Name: Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA In Situ Hibridación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a localizar genes de receptores odorantes de baja expresión en antenas de insectos mediante hibridación in situ con sondas marcadas con digoxigenina o biotina. Este protocolo ofrece alta sensibilidad para neurociencia.

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Este trabajo es apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.31472037). La mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación.

NOTA: Para limitar la degradación del ARN, preparar soluciones usando agua destilada en autoclave húmedo (a 121 ° C durante 60 min) y también materiales de autoclave en húmedo. 1. Preparación de sondas antisentido y sensorial de ARN ISH <ol><li> Amplificación y purificación de genes diana <ol><li> En primer lugar, se produce un fragmento de doble cadena de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) del plásmido que contiene el ADNc de longitud completa de LmigOR1 con una ADN polimerasa Taq que añade adeninas a ambos extremos de los fragmentos. <ol><li> Utilizar un volumen de reacción final de 100 mu l que contenga 50 mu l de mezcla de reacción 2x, 4 mu l de cebadores sentido y antisentido ( Tabla 1 ), 1 mu l de molde de plásmido y 41 mu l de H 2 O libre de RNasa. Protocolo: 94ºC durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min, Seguido de 72 ° C durante 10 min. </li><li> Repita estos pasos para producir el fragmento de doble hebra de 1,303 pb de LmigOR2 (GenBank: JQ766966) y fragmento de doble hebra de 1,251 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Los cebadores utilizados en estos experimentos se presentan en la Tabla 1 . </li><li> Ejecutar productos de PCR en geles de agarosa al 1,2% en 1x tampón Tris-acetato-EDTA y visualizar usando tinción con bromuro de etidio. </li></ol></li><li> Extraer estos productos de PCR utilizando un kit de extracción de gel. <ol><li> Después de la electroforesis, extirpar las bandas de ADN del gel y colocar las rodajas de gel en un tubo de 1,5 ml. A continuación, añadir 100 μl de tampón de unión (tampón PN) por 0,1 g de rebanada de gel. Vórtice e incube a 50 ° C hasta que la rebanada de gel se disuelva completamente. </li><li> Insertar una columna de adsorción de CA2 en el tubo de recogida y añadir 500 μl de tampón de equilibrio (tampón BL). Esto mejora la capacidad de absorción y la estabilidad de la membrana de sílice. CentriFuge a 12.400 xg durante 1 min. </li><li> Transferir la mezcla de gel disuelto al conjunto de columna de adsorción e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. A continuación, centrifugar los tubos a 12.400 xg durante 1 min. Deseche el flujo y vuelva a insertar la columna de adsorción en el tubo de recogida. </li><li> Añadir 600 μL de solución de lavado (etanol añadido, Buffer PW) dos veces. Centrifugar a 12.400 xg durante 1 min. Deseche el flujo y vuelva a insertar la columna de adsorción en el tubo de recogida. </li><li> Vaciar el tubo de recogida y recentrifugar el conjunto de la columna a 12.400 xg durante 2 min para permitir la evaporación de cualquier etanol residual. </li><li> Transfiera cuidadosamente la columna de adsorción a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml. Secar al aire el gránulo durante 5-10 minutos y redisolver el ADN en un volumen adecuado ( por ejemplo, 30 μl) de agua libre de nucleasa. </li><li> Incubar a TA durante 2 min. Centrifugar a 12.400 xg durante 2 min. Desechar la columna de adsorción y almacenar el ADN a 4 ° C o -20 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Construir los plásmidos recombinantes <ol><li> Individualmente ligar el fragmento de 387 pb de LmigOR1, 1303 bp fragmento de LmigOR2 y 1251 bp fragmento de LmigORco en un vector de T que contiene promotores para la T7 (aguas arriba) y ARN polimerasas SP6 (aguas abajo) adyacente al DNA insertado utilizando ADN ligasa de T4. Preparar la siguiente reacción de 10 μl: 5 μl de tampón de ligación 2x, 1 μl de vector T, 3 μL (~100 ng) del ADN del gen insertado y 1 μl de ADN ligasa T4 e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Añadir 5 μl de cada plásmido recombinante que contiene el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y 1.251 pb de LmigORco por separado en 50 μl de células competentes de Escherichia coli DH5α en tubos estériles de 1,5 mL. <ol><li> Mezclar suavemente y poner los tubos en hielo durante 30 min y luego incubarlos durante 90 s a 42DO. Vuelva a colocarlos en hielo durante 3 min. </li><li> Añadir 450 μl de medio líquido Luria-Bertani (LB) sin ampicilina a cada tubo e incubarlos en un agitador a 150 rpm durante 1 h a 37 ° C para restaurar el E. coli DH5α. </li><li> Tomar una alícuota de 100 μl de cada transformante y usarlos para inocular placas de sustrato sólido LB que contengan ampicilina 50 μg / ml, β-D-1-tiogalactopiranósido isopropílico (IPTG) de 24 μg / mL y 40 μg / mL de 5-bromo-4 - cloro - 3 - indolil - beta - D - galactopiranósido (X - gal). </li><li> Incubar estas placas en una incubadora constante a 37 ° C durante 18 h. Se tamizan los plásmidos recombinantes diana usando el método de cribado azul-blanco. Secuencia de los plásmidos recombinantes diana utilizando la secuenciación de Sanger e identificar las tres OR direcciones de los insertos de los genes. </li></ol></li></ol></li><li> Seleccionar endonucleasas de restricción para linealizar plásmidos recombinantes <ol><li> Utilizar endonucleasas de restricción tNo sólo digieren en el sitio de clonación múltiple del vector, sino que tampoco cortan el ADN del inserto. En este experimento, todos los 3 genes se insertan en el vector T en la dirección correspondiente a la del vector. </li><li> Utilizar endonucleasa de restricción Nco I para linealizar los plásmidos recombinantes que contienen el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y fragmento de 1.251 pb de LmigORco para producir las sondas antisentido. Utilice la endonucleasa de restricción Sp e I para producir las sondas de detección. NOTA: Si la dirección de la inserción corresponde a la del vector, entonces se selecciona un sitio de restricción único desde el extremo de T7 para linealizar el plásmido recombinante y se utiliza ARN polimerasa SP6 para preparar la sonda antisentido. Se selecciona un sitio de restricción único desde el extremo de SP6 para linealizar el plásmido recombinante, y se usa la ARN polimerasa de T7 para preparar la sonda de detección. De lo contrario, si la dirección del inserto no corresponde a tLa dirección del vector, entonces se selecciona un único sitio de restricción desde el extremo de SP6 para linealizar el plásmido recombinante y se usa RNA polimerasa de T7 para preparar la sonda antisentido. El único sitio de restricción desde el extremo de T7 se selecciona para linealizar el plásmido recombinante, y la ARN polimerasa SP6 se ​​usa para preparar la sonda de detección. </li></ol></li><li> Purificación de los plásmidos recombinantes linealizados <ol><li> Digerir 20 μg de cada uno de los tres plásmidos recombinantes que contienen el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y fragmento de 1.251 pb de LmigORco usando la endonucleasa de restricción Nco I en una reacción de 100 μL que contiene 10 μl de tampón 10x, 40 μl de 0,5 mu g / mu l de plásmido, 3 mu l de Nco I y 47 mu l de H _ { 2} O libre de RNasa, seguido de una incubación de 3 h a 37ºC. </li><li> De forma similar, digerir 20 μg de cada uno de estos tres plásmidos recombinantes uCantar la endonucleasa de restricción Spe I. </li><li> Purificar estos plásmidos digeridos usando un kit de extracción en gel como se describe en 1.1.2. Determine las concentraciones de estos plásmidos recombinantes linealizados extraídos mediante espectrofotometría y ajuste a 0,5 μg / μl. </li></ol></li><li> Preparar sondas antisentido y sensorial <ol><li> Utilice el sistema de transcripción de ARN T7 / SP6 para generar sondas antisentido y sensorial. La ARN polimerasa SP6 se ​​utiliza para transcribir ARN bicatenario para sondas antisentido marcadas con DIG y biotina para estos tres genes OR usando plásmidos recombinantes linealizados como plantillas in vitro . La ARN polimerasa T7 se utiliza para producir sondas de detección. Realizar la reacción en un volumen final de 20 μL, que contiene 2 μl de mezcla NTP 10x, 2 μl de tampón de transcripción 10X, 1 μl de inhibidor de RNasa, 2 μl de ARN polimerasa T7 o SP6, 4 μl de 0,5 μg / μL de plásmido linealizado y 9 mu l de H _ { 2} O libre de RNasa, seguidoPor una incubación de 3 h a 37ºC. </li><li> Incubar las sondas antisentido y sensorial marcadas con DIG y biotina durante 30 min con 1 mu l de DNasa a 37ºC. Añadir 2,5 μL de LiCl 5 M y 75 μL de etanol absoluto, luego incubar las reacciones durante 30 minutos a -70 ° C. </li><li> Centrifugar a 15.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Cuidadosamente decantar el sobrenadante. Añadir 150 μl de etanol al 70% para lavar el precipitante. Preparar el etanol al 70% (1 L) añadiendo etanol al 95% (736,8 ml) a agua destilada estéril (263,2 ml). </li><li> Centrifugar a 15.000 xg durante 30 min a 4 ° C de nuevo y secar al aire el pellet durante 5-10 min a RT. Añadir 25 μL de H 2 O libre de RNasa para disolver las sondas antisentido y sensorial de ARN. </li><li> Si la longitud del gen insertado es mayor que 1 kb, posteriormente se fragmentan las sondas antisentido y de sentido inverso a una longitud media de ~ 300 pb por incubación en soluciones tampón bicarbonato-carbonato. Realizar la reacción en un volumen final de 50 μl, containing 25 l de la sonda de ARN y 25 l de la solución tampón de bicarbonato-carbonato (mM NaHCO3 80 mM, Na 120 2 CO 3, pH 10,2) a 60 ° C. El tiempo de hidrólisis requerido viene dado por una fórmula 17 previamente publicada. </li><li> Añadir 5 μl de ácido acético al 10% para detener la reacción. En este experimento, se fragmentan las sondas LmigOR2 y LmigORco antisentido y sentido durante 24 y 23 min, respectivamente. T = (L _ { o } - L _ { f} ) / k _ {X} o _ {XL} f L o = longitudes de los fragmentos iniciales en kb L f = longitud de los fragmentos finales en kb K = la constante de velocidad para la hidrólisis, aproximadamente 0,11 kb -1 min -1 T = tiempo de hidrólisis en min </li><li> Por último, añadir 250 μL de tampón de hibridación y almacenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de las secciones del criostato <ol><li> Precool el freeziNg hasta -24 ° C. </li><li> Seleccione las nuevas langostas adultos que mueven y están activas y tienen antenas intactas. Cortar las antenas en pedazos de 2-3 milímetros usando maquinillas de afeitar estériles. </li><li> Ponga el compuesto OCT en un soporte de micrótomo congelador y coloque una o dos muestras en el compuesto horizontalmente. Luego, transfiera el soporte al micrótomo de congelación a -24 ° C para equilibrar hasta que el compuesto se congela. Saque el soporte y cubra las muestras con un poco de compuesto. Transfiera el soporte al micrótomo de congelación a -24 ° C de nuevo durante al menos 10 minutos ( Figura 1 ). NOTA: Evite las burbujas en el compuesto. </li><li> Fijar el soporte con las muestras en el microtómulo de congelación, luego seccionar las muestras congeladas en cortes de 12 μm de grosor a -24 ° C. </li><li> Descongelar las rebanadas una por una en los portaobjetos (25 x 75 mm, sin nucleasas) y secar al aire durante 10 min. </li></ol> 3. Secciones de fijación <ol><li> Después de preparar el criostato(100 x 40 x 80 mm) y fijar los tejidos por incubación de los portaobjetos en solución de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las diapositivas en solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) durante 1 min. </li><li> Para eliminar las proteínas alcalinas, transferir los portaobjetos a HCl 0,2 M durante 10 min. </li><li> Para eliminar la proteína superficial del ácido nucleico, transferir los portaobjetos a 1XPBS con 1% de Triton X-100 durante 2 min. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces durante 30 s en 1x PBS. </li><li> Finalmente, enjuague los portaobjetos en solución de formamida durante 10 min a 4 ° C. </li></ol> 4. Hibridación <ol><li> Preparar las sondas antisentido y de sentido <ol><li> Utilizar un tampón de hibridación para diluir las sondas antisentido o sensorial de ARN en los tubos libres de nuclease de 1,5 ml. En este experimento, para todas las sondas antisentido y sensorial ( LmigOR1, LmigOR2 y LmigOrco ), añadir 1 μl de sonda a 99 μL de hibridación por diapositiva. Generalmente, el uso de diluciones 1: 100 de sondas antisentido produce señales positivas significativas y fondos bajos usando este protocolo. </li><li> Para la detección cromogénica, diluir las sondas marcadas con DIG individualmente. </li><li> Para la detección de TSA, diluir DIG-etiquetados LmigOR1 con biotina marcado LmigOrco sondas o DIG-etiquetados LmigOR2 con biotina marcado LmigOR1 sondas en conjunto en el buffer de hibridación. </li><li> Calentar las diluciones durante 10 min a 65 ° C y ponerlas en hielo durante al menos 5 min. </li></ol></li><li> Hibridación <ol><li> Escurrir las diapositivas y añadir 100 μ l de antisentido diluido y sentido sondas (Paso 4.1) a las secciones de tejido. Luego, coloque cubreobjetos (24 mm x 50 mm, sin nucleasa) en las secciones de tejido. </li><li> Coloque los portaobjetos cubiertos horizontalmente en una caja húmeda (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figura 2 ) e incube unaT 55ºC durante 22 h. Agregue solución de formamida o 1X PBS al fondo de la caja para mantener el ambiente húmedo, pero no sumerja las diapositivas en el líquido. </li></ol></li><li> Lavado y bloqueo. <ol><li> Después de la hibridación, retire los cubreobjetos cuidadosamente. Lavar las diapositivas dos veces durante 30 minutos en 0.1x Citrato de Sodio Salino (SSC) a 60 ° C. NOTA: El lavado significa colocar los portaobjetos en un soporte de portaobjetos que luego se coloca en un recipiente de plástico y agitar suavemente sobre un balancín (~ 50 rpm; Figura 2 ). </li><li> Enjuague los portaobjetos en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 30 s. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo de bloqueo al 1% en TBS suplementado con Triton X-100 al 0,03% en cada diapositiva, e incubar durante 30 min. Luego, deseche la solución de bloqueo. </li></ol></li><li> Inmunohistoquímica. <ol><li> Para la detección cromogénica, utilice un reactivo de bloqueo en TBS para diluir 750 unidades (U) / mL de antibota-anti-digoxigenina conjugada con antiboDy a 1,5 U / mL AP solución. Agregue 100 μl de solución de AP por cada diapositiva cubierta (24 mm x 50 mm). </li><li> Para la detección de TSA, utilice un reactivo de bloqueo en TBS para diluir 750 U / ml de anticuerpo conjugado con anti-digoxigenina AP y anticuerpo conjugado con antipatina de estreptavidina anti-biotina a la solución de AP / HRP. Añadir 100 μl de solución de AP / HRP por una lámina cubierta (24 mm x 50 mm). </li><li> Incubar los portaobjetos en una caja húmeda ( Figura 2 ) durante 60 minutos a 37 ° C. Utilice la solución de formamida o 1X PBS para mantener la caja húmeda pero no empapada. </li></ol></li></ol> 5. Tinción <ol><li> Quite los cubreobjetos cuidadosamente. Lavar las diapositivas tres veces durante 5 min en 1x TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%. Enjuagar los portaobjetos en tampón DAP (detección cromogénica: pH 9,5, detección de TSA: pH 8,0) durante 5 min. </li><li> Tinción (detección cromogénica) <ol><li> Añadir 100 μl de NBT (375 μg / ml) / BCIP (188 μg / ml) solución de sustrato (diluida en DAP;PH 9,5) a cada diapositiva. Cuidadosamente colocar cubreobjetos (24 x 50 mm) en las diapositivas. </li><li> Incubar los portaobjetos en una caja húmeda con solución de sustrato durante 10 min - O / N a 37 ° C. NOTA: Compruebe el desarrollo mirando las diapositivas de vez en cuando bajo el microscopio. </li><li> Cuando el desarrollo esté listo, detenga la reacción transfiriendo los portaobjetos al agua. </li></ol></li><li> Tinción (detección de TSA) <ol><li> Utilice una jeringa para mover el sustrato HNPP (100 μg / ml) / rojo rápido (250 μg / ml) del filtro de jeringa (0,22 μm, Figura 2 ). </li><li> Agregue 100 μl de sustrato HNPP / Fast Red por cada diapositiva cubierta con un cubreobjetos (24 x 50 mm). Incubar las diapositivas durante 30 min con HNPP / Fast Red sustrato a RT. </li><li> Retire los cubreobjetos cuidadosamente y lave los portaobjetos tres veces durante 5 min en 1X TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%. </li><li> Utilizar 100 μl de sustrato TSA / cubierto (24 x 50 mm 2 ) deslizamiento. Incubar los portaobjetos con sustrato TSA durante 10 minutos a TA. </li><li> Retire los cubreobjetos cuidadosamente y lave las diapositivas tres veces durante 5 min en 1x TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%. </li></ol></li><li> Incrustar las diapositivas en PBS / glicerol (1: 3). NOTA: Después de terminar estos procedimientos, las diapositivas deben ser observadas tan pronto como sea posible porque la señal fluorescente se apagará rápidamente. </li></ol> 6. Observación <ol><li> Detección cromogénica <ol><li> Observe las secciones de tejido usando un microscopio óptico. Elija las lentes objetivo 10X, 20X y 40X para observar los resultados de la detección cromogénica. </li><li> Utilice el software DP-BSW para analizar los resultados y capturar las imágenes. </li></ol></li><li> Detección de TSA <ol><li> Observe las secciones de tejido usando un microscopio confocal. Los genes marcados con DIG deben observarse bajo luz de 543 nm, presentando un color rojo, y los genes marcados con biotina deben serObservado bajo luz 488 nm, presentando un color verde. Cuando emergen, presentan color amarillo. </li><li> Elija las lentes objetivo 20X y 40X para observar los resultados de la detección de TSA, respectivamente. </li><li> Utilice el software FV1000 para analizar los resultados y capturar las imágenes. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar o cualquier otro conflicto de intereses.

Es difícil realizar ARN ISH para localizar los genes OR en las antenas de insectos porque los niveles de expresión de los genes OR, excepto ORco , son muy bajos y preservar cortes histológicos de antenas de insectos es muy difícil. Además, la detección de TSA es también muy difícil. Para abordar estos problemas, deben tomarse las siguientes medidas. Las antenas se seleccionan de las langostas adultas de nueva mutación que tienen cutículas antenales finas y suaves, que mantienen su morfología en la diapositiva. ...

Las antenas de insectos, que son los órganos chemosensoriales más importantes, están cubiertas con muchas estructuras similares a los cabellos - llamadas sensilla - que son inervadas por las Neuronas Receptoras Olfativas (ORNs). En la membrana de los ORNs de insectos, los receptores de olor (OR), un tipo de proteína que contiene siete dominios transmembrana, se expresan con un coreceptor (ORco) para formar un heterómero que funciona como un canal iónico odorante 1 , 2 , 3 . Diferentes RUP responden a diferentes combinaciones de compuestos químicos 4 , 5 , 6 . Las langostas ( Locusta migratoria ) se basan principalmente en señales olfativas para desencadenar comportamientos importantes 7 . Las ER de langostas son factores clave para la comprensión de los mecanismos olfatorios moleculares. Localización de un gen específico de la langosta OR en la neurona de un genMorfológicamente específico sensillum tipo por RNA In Situ Hybridization (RNA ISH) es el primer paso en la exploración de la función de las RUP. El ARN ISH utiliza una sonda de ARN complementario marcada para medir y localizar una secuencia de ARN específica en una sección de tejido, células o montajes enteros in situ , proporcionando información sobre los procesos fisiológicos y la patogénesis de la enfermedad. Las sondas de ARN marcadas con digoxigenina (marcadas con DIG) y marcadas con biotina se han usado ampliamente en la hibridación de ARN. El marcado de ARN con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP puede prepararse mediante transcripción in vitro con ARN polimerasas SP6 y T7. Las sondas de ARN marcadas con DIG y biotina tienen las siguientes ventajas: no radiactivas; seguro; estable; altamente sensible; Altamente específicos; Y fácil de producir utilizando PCR y transcripción in vitro . Las sondas de ARN marcadas con DIG y biotina pueden ser detectadas cromogénicamente y fluorescentemente. Las sondas de ARN marcadas con DIG pueden detectarse con Alkali anti-digoxigeninaNe Se pueden visualizar anticuerpos conjugados con fosfatasa (AP) que pueden visualizarse con los sustratos quimioluminiscentes altamente sensibles cloruro de tetrazolio / sal de toluidina de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (NBT / BCIP) usando un microscopio óptico o con 2 -hidroxi-3-naftoico (HNPP) acoplado con sal de cloruro de hemi-zinc de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio (Fast Red) usando un microscopio confocal. Las sondas de ARN marcadas con biotina se pueden detectar con anticuerpos conjugados con anti-biotina streptavidina de rata de caballo peroxidasa (HRP) que se pueden visualizar con fluoresceína-tiramidas usando un microscopio confocal. De este modo, la hibridación in situ fluorescente de doble color puede realizarse para detectar dos genes diana en una rebanada usando sondas de ARN marcadas con DIG y biotina. El ARN ISH con sondas marcadas con DIG y / o biotina se ha utilizado con éxito para localizar genes relacionados con el olfato, tales como OR , receptor ionotrópico, proteína de unión al odoranteY la proteína de membrana de la neurona sensorial, en antenas de insectos de, pero sin limitarse a, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria y la langosta del desierto Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Sin embargo, existen dos desafíos sustanciales al realizar RNA ISH para OR de insectos: (1) OR genes (excepto ORco ) se expresan en niveles bajos y sólo en unas pocas células, dificultando la detección de señales y (2) preservando tejido de insecto para Histología, de modo que la morfología se conserva y el ruido de fondo es bajo, puede ser un reto. En este artículo un protocolo detallado y eficaz que describe el ARN ISH para la localización de genes OR en insectosAntenas, incluyendo tanto la detección cromogénica como la de Tyramide Signal Amplification (TSA).

<table><tbody><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&veces; TSINGKETM Mezcla Maestra</td><td>TSINGKE, China</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>Libre de RNasa H2O</td><td>TIANGEN, China</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, ESPAÑA</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de unión</td><td>TIANgel Midi Kit de purificación, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de equilibrio</td><td>TIANgel Kit de purificación Midi, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Solución de lavado</td><td>TIANgel Midi Kit de purificación, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T Vector</td><td>Promega, EE. UU</td>. <td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Promega, EE. UU</td>. <td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5 y alfa;</td><td>TIANGEN, China</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma, EE. UU.</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>Isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranósido</td><td>Inalco, EE. UU</td>. <td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galactopiranósido</td><td>SBS Genetech, China</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>Nco I</td><td>BioLabs, Nueva Inglaterra</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>BioLabs, Nueva Inglaterra</td><td>R0133M Kit de etiquetado de ARN</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DIG Roche, Suiza</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Kit de etiquetado de ARN de biotina</td><td>Roche, Suiza</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>Kit de etiquetado de ARN DIG</td> de<td>DNasa,</td> Roche, Suiza <td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Países Bajos</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, EE. UU.</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, EE. UU.</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue cloruro de tetrazolio / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato sal de toluidina</td><td>Roche, Suiza</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&times; Tris-acetato-EDTA</td><td>Sigma, EE. UU.</td><td>V900483-1KG</td><td>0.04 mol / L Tris-Base</td></tr><tr><td>1&veces; Tris-acetato-EDTA</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td>0.12% ácido acético</td></tr><tr><td>1&times; Tris-acetato-EDTA</td><td>Sigma, EE. UU.</td><td>03677</td><td>Sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td></tr><tr><td>Medio líquido Luria-Bertani (LB)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) medio líquido</td><td>MERCK, Alemania</td><td></td><td>VM335231 10 g/L Peptona de caseína (Triptona)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) medio líquido</td><td>MERCK, Alemania</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Extracto de levadura</td></tr><tr><td>Placa de sustrato sólido LB</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Placa de sustrato sólido LB</td><td>MERCK, Alemania</td><td></td><td>VM335231 10 g/L Peptona de caseína (Tryptone)</td></tr><tr><td>Placa de sustrato sólido LB</td><td>MERCK, Alemania</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Extracto de levadura Placa</td></tr> de <tr><td>sustrato sólido LB</td><td>WISENT ING, Canadá</td><td>800-010-CG</td><td>Agar de 15 g/L de grado bacteriológico</td></tr><tr><td>10 veces; solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.1)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>8.5% NaCl</td></tr><tr><td>10 veces; Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, EE. UU</td>. <td>V900041-500G</td><td>14 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>10&veces; Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, EE. UU</td>. <td>V900268-500G</td><td>80 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>10&times; Solución salina tamponada Tris (TBS, pH 7.5)</td><td>Sigma, EE. UU</td>. <td>V900483-1KG</td><td>1 M Tris-Base</td></tr><tr><td>10&times; Solución salina tamponada con tris (TBS, pH 7,5)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>1,5 m</td></tr> de <tr><td>tampón de detección de NaCl (DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; detección cromogénica pH 9.5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Detección TSA pH 8.0</td><td>Sigma, EE. UU.</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tampón de detección Tris-Base</td></tr><tr><td>(DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; detección cromogénica pH 9.5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Detección TSA pH 8.0</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>de NaCl Tampón de detección (DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; detección cromogénica pH 9.5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Detección TSA pH 8.0</td><td>Sigma, EE. UU.</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl2&middot; 6H2O</td></tr><tr><td>20 veces; citrato de sodio salino (pH 7.0)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20 veces; solución salina-citrato de sodio (pH 7.0)</td><td>Sigma, EE. UU</td>. <td>V900095-500G</td><td>0.3 M Solución</td></tr><tr><td>de paraformaldehído de Na-Citrato al 4% (PFA, pH 9.5)</td><td>Sigma, EE. UU</td>. <td>V900894-100G</td><td>4% tampón de</td></tr><tr><td>carbonato de sodio</td><td>Sigma, EE. UU</td>. <td>V900182-500G</td><td>0.1 M NaHCO3</td></tr><tr><td>Tampón de carbonato de sodio (pH 10.2)</td><td>Sigma, EE. UU</td>. <td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO3</ tampón ></td></tr> <tr><td>carbonato de sodio (pH 10.2)</td><td>Sigma, EE. UU</td>. <td>S7795-500G</td><td>120 mM Na2CO3</td></tr><tr><td>Solución de formamida (pH 10.2)</td><td>MPBIO, EE. UU</td>. <td>FORMD002</td><td>50% de formamida desionizada</td></tr><tr><td>Solución de formamida (pH 10.2)</td><td></td><td></td><td>5&times; tampón de bloqueo de citrato de sodio y solución salina</td></tr><tr><td>en TBS</td><td>Roche, Suiza</td><td>11175041910</td><td>1%</td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo de transferencia en TBS</td><td>AMRESCO, EE. UU</td>. <td>0694-500ML</td><td>0.03% Triton X-100</td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo en TBS</td><td></td><td></td><td>1&times; Solución salina tamponada Tris</td></tr><tr><td>Solución alcalina de fosfatasa Solución</td> ortopédica <td>Roche, Suiza</td><td>11175041910</td><td>1,5 U/mL anticuerpo conjugado anti-digoxigenina fosfatasa alcalina</td></tr><tr>solución <td></td><td></td> de<td>fosfatasa alcalina</td><td>Tampón bloqueante en TBS</td></tr><tr><td>Solución de fosfatasa alcalina / peroxidasa de rábano picante</td><td>Roche, Suiza</td><td>11175041910</td><td>1,5 U/mL de fosfatasa alcalina antidigoxigenina conjugada anticuerpo</td></tr><tr><td>Solución de fosfatasa alcalina/peroxidasa de rábano picante</td><td>Kit TSA, Perkin Elmer, EE. UU.</td><td>NEL701A001KT 1</td><td>% anti-biotina estreptavidina peroxidasa de rábano picante- anticuerpo conjugado</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td> de<td>fosfatasa alcalina/peroxidasa de rábano picante</td><td>Tampón de bloqueo en</td></tr><tr><td>tampón de hibridación</td> TBS <td>MBIO, EE. UU</td><td>. FORMD002</td><td>50% de hibridación de formamida desionizada</td></tr><tr><td> Búfer</td><td></td><td></td><td>2&veces; citrato de</td></tr><tr><td>sodio salino Tampón de hibridación</td><td>Sigma, EE. UU.</td><td>D8906-50G</td><td>10% sulfato de dextrano</td></tr><tr><td>Tampón de hibridación</td><td>invitrogen, EE. UU</td>. <td>AM7119</td><td>20 y micro; g/mL de levadura t-ARN Tampón</td></tr> de <tr><td>hibridación</td><td>Sigma, EE. UU.</td><td>D3159-10G</td><td>0,2 mg/mL ADN de esperma de arenque</td></tr><tr><td>2-hidroxi-3-ácido naftoico-2'-fenilanilida fosfato/4-cloro-2-metilbencendiazionio hemi-zinc cloruro de policiano sustrato de sal Roche</td><td>, Suiza</td><td>11758888001</td><td>1% de ácido 2-hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilida fosfato (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Sustrato de sal de cloruro de hemizinc de hemi-zinc de ácido 2-hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilácido de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio</td> Roche<td>, Suiza</td><td>11758888001</td><td>1% de sal de cloruro de hemi-zinc de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>Ácido 2-hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilida fosfato/4-cloro-2-metilbencenodiazonio hemi-zinc sustrato de sal</td><td></td><td></td> de cloruro de hemi-zinc <td>Tampón</td></tr><tr><td>de detección Señal de tiramida sustrato de amplificación</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, EE. UU.</td><td>NEL701A001KT</td> 2<td>% de fluoresceína-tiramidas</td></tr><tr><td>Sustrato de amplificación de señal de tiramida</td><td>Kit TSA, Perkin Elmer, EE. UU</td>. <td></td><td>NEL701A001KT Diluyente de amplificación</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezing microtomo</td><td>Leica, Nussloch, Alemania</td> Espectrofotómetro de <td>criostato</td><td></td>Jung CM300</tr><tr><td></td><td>Thermo SCIENTIFIC, EE. UU</td>. <td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Olympus, Tokio, Japón</td><td>Microscopio Olympus IX71 Microscopio</td><td></td></tr><tr><td>confocal</td><td>Olympus, Tokio, Japón</td><td>Olympus BX45 Microscopio</td><td></td> confocal</tr></tbody></table>

localización de genes receptor odorante en antenas locustinas por rna<em&gt; in situ</em&gt; hibridación

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Los insectos han desarrollado sofisticados sistemas de recepción olfativa para detectar señales químicas exógenas. Estas señales químicas son transducidas por neuronas receptoras olfativas (ORN) alojadas en estructuras similares a los cabellos, llamadas chemosensilla, de las antenas. En las membranas de los ORN, se cree que los receptores de olor (OR) están implicados en la codificación de los olores. Por lo tanto, ser capaz de identificar genes localizados a los ORNs es necesario para reconocer los genes OR, y proporciona una base fundamental para la posterior funcional in situ estudios. Los niveles de expresión de ARN específicos de ORs en las antenas de insectos son muy bajos, y preservar el tejido de insectos para la histología es un reto. Por lo tanto, es difícil localizar un OR a un tipo específico de sensilla utilizando ARN hibridación in situ. En este artículo, se introduce un detallado y altamente eficaz ARN in situ protocolo de hibridación en particular para los genes O poco expresados ​​de insectos. Además, un OR específico Gene waS identificados mediante la realización de dos experimentos de hibridación fluorescente in situ utilizando un gen del receptor coexpresor, Orco , como marcador.

Con la detección cromogénica, un pequeño subconjunto de las células de la antena en cada sección de la antena de adultos se denota por DIG-etiquetados LmigOR1 y LmigOR2 antisentido sondas ( Figura 3 ]. RNA ISH en secciones consecutivas para localizar LmigOR1 y LmigOR2 mostró que las células antenales que expresan los dos genes se localizaron en ORN clusters que expresan LmigORco , lo que indica que el sup...

Este artículo describe un protocolo de hibridación in situ detallado y altamente eficaz, especialmente para los genes de receptores Odorantes expresados ​​de bajo nivel (OR), así como otros genes, en antenas de insectos usando sondas marcadas con biotina o marcadas con digoxigenina (DIG).

Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

El objetivo general de este procedimiento es localizar genes receptores de odorantes expresados de bajo nivel, así como otros genes en las antenas de los insectos, utilizando sondas marcadas con digoxigenina o biotina. Para comenzar este procedimiento, seleccione las nuevas langostas adultas en muda que estén activas y tengan antenas intactas, luego corte las antenas en pedazos de dos a tres milímetros con navajas de afeitar estériles. A continuación, aplique el compuesto OCT en un soporte de micrótomo de congelación y coloque las muestras sobre el compuesto horizontalmente.Transfiera el soporte al micrótomo de congelación a menos 24 grados centígrados para equilibrar hasta que el compuesto se congele. Después, saca el soporte y cubre las muestras con un poco de compuesto. Transfiera el soporte al micrótomo de congelación a 24 grados centígrados negativos nuevamente durante al menos 10 minutos, luego corte las muestras congeladas en rodajas de 12 micrómetros de grosor.Posteriormente, descongele las rodajas una a una en portaobjetos y séquelas al aire durante 10 minutos. Después de preparar las secciones de criostato, coloque los portaobjetos en un recipiente de plástico y fije los tejidos incubando los portaobjetos en una solución de PFA al 4% durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de 30 minutos, lave los portaobjetos en un X PBS durante un minuto.Para eliminar las proteínas alcalinas, transfiera los portaobjetos a cloruro de hidrógeno de 0,2 molares durante 10 minutos, luego transfiera los portaobjetos a un X PBS con 1%Triton X-100 durante dos minutos para eliminar la proteína de superficie del ácido nucleico. A continuación, lave los portaobjetos dos veces durante 30 segundos en un X PBS. Posteriormente, enjuague los portaobjetos en solución de formamida durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Drene los portaobjetos y agregue 100 microlitros de sondas antisentido y de detección diluidas, luego coloque las hojas de cobertura en las secciones de tejido. Luego, agregue una solución de formamida o un X PBS al fondo de la caja para mantener el ambiente húmedo, pero no sumerja los portaobjetos en el líquido. A continuación, coloque los portaobjetos cubiertos horizontalmente en una caja húmeda e incube a 55 grados centígrados durante 22 horas.Después de la hibridación, retire los cubreobjetos con cuidado. Lave los lados dos veces agitándolos suavemente sobre un balancín durante 30 minutos en 0.1 X SSC a 60 grados Celsius, luego enjuague los portaobjetos en un X TBS durante 30 segundos. Añadir un mililitro de reactivo bloqueante al 1% en TBS suplementado con Tritina X-100 al 0,03% en cada portaobjetos e incubar durante 30 minutos.Luego, desecha la solución de bloqueo. Para la detección cromogénica, utilice el reactivo bloqueante en TBS para diluir 750 unidades por mililitro de anticuerpo conjugado anti-digoxigenina-AP a 1,5 unidades por mililitro de solución AP. Posteriormente, agregue 100 microlitros de solución AP a cada portaobjetos cubierto.Para la detección de TSA, use el reactivo de bloqueo en TBS para diluir 750 unidades por mililitro de anticuerpo conjugado anti-digoxigenina-AP y anticuerpo conjugado anti-estreptavidina HRP anti-biotina a la solución AP HRP, luego agregue 100 microlitros de solución AP HRP a cada portaobjetos cubierto. Agregue la solución de formamida o un X PBS para mantener la caja húmeda pero no empapada. A continuación, incuba los portaobjetos en una caja húmeda durante 60 minutos a 37 grados centígrados.Lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en un X TBS complementado con 0.05%TWEEN 20 en un balancín. Después de eso, enjuague los portaobjetos en el tampón DAP durante cinco minutos dejando el recipiente de plástico sobre un balancín agitado suavemente. Para la detección cromogénica, agregue 100 microlitros de solución de sustrato NBT/BCIP a cada portaobjetos.Coloque con cuidado los portaobjetos en los portaobjetos, luego incube los portaobjetos en una caja húmeda con solución de sustrato durante 10 minutos o toda la noche a 37 grados centígrados. Verifique el desarrollo mirando los portaobjetos de vez en cuando bajo el microscopio. Cuando el desarrollo esté listo, detenga la reacción transfiriendo los portaobjetos al agua.Para la detección de TSA, use una jeringa para mover el sustrato HNPP/Fast Red del filtro de jeringa, luego agregue 100 microlitros de sustrato HNPP/Fast Red a cada portaobjetos cubierto con un cubreobjetos. Después de eso, incube los portaobjetos durante 30 minutos con sustrato HNPP / Fast Red a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, retire los portaobjetos con cuidado y lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en un X TBS complementado con 0.05%TWEEN 20.Incubar los portaobjetos con 100 microlitros de sustrato TSA por portaobjetos cubierto durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire los portaobjetos con cuidado y lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en un X TBS complementado con 0,05%TWEEN 20 antes de incrustar los portaobjetos en glicerol PBS. Para la detección cromogénica, observe las secciones de tejido con un microscopio óptico.Aquí se muestra el patrón de marcaje de la sonda antisentido LmigOR1 y LmigORco en las secciones consecutivas de la antena de langosta. Aquí está el patrón de etiquetado de la sonda antisentido LmigORco y LmigOR2 en las secciones consecutivas de la antena de langosta. Aquí se muestra la ilustración de las estructuras dendríticas ocasionalmente etiquetadas.Para la detección de TSA, observe las secciones de tejido con un microscopio confocal. Aquí, se realizó una hibridación in situ de dos colores en la sección longitudinal de la antena para ilustrar la expresión de LmigOR1 y LmigORco. La localización de las células que expresan LmigOR1 en grupos de células que expresan LmigORco confirmó su identidad neuronal, y aquí hay una vista cercana de las áreas en caja.Ocasionalmente la estructura dendrítica marcada como dendrítica se indica con una flecha, y las áreas encerradas en un círculo indican el grupo de neuronas receptoras olfativas que expresan LmigORco y comparten el mismo sensillum.

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Demostramos variaciones de la técnica de grabación extracelular de múltiples unidades para caracterizar el mal olor respuestas evocadas en las tres primeras etapas de la vía olfativa invertebrado. Estas técnicas se pueden adaptar fácilmente para examinar la actividad conjunto en otros sistemas neurales también.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Aquí describimos el proceso de inmunotinción de montaje completo de antenas de Drosophila, lo que nos permite comprender mejor los mecanismos moleculares involucrados en la diversificación de las neuronas receptoras olfativas (ORN).

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Describimos un protocolo para usar antenogramas de insectos en forma de electroantenogramas (EAG) en robots autónomos. Nuestro diseño experimental permite grabaciones estables en un día y resuelve parches de olor individuales de hasta 10 Hz. La eficiencia de los sensores EAG para búsquedas olfativas se demuestra al conducir un robot hacia una fuente de olor.

El uso de insectos electroantenograma Sensores de Robots Autónoma de Búsquedas olfativas

situ (ISH) &gt; 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

Las chinches dependen de las neuronas receptoras olfativas alojadas en su sensibilidad olfativa antenal para detectar semioquímicos en el medio ambiente. Utilizando el registro de un solo sensillum, demostramos un método para evaluar la respuesta de las chinches a los semioquímicos y exploramos el proceso de codificación involucrado.

Uso Individual sensillum grabación para detectar respuestas olfativo neurona de chinches de cama a Semioquímicos

Aquí, presentamos un protocolo para la etapa y diseccionar desarrollar tejido olfativo de especies de Drosophila . El tejido disecado más adelante puede ser utilizado para análisis moleculares como RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa) o RNA, secuenciación (RNAseq), así como análisis en vivo como inmunohistoquímica o en situ hibridación.

Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila

Este papel describe un protocolo detallado y muy eficaz para las grabaciones de solo sensillum de la basiconica sensilla en los palpos de partes bucales de insectos.

Grabaciones de Sensillum solo para langosta palpo Sensilla Basiconica

Este estudio introduce protocolos experimentales para un dron bio-híbrido de detección de olores basado en antenas de seda. Se presenta el funcionamiento de un dispositivo experimental de electroantenograma con antenas de sedamo, además de la estructura de un dron biohíbrido diseñado para la localización de fuentes de olor utilizando el algoritmo de sobretensión en espiral.

Drone bio-híbrido de detección de olores basado en electroantennografía utilizando antenas Silkmoth para la localización de fuentes de olor

El artículo describe los métodos y reactivos necesarios para realizar la hibridación in situ de fluorescencia in situ de ARN de reacción en cadena de hibridación (HCR RNA WM-FISH) para revelar información sobre la resolución espacial y celular de los genes receptores quimiosensoriales en la antena del mosquito y el palpo maxilar.

Hibridación Reacción en cadena ARN Fluorescencia de montaje completo Hibridación in situ de genes quimiosensoriales en apéndices olfativos de mosquitos

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Aprende a localizar genes de receptores odorantes de baja expresión en antenas de insectos mediante hibridación in situ con sondas marcadas con digoxigenina o biotina. Este protocolo ofrece alta sensibilidad para neurociencia.

Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA

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