更换生长培养基（GM）。 
	注意：新解离的细胞需要一定时间才能贴附于培养皿表面。此外，初次成肌细胞的倍增时间约为50 - 60小时；首次分裂后，倍增时间约为20小时。</li>
	<li>5 - 7天后，当细胞融合度达到70 - 80%（约每6 cm培养皿1.5 × 106个细胞）时，开始进行抗体染色和细胞分选（步骤3）。</li>
</ol>
3. 抗体染色与细胞分选
<ol>
	<li>用 PBS 洗涤一次后，将贴壁细胞（在 6 cm 培养皿中）与 1 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 和 7% CO2 条件下孵育 3 分钟（或在 5% CO2 条件下孵育）。加入 2 mL 生长培养基（GM）终止反应，并将细胞收集至 15 mL 离心管中。离心（200 × g，5 分钟）后，用 1 mL 生长培养基（GM）重悬细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）对细胞进行计数。</li>
	<li>以下操作均在冰上进行。 
	注意：在流式细胞仪上正确设置荧光补偿是关键步骤，在任何流式细胞仪上的操作原则应相似。试管 1 和 2 用作阴性对照。试管 3 至 7 用于首次实验时在流式细胞仪上设置补偿（表 2）。每种抗体及其相应同型对照的终浓度应保持一致（约为 1 µg/106 个细胞）。</li>
	<li>将 1 × 105 个细胞分装至每管（5 mL 管），共分装试管 1 至 7（表 2）。将剩余的细胞悬液置于试管 8 中，用于细胞分选。</li>
	<li>用 1 mL 冷 FACS 缓冲液（PBS-5% FCS）洗涤细胞。盖紧管盖，在 200 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟；吸除并弃去上清液。</li>
	<li>每管加入 200 µL FACS 缓冲液。根据 表 2 向各管中加入相应的抗体。冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>洗涤细胞：向每管加入 1 mL FACS 缓冲液。盖紧管盖，在 200 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除并弃去上清液。重复此步骤一次。</li>
	<li>用 500 µL FACS 缓冲液重悬细胞。盖紧管盖，冰上保存直至进行细胞分选。准备 4 个 1.5 mL 离心管，每管加入 500 µL 生长培养基（GM），用于细胞分选过程中收集细胞。将这些管置于冰上保存。</li>
	<li>通过流式细胞术分选人成肌细胞（图 1）。首先排除 CD45 阳性的造血细胞，然后根据 CD56 的表达情况分离 CD45 阴性细胞。接着，对 CD56 阳性细胞群进一步设门分析 CD34、CD144 和 CD146 的表达（人成肌细胞定义为 CD56+/CD146+/CD45-/CD34-/CD144- 的细胞）。重新分析少量分选后的细胞群，以检测分选纯度。</li>
	<li>将含有分选后人成肌细胞的各管合并至一个 15 mL 离心管中，加入 5 mL 生长培养基（GM）洗涤一次。在 200 × g、20 °C 条件下离心 5 分钟；吸除并弃去上清液。</li>
	<li>用 1 mL 生长培养基（GM）重悬细胞，并将细胞接种至一个未包被的 6 cm 培养皿中，培养皿内含 4 mL 生长培养基（每皿接种 2 × 105 个细胞）。在 37 °C 和 7% CO2 条件下孵育。</li>
</ol>
4. 细胞培养
<ol>
	<li>每2天更换一半的培养基。从培养皿中移除2 mL旧的生长培养基（GM），并加入2 mL新的GM。 
	注意：成肌细胞会分泌对培养条件有益的生长因子。</li>
	<li>当细胞达到70–80%融合度时进行胰酶消化，以避免过早分化。用PBS冲洗一次后，将贴壁细胞（在6 cm培养皿中）与1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C和7% CO2条件下孵育3分钟。加入2 mL GM终止反应，并将细胞收集至15 mL离心管中。离心（200 × g，5分钟）后，用1 mL GM重悬细胞。</li>
	<li>计数细胞，并在4 mL GM中将细胞以每皿2 × 105个接种至6 cm培养皿中。</li>
	<li>人源成肌细胞可传代培养至多6代，或使用含10% DMSO的GM按每毫升1 × 106个细胞的密度冻存。使用程序降温盒（降温速率为1 °C/min）进行细胞冻存；长期保存时，将细胞置于液氮中。</li>
</ol>
5. 人成肌细胞的siRNA转染
注意：成肌细胞在诱导分化前两天使用商用转染试剂进行转染。针对特定基因的siRNA效应始终与对照siRNA的效应进行比较。siRNA为双链RNA，必须置于冰上保存，并佩戴手套操作。
<ol>
	<li>在6 cm培养皿中获得70–80%汇合度的人类成肌细胞单层（约1.5 × 10⁶个细胞），6 细胞） 
	注意：5 × 105 每次转染需要一定数量的细胞，以确保在生长培养基中培养2天后获得融合的转染成肌细胞单层。</li>
	<li>准备玻璃盖玻片（具体步骤见第7步钙成像实验中的描述）。</li>
	<li>将GMEM、0.05%胰蛋白酶-EDTA和PBS预热至37 °C。</li>
	<li>在二级生物安全柜中进行以下所有步骤，以保持无菌状态。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中，加入500 µL低血清培养基、3 µL转染试剂和1 µL浓度为20 µM的siRNA。轻轻混匀，室温（RT）静置15–20分钟。</li>
	<li>在此孵育期间，准备进行转染的成肌细胞。用PBS洗涤一次后，将贴壁细胞（置于6 cm培养皿中）与1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C、7% CO₂条件下孵育2 孵育3分钟。加入2 mL GM终止反应，并将细胞收集至15 mL离心管中。在200 × g离心5分钟后，用1 mL GM重悬细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>重悬 5 × 105 每次转染使用200 µL GM培养基中的细胞（即， 用于两次转染，重悬于400 µL中）。</li>
	<li>向每500 µL siRNA-转染试剂混合物中加入200 µL细胞悬液。用移液器轻轻吹打混匀2次，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将700 µL（细胞 + siRNA-转染试剂复合物）加入含有玻璃盖玻片的3.5 cm培养皿中。加入生长培养基（GM）至终体积为2 mL。</li>
	<li>37 °C、7% CO₂条件下培养24小时后2，用2 mL新鲜的生长培养基完全更换培养基。再经过24小时后，通常可观察到转染细胞形成融合的单层；若如此，通过将生长培养基更换为2 mL分化培养基（DM； 表1).</li>
	<li>在诱导分化后24–48小时或在增殖的成肌细胞上进行钙成像实验。 
	注意：通常在诱导分化后48小时进行免疫荧光检测。</li>
</ol>
6. 分化标志物的免疫荧光染色
注意：免疫荧光染色在分化培养基中培养48小时后进行，但也可在其他分化时间点进行。Myogenin和MEF2是仅在已分化细胞（融合成肌管之前）中表达的核蛋白，其染色可用于评估分化过程。肌球蛋白重链（MyHC）仅在肌管中表达，可用于估算肌管大小和融合指数（肌管内核数/总核数）。
<ol>
	<li>在分化培养基中培养 48 小时后，用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下小心清洗已融合的分化细胞单层两次，注意避免剥离肌管。</li>
	<li>用 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 15 分钟，随后用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用含 0.25% Triton X-100 的 1 mL PBS 在室温下透化细胞 45 分钟，并用 1 mL PBS 洗涤三次。</li>
	<li>在室温下用含 0.2% Tween-10 和 2% 山羊血清（封闭液）的 PBS 封闭非特异性结合位点，孵育 30 分钟。</li>
	<li>将一抗用封闭液稀释（每 3.5 cm 培养皿加 600 µL）。 
	注意：使用以下一抗：小鼠抗 Myogenin 抗体（1:600）、兔抗 MEF2 抗体（1:300）和小鼠抗 MyHC 抗体（MF20，1:1,000）。可将小鼠抗肌球蛋白重链抗体或小鼠抗 Myogenin 抗体与兔抗 MEF2 抗体共同加入同一封闭液中混合使用。</li>
	<li>吸除封闭液，每 3.5 cm 培养皿加入 600 µL 一抗溶液，在 4 °C 湿润环境中过夜孵育。</li>
	<li>用 1 mL PBS 洗涤细胞三次。在避光条件下，室温下用 600 µL 封闭液稀释的二抗溶液孵育 1 小时，二抗包括：山羊抗小鼠 Alexa 488（1:1,000）、山羊抗兔 Alexa 546（1:1,000）和 DAPI（1:50，储存液浓度为 15 µM）。 
	注意：DAPI 为有毒化合物，操作时应佩戴手套。</li>
	<li>吸除液体，并用 1 mL PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>使用含抗荧光淬灭剂的聚乙烯醇封片剂将玻璃盖玻片封片。样品于 4 °C 避光保存，直至进行细胞成像。</li>
</ol>
7. 钙成像
<ol>
	<li>提前培养，准备直径为25 mm的玻璃盖玻片。将盖玻片置于70%乙醇中48 h，以去除表面油脂和污物，避免影响细胞在盖玻片上的贴附。</li>
	<li>用水多次冲洗盖玻片后，将其放回水中并进行灭菌（高压灭菌）。</li>
	<li>每个3.5 cm培养皿中放入一片盖玻片，使其干燥。将培养皿保存以备后续实验使用，或立即使用。</li>
	<li>加入转染的成肌细胞（5 - 6 x 105 细胞）贴附到玻璃盖玻片上。 
	注意：实验在诱导分化后24–48小时进行，或在增殖的成肌细胞上进行。</li>
	<li>进行Ca2+ 成像前，用 PBS 或直接用实验所用培养基（含钙培养基）洗涤细胞 2 次； 表3)。在避光、室温条件下，用 2 µM Fura-2/AM 加 1 µM pluronic acid 孵育细胞约 30 分钟。 
	注意：Pluronic 酸有助于增溶 Fura-2。Fura-2/AM 和 Pluronic 酸溶于含钙培养基中。</li>
	<li>用不含 Fura-2/AM 和普洛尼克酸的相同培养基洗涤细胞两次，然后置于暗处静置 10 至 15 分钟，以使 Fura-2/AM 完成脱酯化反应。</li>
	<li>如果Fura-2的负载效率过低，可添加更多Fura-2（例如， 4 µM）和/或延长细胞孵育时间（例如， 40 分钟。</li>
	<li>从培养皿中取出盖玻片，安装到实验腔室中。加入约1 mL含钙培养基（根据实验腔室的体积调整）。将腔室置于显微镜载物台上，开始记录。 
	注意：荧光 Ca2+-敏感探针 Fura-2 在 340 nm 和 380 nm 处交替激发，发射光在 510 nm 处收集。由于 Ca 的波动2+ 浓度变化相对较慢，每2秒获取1个比值。</li>
	<li>为了激活SOCE，需采用以下经典的毒胡萝卜素（thapsigargin）/Ca2+ 重新添加方案如下：将细胞置于含钙培养基中孵育 2-3 分钟，随后更换为无钙培养基孵育 1-2 分钟。
	<ol>
		<li>加入1 µM 毒胡萝卜素以耗竭细胞内钙库。 
		注意：Thapsigargin 是肌浆网/内质网 Ca²⁺-ATP 酶的不可逆抑制剂。2+ ATP酶（SERCA）泵活性。8–10分钟后，迅速将培养基更换为含钙培养基。Ca2+ 将通过SOCE通道进入细胞。实验终止前等待约5分钟。 
		注意：毒胡萝卜素是一种有毒化合物，操作时应佩戴手套。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Ca2+ 测量分析
注意：使用采集软件进行分析。
<ol>
	<li>打开实验。在无细胞区域（背景区域）绘制区域1，并在待分析细胞的细胞质中绘制其他区域（可在任意图像上绘制：340 nm、380 nm 或比值图像）。进入 &#34;运行实验&#34; &#62; &#34;参考图像&#34;。在340和380通道下选择 &#34;区域1&#34;，然后点击 &#34;减去背景&#34;。</li>
	<li>运行整个实验（F4：正向播放），确保没有干扰物进入背景区域，例如荧光灰尘斑点穿过背景区域，同时确保细胞在实验期间未发生移动。 
	注意：所选感兴趣区域不应包含暗区；否则，比值结果将出现噪声，因为部分背景会被纳入测量范围。</li>
	<li>点击 &#34;记录数据&#34;，再次播放整个实验。 
	注意：这将打开一个电子表格，其中记录了时间和比值数据。也可保存单独的340 nm和380 nm波长数据。</li>
	<li>为获取SOCE相关信息，从实验中提取两个关键参数：Ca2+重新添加后的响应幅度以及Ca2+内流阶段的斜率（图3）。</li>
	<li>通过用Ca2+重新添加后Ca2+升高最大比值减去添加前的比值，计算响应幅度。通过拟合Ca2+重新添加后最初几秒的线性回归，获得最大斜率。 
	注意：Thapsigargin反应曲线下的面积也是一个有价值的参数，可反映肌浆网（SR）中储存的游离钙总量。</li>
</ol>

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<li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Associated+Methylation+Suppresses+SPRY1%2C+Leading+to+a+Failure+of+Re-quiescence+and+Loss+of+the+Reserve+Stem+Cell+Pool+in+Elderly+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle.</a> Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).</li>
<li>Bettadapur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Culture+of+Aligned+Skeletal+Myotubes+on+Micromolded+Gelatin+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels.</a> Sci Rep. 6, 28855(2016).</li>
<li>Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+is+a+new+actin-binding+splice+variant+involved+in+fast+repetitive+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release.</a> J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).</li>
<li>Sauc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+traps+and+gates+Orai1+channels+without+remodeling+the+cortical+ER%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER.</a> J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).</li>
<li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+measurements+in+organelles+with+Ca2%2B-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

从成人骨骼肌中分离和培养人成肌细胞提供了一种 体外 用于研究肌肉分化和肌肉再生的模型。本文提供了一种简单且成本可控的方法，用于高效纯化大量人源成肌细胞。此外，该技术在成肌细胞分离率及其成肌分化效率方面具有良好的可靠性和可重复性。事实上，经细胞分选后，我们获得了约60%的人源成肌细胞。这些细胞在体外培养中可维持至6代（约30次倍增），并保持其分化能力。此外，当培养基由生长培养基（GM）更换为分化培养基（DM）后，成肌分化迅速发生；在DM中培养2至3天后，成肌细胞融合达到峰值。在此模型中，约60%的成肌细胞在DM中培养2天后融合形成肌管。另一优势在于，这些原代人源细胞易于转染siRNA。本实验室所用的GM和DM培养基均为自制；也可选用商品化培养基，但我们从未测试过其在人源原代细胞培养中的效率。
上述方法的一个缺点是在组织酶解过程中使用胰蛋白酶（trypsin）。该步骤会去除大量细胞表面标志物，因此需要将细胞培养数天后才能进行流式细胞分选（...

人类骨骼肌由成群的可收缩的多核肌纤维组成，这些肌纤维由成肌前体细胞融合形成。由于骨骼肌干细胞（SCs）的存在，骨骼肌在损伤后具有再生能力；这些干细胞位于肌纤维质膜（肌膜）与基底膜之间。在未受损的肌肉中，SCs 主要处于静息状态。当受到机械应力或损伤刺激时，SCs 被激活（成为成肌细胞），开始增殖，并进一步分化形成新的肌纤维，或通过自我更新来补充 SC 池1,2。多年来，已发展出多种技术用于从骨骼肌活检组织中分离 SCs 及其子代细胞——成肌细胞。随着对这些细胞表面标志物的深入认识以及荧光激活细胞分选技术（FACS）的发展3,4,5，目前已有可能从人类肌肉样本中分离出高纯度的成肌细胞群体。
钙信号调控骨骼肌的发育、稳态与再生。特别是，Ca2+ 在细胞内储存钙耗竭后被激活的通道，即储存操作性钙进入（SOCE），具有重要意义6 对于这些过程。细胞受到刺激后，Ca2+ 内质网/肌浆网（ER/SR）中的钙水平下降，进而激活质膜Ca2+ 允许 Ca 的通道2+ 进入以补充内质网/肌浆网7参与SOCE的两种主要蛋白是内质网/肌浆网Ca2+-感应型基质相互作用分子1（STIM1）蛋白和质膜Ca2+ 通道Orai1。骨骼肌大量表达这两种蛋白，以及同一家族的其他蛋白（STIM2和Orai2-Orai3）。8,9 以及几种Ca2+瞬时受体电位经典型（TRPC）家族的可通透通道10,11,12,13钙2+ 通过SOCE途径的离子内流对肌肉形成/再生具有重要意义14STIM1 或 Orai1 蛋白的突变对肌肉功能具有有害影响，主要导致肌张力低下15SOCE 功能受损的动物模型也表现出肌肉质量与力量下降，以及疲劳性增强6,16,17如前所述，骨骼肌中还表达其他STIM和Orai蛋白以及多种TRPC通道，但它们各自的功能迄今尚未明确。通过降低这些蛋白的表达水平，可进一步研究它们在SOCE中的作用及其在人类骨骼肌细胞分化过程中的功能。
SOCE 的测量可以通过两种不同的方法进行：电生理电流记录和 Ca2+ 检测。电生理学方法无疑更为直接，因为它能够测量目标电流及其相关的电生理特征。然而，该技术在肌细胞中的应用非常困难，主要原因是肌细胞体积较大，而内源性 SOCE 电流非常微弱。细胞质 Ca2+ 成像在技术上易于实现，但其测量结果更具间接性，因为细胞质中测得的 Ca2+ 水平同时反映了 Ca2+ 的内流以及通过泵出细胞或进入细胞内储存库所导致的再摄取过程。
本文介绍了一种方法，包括在酶消化后从小块人骨骼肌组织中分离成肌细胞，并进行扩增和荧光激活细胞分选（FACS）。文中描述了肌肉分化的过程，以及随时间追踪分化标志物表达的免疫荧光实验方案18。最后，阐述了钙库操纵性钙离子内流（SOCE）的测定方法，以及不同离子通道在钙离子（Ca2+）信号传导和骨骼肌分化中的作用。

<table><tbody><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F10</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31550-023</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>批号 41G5532K</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>O5482</td><td></td></tr><tr><td>胎球蛋白</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>肌酸</td><td>Sigma</td><td>27900</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞滤器</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞滤器</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&amp;nbsp;mL 管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15&amp;nbsp;mL 管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5&amp;nbsp;mL 管（FACS）</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>培养基：OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂：RNAiMax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1756064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Fluka</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 MyHC *</td><td>DSHB</td><td>MF20&amp;nbsp;</td><td>浓缩液</td></tr><tr><td>小鼠抗肌细胞生成素</td><td>BD Pharmigen</td><td>556358</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 MEF2</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>C-21</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠 Alexa488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>羊抗兔 Alexa 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD56-Alexa488</td><td>BD Pharmingen</td><td>557699</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD146-PECy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>562135</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD45-PE-CF594</td><td>BD Pharmingen</td><td>562279</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD34-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>345804</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD144-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 小鼠 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557702</td><td></td></tr><tr><td>PECy7 小鼠 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 小鼠 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>APC 小鼠 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>550854</td><td></td></tr><tr><td>PE 小鼠 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>556650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>注意：&amp;nbsp; 有毒化合物</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fluka</td><td>762400</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>注意&amp;nbsp;：有毒化合物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>比率成像采集软件：Metafluor 6.3</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*&amp;nbsp;：MF 20 由 Fischman, D.A. 提交至 DSHB&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

卫星细胞（SC）是位于肌纤维质膜与周围基底膜之间的肌肉干细胞，对肌肉再生至关重要。当骨骼肌频繁发生损伤时，SC被激活，增殖形成成肌细胞，并进一步分化以修复肌肉损伤。在肌肉分化过程中发生的诸多事件中，胞质内Ca2+ 信号具有重要意义。这些Ca2+ 信号来源于Ca2+ 内质网钙释放2+ 储存，以及来自Ca2+ 来自细胞外空间的进入，特别是由储存库调控的 Ca2+ 进入（SOCE）。本文描述了一种从骨科手术后获取的肌肉样本中分离出纯度较高的人肌母细胞的方法。组织经过机械和酶消化处理后，细胞被扩增，并根据特定膜标志物的表达情况通过流式细胞术进行分选。获得的人肌母细胞随后进行扩增，并通过去除培养基中的生长因子诱导其向分化方向发展。特定转录因子的表达水平以及 体外 免疫荧光用于评估对照条件下以及沉默参与Ca相关蛋白后的成肌分化过程2+ 信号传导。最后，我们详细阐述了Fura-2作为比率型Ca2+ 提供可靠且可重复的SOCE测量结果的探针。

在对人类肌肉样本进行酶解离后，细胞在GM中扩增。经FACS分选后获得人成肌细胞，其定义为CD56+/CD146+/CD45-/CD34-/CD144-细胞。成肌细胞占分析细胞群体的比例超过60%图1）。将原代人成肌细胞重新接种，培养至融合后，在分化培养基（DM）中继续培养48小时。经免疫染色检测转录因子MEF2和肌细胞特异性蛋白肌球蛋白重链（MyHC）的表达后，我们观察到大部分细胞形成了肌管 体外 （MyHC阳性细胞），融合指数值为60.9 ± 1.3%（n = 5； 图2）。我们还观察到，约40%的人成肌细胞（称为储备细胞）逃避了这种终末分化，保持为未分化的单核细胞。在功能研究中，我们分析了Ca2+ 成肌细胞或肌管在分化启动后48小时的反应 图3 展示了用于诱导SOCE及从此类记录中提取关键参数的代表性实验方案。为解析与SOCE相关分子的信息，细胞被转染针对目标分子的siRNA。<strong class="xfig"...

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+ 信号传导。

卫星细胞（SC）是位于肌纤维质膜与周围基底膜之间的肌肉干细胞。它们对于……至关重要。

本实验的主要目标是从成人骨骼肌中获得纯度较高的人肌母细胞群体。这些细胞可用于功能研究，例如肌源性分化能力评估以及钙库操纵性钙离子内流的测定。该技术的主要优势在于能够快速、简便且可重复地分离出人原代肌母细胞。这些成肌细胞是研究肌肉再生过程中钙信号传导的新型体外模型。该方法有助于回答肌肉研究领域的一些关键问题，例如鉴定参与肌肉分化的离子通道和转录因子。该方法还可为人类成肌分化过程中的基因功能提供重要见解。它还可应用于其他研究，例如利用成肌干细胞治疗肌肉营养不良症的潜力。将肌肉样本转移至无菌的6厘米培养皿中，用PBS清洗样本两次。去除残留的脂肪组织并称量样本重量。接下来，加入胰蛋白酶并将肌肉组织切碎至小于2毫米的碎片。切碎后，使用10毫升移液管将组织转移至含有搅拌子的200毫升解离瓶中，继续在胰蛋白酶溶液中收集切碎的组织，直至解离瓶内液体体积达到90毫升。随后，将组织置于37摄氏度水浴中孵育60分钟，并进行轻柔搅拌。一小时后，加入10毫升FCS以终止反应，并通过吹打混匀混合物。将70微米细胞筛分别置于两个50毫升离心管上，用移液器将细胞悬液各取一半依次通过细胞筛过滤。随后，将细胞重悬于生长培养基中，并将200,000个细胞接种至6厘米培养皿中，每皿加入4毫升培养基。将培养板置于培养箱中孵育，每三天更换一次培养基。培养五至七天后，细胞应达到70%至80%融合度，随后进行染色。首先，用PBS冲洗融合的细胞培养板。然后，加入1毫升胰蛋白酶溶液，孵育3分钟。加入2毫升培养基以终止反应，并将细胞收集至15毫升离心管中。随后离心沉淀细胞，并用1毫升培养基重悬细胞。接下来，在将细胞置于冰上保存的同时进行细胞计数。用于数据分析时，将七支试管每管各加入100,000个细胞。将剩余细胞加入第八支试管中用于分选。用一毫升冷 fax 缓冲液洗涤细胞，随后离心试管，吸除并弃去上清液。加入 200 微升含适当抗体的 fax 缓冲液，将细胞置于冰上孵育 30 分钟。30 分钟后，再次洗涤细胞，并将细胞重悬于 500 微升 fax 缓冲液中，随后使用流式细胞仪分选细胞。在排除 CD45 阳性造血细胞后，根据 CD56 表达对 CD45 阴性细胞进行分选。随后，对 CD56 阳性群体设门分析 CD34、CD144 和 CD146 的表达。重新分析部分分选后的细胞群，以检测分选纯度。现在，将人成肌细胞离心并用五毫升培养基洗涤。然后将其重悬于一毫升培养基中。将细胞悬液转移至含有四毫升培养基的六厘米培养皿中，并在37°C、7% CO₂条件下孵育培养皿。进行此操作时，需准备培养好的成肌细胞，并配制新鲜的转染培养基。将培养基在室温下孵育15至20分钟。在培养基孵育期间，对成肌细胞进行处理。首先用 PBS 冲洗一次。然后用胰蛋白酶消化贴壁细胞。加入两毫升培养基以终止反应。然后，将细胞收集到一个50毫升离心管中。离心沉淀后，用1毫升培养基重悬。每次转染时，将500,000个细胞重悬于200微升培养基中。向每 500 µL 转染培养基中加入 200 µL 的细胞等分试样，然后仅用移液枪轻轻吹打两下混匀。随后，在室温下孵育反应体系 5 分钟。5 分钟后，将反应液转移至 3.5 cm 的培养皿中，每个培养皿内含一片玻璃盖玻片。接着，加入1.3毫升培养基，使终体积达到2毫升，然后将培养皿放入培养箱中孵育。分化48小时后，可对细胞进行免疫染色或钙成像分析。无论选择哪种方法，均需先用1毫升室温的PBS小心清洗细胞两次。尽量避免肌管脱落。进行钙成像时，在含钙培养基中加入2 µM fura-2 AM和1 µM赤藓酸覆盖已清洗的细胞。随后，于混合前孵育约30分钟。接下来，用含钙的未修饰培养基将细胞洗涤两次，然后孵育10至15分钟以进行酯化反应。随后，从培养板中取出盖玻片并将其安装到实验腔室中。向腔室内加入含钙培养基，置于显微镜下，然后开始数据记录。Fura-2 在 340 和 380 纳米处交替激发，于 510 纳米处收集发射光。将 340 纳米激发的图像除以 380 纳米激发的图像，得到图像比值；当信号波动和钙离子浓度相对较低时，每两秒获取一个图像比值。两到三分钟后，用无钙培养基替换原有培养基。随后，监测细胞内钙库操纵的钙通道活性一到两分钟。接着，向细胞中加入一微摩尔的毒胡萝卜素，以耗竭其内部的钙储存。等待八到十分钟，然后迅速用含钙培养基替换原有培养基，并记录五分钟，使钙通过蔗糖通道进入细胞。实验结束后，分析图像。选择无细胞区域作为区域一，用于定义背景；再选择细胞质区域作为区域二。可以在序列中的任意一幅图像上绘制这两个区域。接下来，转到“运行实验”选项卡，为340和380通道选择参考图像，选择区域一，然后点击“减去背景”。随后，运行整个实验，以从所有图像中去除背景。完成后，单击“记录数据”选项，以打开一个电子表格，其中记录了时间和比值数据。肌细胞通过流式细胞分选技术进行培养、扩增和分选。成肌细胞占分析细胞群体的60%以上。随后将原代人成肌细胞在分化培养基中培养，并对转录因子MEF2和肌球蛋白重链蛋白进行免疫染色。大多数细胞表达肌球蛋白重链，并形成融合指数约为60%的肌管，其余40%的细胞保持未分化的单核细胞状态，也称为储备细胞。所述的储存操纵性钙内流实验已成功在分化后的细胞上进行。对转染了针对TRPC家族钙离子通道的小干扰RNA的细胞重复进行相同实验，结果显示基因敲低对受储存调控的钙离子内流产生了可测量的影响。观看本视频后，您应能充分了解如何从成人骨骼肌中分离人类成肌细胞。我们利用这些细胞研究肌细胞分化的各个连续步骤，特别是转录因子和钙离子通道的失活过程。一旦掌握，若操作得当，该技术可在不到三小时内完成。这是一种快速、简单且可重复的方法，可用于获得人成肌细胞的产量。在进行该操作时，重要的是要防止成肌细胞培养物达到完全汇合，以免发生非预期的自发性分化。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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人成肌细胞的分离，造血分化的评估和存储操作的钙进入测量

可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。...

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

本文介绍了使用兰格多夫灌流系统分离成年小鼠心肌细胞的方法。所获得的细胞具有钙耐受性，电生理静息，并可进行培养，以及利用腺病毒或慢病毒感染来调控基因表达。此外，还可利用MMSYS系统和膜片钳技术分析其功能特性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。...

人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

肌细胞是最复杂的真核细胞之一。我们提出了一种用于 体外...

体外成熟肌纤维的活体成像分化

成肌细胞是能够增殖的前体细胞，可分化形成多核的肌管，并最终发育为骨骼肌肌纤维。本文介绍一种从小鼠成年早期骨骼肌中高效分离和培养原代成肌细胞的实验方案。该方法可用于在体外培养条件下对肌肉细胞进行分子、遗传和代谢方面的研究。...

从小鼠骨骼肌组织外植体中分离和分化原代成肌细胞

本文介绍了一种从振动切片机切割的心肌薄片中分离人和动物心室心肌细胞的实验方案。仅需少量组织（&lt;50...

从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

本文描述了用于研究在EB病毒永生化的人B淋巴细胞以及由肌肉活检获得的卫星细胞分化成的肌管细胞中内源性表达的RYR1突变功能效应的方法。...

内源性表达的人源RYR1变异体的功能表征

本文描述了一种详细的方案，用于制备三维人源骨骼肌微组织阵列，并进行微创的下游原位功能检测，包括收缩力和钙处理分析。...

评估人类骨骼肌微组织中骨骼肌健康的各项功能指标

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。...

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

本方案通过组织解离、连续过滤、预贴壁及特定培养条件，提供了一种从成年和新生小鼠骨骼肌中分离和富集原代成肌细胞的标准化方法，可用于建立和维持由卫星细胞衍生的成肌细胞培养体系，以支持后续实验应用。...

分离骨骼肌卫星细胞以 体外 肌生成研究

了解从成人骨骼肌分离人成肌细胞的方法，用于评估肌源性分化和测量钙库操纵性钙内流。该技术可快速、简便且可重复地获得原代成肌细胞，为研究肌肉再生过程中的钙信号传导和基因功能提供重要工具。

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

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