Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis

El objetivo general de este modelo quirúrgico y método de análisis de imágenes es observar el efecto de su tratamiento en un modelo preclínico de fractura vertebral por compresión relacionada con la osteoporosis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en este campo de la medicina regenerativa glial, como ¿cuál podría ser un tratamiento eficaz para las fracturas vertebrales por compresión relacionadas con la osteoporosis y cómo ayudaría dicho tratamiento a la regeneración ósea? La principal ventaja de esta técnica es que involucra ratas desnudas, por lo que los tratamientos novedosos se pueden probar in vivo sin problemas de rechazo inmunológico.

Además, la regeneración ósea que subyace en este método es semiautomatizado, por lo que es más preciso y menos dependiente del usuario que el publicado anteriormente. La demostración del procedimiento estará a cargo de la doctora Wafa Tawackoli, científica investigadora de nuestro laboratorio. Primero induzca la anestesia en una rata osteoporótica usando 5% de isoflurano en 100% de oxígeno, luego transfiérala a un cono de nariz con dos a 3% de isoflurano para su mantenimiento.

Afeita la zona abdominal con una afeitadora eléctrica. Hisopar con antiséptico a base de yodo en gluconato de clorhexidina al 0,5% seguido de etanol al 70%. Use ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.

Aplique un estímulo de pellizco en los dedos del pie para asegurar un plano adecuado de anestesia. Si no se observa ninguna respuesta, inicie el procedimiento. Coloque la rata anestesiada en decúbito dorsal sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 grados centígrados y estire las extremidades utilizando un sistema de retracción de fijador magnético.

Inyecte carprofeno a la rata por vía subcutánea antes de comenzar el procedimiento quirúrgico. Después de hacer una incisión de cinco a ocho centímetros en la piel comenzando un centímetro por debajo de la apófisis xifoides y a través de la línea media, use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de la aponeurosis a través de la línea alba para acceder a la cavidad abdominal. Exponga la cavidad abdominal con retractores.

Desvía los intestinos hacia la derecha de la rata para exponer la aorta abdominal y el riñón izquierdo. Para evitar la deshidratación, use gasas estériles empapadas para envolver los órganos internos. Use retractores adicionales según sea necesario para exponer la aorta.

Palpa la columna lumbar y luego procede a exponerla. Utilice la termocauterización para exponer la cara anterior de los cuerpos vertebrales lumbares L cuatro a cinco y aislarlos del tejido conectivo y los músculos circundantes. Use un hisopo de algodón para extraer la sangre y el tejido residual de las cuatro vértebras L.

A continuación, utilice una broca estéril de dos centímetros de diámetro para perforar un defecto óseo de cinco milímetros de profundidad en el centro de la cara anterior expuesta del cuerpo vertebral. Aplique una presión mínima para perforar solo la corteza ventral y el hueso trabecular subyacente. Evite perforar la corteza dorsal.

A continuación, perfore las cinco vértebras L de la misma manera para crear dos defectos por rata. Una vez finalizada la perforación, regrese los intestinos a la cavidad abdominal y retire los retractores. A continuación, use la sutura quirúrgica absorbible sintética vicryl en un patrón continuo para suturar la aponeurosis.

Cierre la piel con una sutura no absorbible de nailon monofilamento 4-0 en un patrón interrumpido simple. A continuación, aplique 100 microlitros de adhesivo cutáneo tópico sobre y entre las suturas cutáneas para asegurar el cierre completo de la piel. Después de inyectar a la rata con una solución de ringer lactato a 37 grados centígrados para prevenir la hipotermia y la deshidratación y buprenorfina para el alivio del dolor postoperatorio, permita que el animal se recupere de la anestesia en la almohadilla térmica.

Al día siguiente del procedimiento quirúrgico, inducir la anestesia con isoflurano como antes. Escanee la rata con un escáner micro-CT in vivo. Después de la exploración y la recuperación de la anestesia, regrese la rata a la jaula de la casa.

Para separar los datos de las vértebras para su análisis, haga clic en el programa de evaluación micro-CT y seleccione la muestra en el menú. A continuación, utilice el ratón para contornear las vértebras individuales en un corte. Use la barra Z para ir al siguiente corte y contornear las vértebras individuales de la misma manera.

Guarde la vértebra contorneada como un archivo separado haciendo clic en archivo, guarde GOBJ cada par de cortes. Luego, después de configurar la vértebra de referencia, impórtela a un entorno de micro-CT. Aplique el VOI definido para la vértebra de referencia a la vértebra objetivo registrada haciendo clic en el programa de evaluación micro-CT, archivo, cargar GOBJ y seleccionando el GOBJ creado anteriormente.

Finalmente, envíe el VOI para su evaluación utilizando un programa de evaluación micro-CT. Esta imagen frontal en 3D muestra una imagen representativa del defecto vertebral un día después de la generación del defecto. La formación de hueso en el vacío se indica en rojo.

Esta es una imagen 2D sagital de la misma área y, finalmente, una imagen 2D axial. Como se ve aquí, la formación ósea ocurre con el tiempo y se detecta con imágenes longitudinales. La densidad volumétrica ósea y la densidad aparente se calcularon y compararon mediante un ANOVA de dos vías de medidas repetidas con corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples.

Como se ve aquí, la densidad del volumen óseo y la densidad aparente aumentan significativamente a partir de dos semanas después de la creación del defecto vertebral. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la histología y la inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales, como qué células están presentes y qué proteínas se expresan en el defecto. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo crear múltiples defectos vertebrales en ratas desnudas y analizar la regeneración ósea a lo largo del tiempo en estos defectos.