Name: Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a crear fracturas vertebrales en ratas desnudas osteoporóticas y analiza la regeneración ósea mediante tomografía microcomputarizada semiautomatizada longitudinal. Este método permite evaluar tratamientos preclínicos sin rechazo inmunológico.

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La investigación fue apoyada por una beca del Instituto de California de medicina regenerativa (CIRM) (TR2-01780).

todos los experimentos con animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de Cedars-Sinai Medical Center (protocolo # 3609). Se administró anestesia para todos los procedimientos quirúrgicos e imágenes. Todos los animales fueron alojados según los protocolos aprobados de IACUC.
 Nota: el diseño experimental de este protocolo se muestra en la figura 1. Compra de ratas de 6 semanas de edad con sus ovarios quirúrgicamente removido y darles de comer un LCD compuesto por fosfato de calcio y 0.77% 0.01%. Después de un período de 4 meses de un LCD, perfore un defecto vertebral de tamaño crítico en el cuarto y quinto cuerpos vertebrales lumbares (L4-L5). Después de la cirugía, imagen de las ratas en el día 1 y las semanas 2, 4, 8 y 12 después del establecimiento del defecto. Localizar defectos de márgenes en la exploración del día 1, reorientar a una posición estándar y definir un volumen cilíndrico de interés (VOI). Registrar automáticamente las exploraciones posteriores µCT (es decir, para la semanas 2, 4, 8 y 12) de cada rata a la posición estándar definida para la correspondiente exploración del día 1. Aplicar el día 1 predefinidos VOI a los análisis registrados. Evaluar la densidad de volumen óseo y la densidad aparente de las VOIs.
 1. inducción de Osteoporosis <ol><li>poner ratas de seis semanas de edad athymic ovariectomizada en 4 meses de un LCD compuesto por fosfato de calcio y 0.77% 0.01%.</li>
	<li>Interruptor de nuevo a una dieta normal. 
	Nota: Estas ratas se hará referencia a como &#34; las ratas &#34; en adelante.</li>
</ol> 2. Modelo de defecto vertebral Nota: la sincronización es 40-50 minutos por animal.
<ol><li>Herramientas de autoclave todo quirúrgico previo a la cirugía.</li>
	<li>En el caso de múltiples cirugías, esterilizar instrumentos quirúrgicos todos.
	<ol><li>Lavar las herramientas y colocarlos en un baño sonicador para 5 minutos en un conjunto de esterilizador de grano caliente a 250 ° C para permitir s. 20 las herramientas se enfríe durante 5 min.</li>
	</ol></li> <li>Inducir anestesia.
	<ol><li>Lugar la rata osteoporótica en la cámara de inducción conectado a una máquina de anestesia con un sistema de barrido central. Inducir la anestesia con isoflurano de 5% en oxígeno al 100% y mantener a través del cono de nariz en 2-3% de isoflurano. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.</li>
		<li>Aplicar un estímulo del pellizco del dedo del pie para asegurar el adecuado plano de anestesia. Si se observa no hay respuesta, iniciar el procedimiento de.</li>
	</ol></li> <li>La rata anestesia en recumbency dorsal sobre una almohada (37 ° C) y estirar las extremidades mediante un sistema de retracción de fijador magnético ( figura 2A). 
	Nota: La temperatura de la almohada es importante para la prevención de la hipotermia, ya que una rata anestesiado es incapaz de regular su temperatura corporal.</li>
	<li>Afeitar la zona abdominal con una afeitadora eléctrica. Esponja con base de yodo antiséptico y clorhexidina gluconato 0.5% seguida de etanol al 70%.</li>
	<li>Inyectar la rata con carprofeno (5 mg/kg peso corporal (BW), subcutánea (SQ)) antes de comenzar el procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Utilizar un bisturí estéril para cortar la piel. Comenzar la incisión de 1 cm por debajo del proceso xifoides y corte a través de la línea media (~ 5-8 cm) ( figura 2B).</li>
	<li>Utilizar tijeras quirúrgicas para realizar una incisión de la aponeurosis a través de la linea alba para acceder a la cavidad abdominal ( figura 2).</li>
	<li>Exponer la cavidad abdominal utilizando retractores ( Figura 2D).</li>
	<li>Desviar los intestinos hacia la derecha de la rata para exponer la aorta abdominal y el riñón izquierdo ( Figura 2E). Palpe la zona lumbar antes de proceder a exponerlo. Para evitar la deshidratación, uso estériles gasas empapadas con solución salina estéril para envolver los órganos internos.</li>
	<li>Thermocautery uso para exponer en capas el aspecto anterior de cuerpos vertebrales lumbares L4-5 y aíslan el tejido conectivo y los músculos circundantes ( figura 2F -G). 
	Nota: Thermocautery debe utilizarse para controlar el sangrado durante la disección.</li>
	<li>Utilizar un hisopo de algodón estéril impregnado de solución salina estéril para remover el tejido de sangre y residual de la vértebra L4. Utilice una broca de taladro trépano estéril (~ 2 mm de diámetro) para perforar un defecto de 5 mm de profundidad del hueso en el centro del aspecto anterior expuesto del cuerpo vertebral (Figura 2 H-I). 
	Nota: Aplique una mínima presión para perforar a través de solo la corteza ventral y hueso trabecular subyacente; evitar la perforación a través de la corteza dorsal. Tenga en cuenta que las vértebras de las ratas son muy frágiles. Use un hisopo de algodón para limpiar el defecto y aplicar presión para detener el sangrado, si está presente.</li>
	<li>Repetir paso 2.11 en la vértebra L5 para crear un total de 2 defectos por rata ( figura 2J).</li>
	<li>Devolver el intestino a la cavidad abdominal.</li>
	<li>Utilizar una vicryl sutura quirúrgica absorbible sintético (vicryl 3-0 sin teñir 27 &#34; SH taper) en un patrón continuo para suturar la aponeurosis ( figura 2 K).</li>
	<li>Cerca de la piel mediante una sutura no absorbible 4-0 monofilamento nylon en un patrón interrumpido simple ( figura 2 L).</li>
	<li>Aplicar 100 μl del pegamento de la piel de uso tópico sobre las suturas de la piel y entre ellos para asegurar el cierre completo de la piel.</li>
	<li>Inyectar la rata con ringer entibiada caliente (37 ° C) &#39; solución de s (1CC/100 g BW, SQ) para prevenir la hipotermia y la deshidratación.</li>
	<li>Inyectar la rata con buprenorfina (0, 5 mg/kg BW, SQ) antes de la cirugía y cada 8-12 h para aliviar el dolor después de la operación según sea necesario.</li>
	<li>No descuide el animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Además, no devolver un animal que ha experimentado la cirugía a la compañía de otros animales hasta que haya recuperado completamente.</li>
	<li>Después de que el animal se ha recuperado en la almohada, devolverlo a su jaula. 
	Nota: Las ratas de la casa individualmente (es decir, en jaulas separadas) para prevenir la mutilación de rata a rata de las suturas y heridas.</li>
	<li>Chow remojado en agua en un plato de Petri en el piso de la jaula para unos días después de la operación ayudar a las ratas a alcanzar la comida de lugar.</li>
	<li>Administrar carprofen (5 mg/kg BW, SQ) después de la cirugía 24 h para el alivio del dolor cada 24 h según sea necesario.</li>
	<li>Retire las suturas de la piel mientras el animal está bajo 2% isoflurano anestesia 10-14 días después de la operación.</li>
</ol> 3. MicroCT exploración Nota: la sincronización es 30-40 minutos por animal.
<ol><li>Al día siguiente de la intervención quirúrgica, colocar la rata osteoporótica en la cámara de inducción conectada a una máquina de anestesia con un sistema de barrido central. Inducir la anestesia con isoflurano de 5% en oxígeno al 100% y mantener a través del cono de nariz en 2-3% isoflurano.</li>
	<li>Analizar la rata usando un escáner en vivo µCT. Repetir la exploración para el análisis longitudinal de la regeneración ósea. 
	Nota: Asegúrese de que todos los animales se analizan con la misma configuración (es decir, energía de rayos x, análisis medio, intensidad, tamaño del voxel y resolución de la imagen) y en un similaorientación de la r. Por ejemplo: energía de rayos x, 55 kVP; corriente, 145 μA; tamaño de voxel, 35 μm; incrementos, 115 μm; y tiempo de integración, 200 ms; con las muestras en PBS. Consulte a Bouxtein et al. 34 para más explicaciones y consideraciones implicados en roedores µCT análisis para una evaluación de la microestructura ósea. Idealmente, se utilizaría la máxima resolución de escaneo disponible para todos los escaneos; sin embargo, exploraciones de alta resolución requieren tiempos más largos de la adquisición, generan conjuntos de datos grandes y exponen a los animales a más radiación ionizante. Este último puede introducir efectos no deseados, incluyendo la disminución de fracturas. Por lo tanto, el equilibrio entre datos adicionales y tiempo de la exploración se debe cuidadosamente considerar.</li>
</ol> 4. Separación vertebral Nota: el tiempo es 20-30 min por ejemplo.
<ol><li>Contorno de la vértebra de interés, como se muestra en la Figura 3A-I. Asegúrese de incluir todas las partes de la vértebra y excluyendo las partes que pertenecen a las vértebras adyacentes.
	<ol><li>Clic en &#34; programa de evaluación de µCT &#34; y seleccionar la muestra en el menú de.</li>
		<li>Contorno de cada rebanada con el mouse.</li>
		<li>Uso el &#34; Z &#34; bar para ir a la rebanada siguiente.</li>
	</ol></li> <li>Guardar la vértebra contorneada como un archivo independiente ( figura 3J -K) haciendo clic en &#34; archivo &#34; &#8594; &#34; GOBJ guardar &#34; cada par de rebanadas.</li></ol>
 5. definición del VOI para evaluación cuantitativa Longitudinal Nota: los pasos siguientes dependen de si el análisis es desde el día 1 después de la cirugía (vértebra de referencia) o desde el momento posterior puntos ( blanco las vértebras).
<ol><li>Vértebra referencia. 
	Nota: El momento es de 20-30 minutos por muestra.
	<ol><li>Z-rotación, medir el ángulo de los márgenes con un segmento XY desde el centro del defecto ( Figura 4A -B).
		<ol><li>En el plano Z, ir a la zona de la vértebra donde el defecto es más claro y la pantalla captura la vértebra.</li>
			<li>En un software de presentación, preparar un objeto con forma de rectángulo que cabe en el defecto.</li>
			<li>Girar la imagen de la vértebra que el defecto esté orientada hacia arriba y los márgenes del defecto son paralelos a los lados del rectángulo.</li>
			<li>Medir el ángulo de rotación (haga clic en la imagen &#8594; &#34; formato de imagen &#34; &#8594; &#34; tamaño &#34;).</li>
			<li>Utilice el ángulo medido para rotar la vértebra ( figura 4).
			<ol><li>Abrirá una nueva ventana de DECterm (&#34; Session manager &#34; &#8594; &#34; aplicaciones &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;).</li>
				<li>Run &#34; ipl &#34;:</li>
				<li>Ipl &#62; turn3d</li>
				<li>-entrada [en] &#62;</li>
				<li>-salida [out] &#62;</li>
				<li>-turnaxis_angles [0.000 90,000 90.000] &#62; 90 90 0</li>
				<li>-turnangle [0.000] &#62; ángulo medido</li>
				<li>-img_interpol_option [1] &#62;</li></ol>
			</li></ol></li> <li>Para rotación, medir el ángulo de los márgenes con una YZ-slice desde el centro del defecto ( figura 4 -E). Use el ángulo medido para girar la vértebra ( figura 4F).
		<ol><li>Clic en &#34; YZ &#34; en &#34; programa de evaluación de producto &#34; y repita los pasos 5.1.1.1-5.1.1.5.2.</li>
			<li>Ipl &#62; isq</li>
			<li>-aim_name [en] &#62;</li>
			<li>-isq_filename [default_file_name] &#62; Introduzca el directorio de archivo ISQ (p. ej., &#34; DK0: [MICROCT. DATOS. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ &#34;)</li> <li>-pos [0 0 0] &#62;</li> <li>-dim [-1 -1-1] &#62;</li></ol></li> <li>tapa la vértebra rotada al cambiar el plano XY al plano ZX.
		<ol><li>Abrirá una nueva ventana de DECterm (&#34; Session manager &#34; &#8594; &#34; aplicaciones &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;).</li>
			<li>Run &#34; ipl &#34;:</li>
			<li>Ipl &#62; flip</li>
			<li>-entrada [en] &#62; hacia fuera</li>
			<li>-entrada [fuera] &#62; out2</li>
			<li>-new_xydir [yz] &#62; zx</li></ol>
		</li> <li>Definir el VOI.
		Contorno de <ol><li>dibujar una circular del defecto utilizando un segmento desde el centro del defecto seleccionando el icono de contorno circular en &#34; programa de evaluación de producto &#34; ( figura 6A). Copia que contorno y pegar en todos los sectores en el defecto ( Figura 6B). 
			Nota: Puesto que todos los defectos fueron creados usando el mismo procedimiento, analizar el mismo número de rodajas y, posteriormente, el volumen total (TV) para todas las muestras de.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Vértebra objetivo. 
	Nota: El momento es de 10-20 minutos por muestra.
	Archivos de <ol><li>carga el DICOM de la blanco y las vértebras de la referencia a la ventana principal del software de análisis de imagen. 
		Nota: Evitar los cambios de valor de escala de grises, definir el mismo tipo de salida datos como los archivos originales de DICOM en el menú de carga.</li>
		<li>Registro de la referencia de la vértebra.
		<ol><li>Lanzamiento el &#34; registro Voxel 3D &#34; módulo y la vértebra de referencia como el &#34; volumen Base &#34; y la vértebra de destino como la &#34; partido volumen. &#34; haga clic en &#34; registro &#34; para registrar las vértebras ( Figura 5).</li>
		</ol></li> <li>Salvar el fichero registrado utilizando los mismos datos tipo e importación a un entorno de µCT.</li>
		<li>Aplicar el VOI.
		<ol><li>Aplicar el VOI definido para la vértebra de la referencia a la vértebra destino registrado haciendo clic en &#34; programa de evaluación del producto &#34; &#8594; &#34; archivo &#34; &#8594; &#34; GOBJ de carga &#34; y seleccionando la GOBJ previamente creado. Compruebe que la VOI y defecto son concéntricos.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 6. Análisis MicroCT Nota: la sincronización es 10-20 minutos por muestra.
<ol><li>Enviar el VOI para la evaluación del uso de un programa de evaluación de µCT ( figura 6). 
	Nota: Asegúrese de utilizar los mismos parámetros al analizar los VOIs. Asegúrese de que el umbral es suficientemente alto como para omitir el ruido de fondo con pérdida mínima de hueso. Si se utiliza un biomaterial radiopaco, podría utilizarse una serie de estrategias para analizar la formación de hueso. Si hay una diferencia en densidad entre el biomaterial y el hueso el tejido, el biomaterial podría segmentarse a 35 , 36. De lo contrario, los investigadores podrían evaluar cualitativamente las diferencias en la formación ósea entre los grupos experimentales.</li>
</ol> 7. Eutanasia <ol><li>lugar la rata osteoporótica en la cámara de inducción conectado a una máquina de anestesia. Inducir la anestesia con isoflurano de 5% en oxígeno al 100%.</li>
	<li>Mantener la anestesia mediante el cono de la nariz y realizar la eutanasia mediante la incisión de la cavidad torácica para producir un neumotórax bilateral 37.</li>
</ol>

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</ol>

Esta investigación fue apoyada por una beca del Instituto de California de medicina regenerativa (CIRM) (TR2-01780).

La osteoporosis es la causa más frecuente de las fracturas de compresión vertebral causada por una carga mayor sobre la columna vertebral y que resultan en el colapso del cuerpo vertebral. Sin embargo, es prácticamente imposible generar una lesión en un roedor que auténticamente Replica similar colapso vertebral. En cambio, los investigadores crean un vacío cilíndrico en el centro del cuerpo vertebral para imitar OVCFs16,17,18<s...

Más de 200 millones de personas en todo el mundo sufren de osteoporosis1. Patológico subyacente disminución de la densidad mineral ósea (DMO) y microarquitectura ósea alterada aumentar la fragilidad del hueso y, consecuentemente, el riesgo relativo de fractura2. La osteoporosis es tan frecuente y nocivo para la salud que la OMS ha definido una preocupación de salud pública importante. Además, como la población mundial se espera que a la edad, osteoporosis se espera llegar a ser aún más común.
Las fracturas de compresión vertebrales osteoporóticas son las fracturas más comunes de fragilidad, estimadas en más de 750.000 al año en los Estados Unidos. Se asocian con morbilidad significativa y tanto como una mortalidad mayor de nueve veces la tarifa3. En los ensayos clínicos, actualmente disponibles intervenciones quirúrgicas, como la vertebroplastia y cifoplastia, fueron encontradas para no ser más eficaz que un impostor tratamiento4,5, dejando sólo el tratamiento del dolor disponible para estos pacientes. Puesto que los tratamientos actuales de OVCF son limitados, es imprescindible para el desarrollo de un modelo animal que puede replicar el desorden6,7,8. Tales modelos animales podrían facilitar la investigación de los métodos actuales de tratamiento y el desarrollo de nuevas terapias que se traducirá en la práctica clínica. La osteoporosis ha sido inducida y sostenido en animales modelo mediante la administración de una dieta baja en calcio (LCD) en conjunto con ovariectomía1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. para modelar aún más la pérdida de hueso asociada con OVCFs, defectos óseos vertebrales se establecieron en las ratas inmunocompetentes 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. En este trabajo se presenta un modelo de defecto vertebral de immunocompromised ratas con osteoporosis modelada. Este nuevo modelo puede utilizarse para evaluar terapias celulares con células de diferentes fuentes y especies para la reparación de fracturas difíciles, tales como OVCFs.
La proyección de imagen del hueso es una parte crucial de la evaluación de fracturas y enfermedades óseas. Métodos de proyección de imagen avanzados fueron desarrollados para la evaluación precisa de cambios óseos estructurales y de estrategias de regeneración25. Entre ellos, la proyección de imagen µCT ha surgido como un método no invasivo, de fácil de usar y de bajo costo que ofrece imágenes 3D de alta resolución. La proyección de imagen µCT tiene varias ventajas sobre otras modalidades en la evaluación de pacientes de osteoporosis, ya que ofrece alta resolución 3D osea microarquitectura26 que luego pueden ser analizadas cuantitativamente. Este último puede entonces utilizarse para comparar los efectos terapéuticos de tratamientos propuestos. De hecho, en vivo µCT la proyección de imagen es un estándar de oro para la regeneración de defectos vertebrales monitoreo1,16,27. Sin embargo, algunas publicaciones28,29,30,31 han empleado herramientas de registro automatizado para minimizar la dependencia del usuario, sesgo de interpolación y error de precisión de µCT Análisis basado en la proyección de imagen. Recientemente, fuimos los primeros en utilizar un procedimiento de registro para mejorar el análisis de la regeneración ósea en un hueso estandarizado vacío, como se explica en este protocolo32 .
El método aquí descrito se puede utilizar para estudiar el efecto de terapias celulares nuevos para OVCFs, unhindered por host respuestas de células T que pueden rechazar las células alogénicas o xenogeneicos. La osteoporosis es inducida en ratas jóvenes a través de la ovariectomía (OVX) y 4 meses de un LCD. La edad de las ratas OVX, combinado con la pantalla LCD, nos permitió alcanzar una masa ósea pico baja, imitando la osteoporosis postmenopáusica conduciendo a la pérdida ósea irreversible. Esto puede explicarse en parte por el hecho de que, en la pantalla LCD y alrededor de 3 meses de edad, la transición de las ratas del hueso modelado para remodelación de la fase en la vértebras lumbares33, aumentando así la probabilidad de mantener la osteoporosis tiempo. Utilizando animales jóvenes hace que este modelo más rentable, como cuestan menos. Sin embargo, está limitada por intrínsecamente no son responsables de los cambios biológicos en el animal de envejecimiento.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>MWI Salud Animal, Pasadena, CA</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>BetadineSolution</td><td>MWI Salud Animal, Pasadena, CA</td><td>4677</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de clorhexidina 2% exfoliante</td><td>MWI Salud Animal, Pasadena, CA</td><td>510083</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico 70% cuarto</td><td>MWI Salud Animal, Pasadena, CA</td><td>501044</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>MWI Salud Animal, Pasadena, CA</td><td>26357</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/mL</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>56163</td><td></td></tr><tr><td>Ratas desnudas atímicas ovariectomizadas</td><td>Harlan Laboratories, Indianápolis, IN</td><td>Hsd:RH-Foxn1 rnu</td><td></td></tr><tr><td>Alimento bajo en calcio</td><td>Newco Distributors, Inc., CA 1814948</td><td>(5AV8 AIN-93M con bajo contenido de calcio)</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies Corporation</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>Dermabond</td><td>J AND J ETHICON</td><td>DHVM12</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>Patterson Scientific</td><td>TEC 3EX</td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de inducción con tapa deslizante</td><td>Patterson Scientific</td><td>78917833</td><td></td></tr><tr><td>ProStation Estación de trabajo calefactada</td><td>Patterson Scientific</td><td>78914731</td><td></td></tr><tr><td>paño quirúrgico</td><td>HALYARD HEALTH INC</td><td>89101</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de retracción del fijador magnético</td><td>Fine Science Tools, Inc., CA</td><td>18200-50</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección, 10 cm, curvadas, SS</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris, 11,5 cm, 45 &deg; Ángulo, dentado, afilado/afilado</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td></td> Pinzas 503225<td></td></tr><tr><td>, n.º 5</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>555048FT</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pinzas Hemostáticas para Mosquitos</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>503360</td><td></td></tr><tr><td>Gasa de algodón estéril</td><td>Medtronic, MINNEAPOLIS, MN</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>Lanzas de absorción - Montadas/estériles</td><td>Fine Science Herramientas, CA</td><td>18105-01</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 1 mL</td><td>TERUMO TERUMO MED</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Aguja, calibre 25</td><td>BD MED SYS INYECCIÓN SYS</td><td></td><td></td></tr> 305127 <tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>Baker</td><td>SterilGARD e3-Clase II Tipo A2 Cabina</td><td></td>de bioseguridad</tr> Unidad <tr><td>de cauterio térmico</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td></td> 501292 <td></td></tr><tr><td>Microtaladro OmniDrill115/230V</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Trefinas para Micro Taladro, 2 mm de diámetro</td><td>Fine Science Tools, CA</td><td>18004-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl sin teñir 27" SH taper</td><td>J AND J ETHICON</td><td>1663G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethilon negro 18" Corte convencional PC3</td><td>J AND J ETHICON</td><td>1954G</td><td></td></tr><tr><td>Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40)</td><td>Scanco Medical</td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>SCANCO Medical paquete de software de sistemas microCT</td><td>Scanco Medical</td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>Analyze software</td><td>Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN</td><td>Analyze 12</td><td>Software de análisis</td></tr><tr><td>de imágenes Veterenery eye opomada</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

semiautomatizado longitudinal basado en la tomografía microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura vertebral relacionada con la osteoporosis

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Las fracturas de compresión vertebrales relacionadas con la osteoporosis (OVCFs) son una necesidad común y clínicamente no satisfecha con el aumento de prevalencia como las edades de la población de mundo. Modelos OVCF animales son esenciales para el desarrollo preclínico de estrategias de ingeniería de tejido traslacional. Mientras que en la actualidad existe un número de modelos, este protocolo describe un método optimizado para la inducción de defectos vertebrales altamente reproducibles múltiples en una sola rata desnuda. Una tomografía de la novela microcomputed semiautomatizado longitudinal (µCT)-basado en análisis estructural cuantitativa de los defectos vertebrales también se detallan. Brevemente, las ratas fueron reflejadas en múltiples puntos de tiempo post operatorio. La exploración de día 1 fue reorientada a la posición estándar y se define un volumen de interés. Exploraciones posteriores µCT de cada rata fueron registradas automáticamente para la exploración del día 1 por lo que el mismo volumen de interés entonces se analizaron para evaluar para la nueva formación del hueso. Este enfoque versátil adaptable a una variedad de otros modelos donde análisis longitudinal basado en la proyección de imagen podrían beneficiarse de una alineación exacta 3D. semiautomatizada. Tomados en conjunto, este protocolo describe un sistema fácilmente cuantificable y fácilmente reproducible para la investigación de la osteoporosis y del hueso. El protocolo sugerido toma 4 meses para inducir osteoporosis en ratas ovariectomizadas desnudas y entre 2,7 y 4 h para generar, de la imagen y analizar dos defectos vertebrales, dependiendo del tamaño del tejido y el equipo.

Mediante este protocolo, una imagen y cuantificar la regeneración de n = 8 defectos vertebrales osteoporóticas modeladas a través de diferentes puntos temporales. La coincidencia anatómica obtenida por el procedimiento de registro permite el análisis del misma VOI todos los puntos de tiempo. Esto resulta en un análisis histomorfométrico 3D longitudinal altamente preciso, incluso cuando ya no son reconocibles los márgenes del defecto original. Utilizamos cinco puntos de tiempo (día 1, sema...

El objetivo de este protocolo es generar un modelo de fractura de compresión vertebral relacionada con la osteoporosis rata desnudo que puede ser evaluados longitudinalmente en vivo usando un microcomputed semiautomatizado basado en tomografía cuantitativa análisis estructural.

Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

El objetivo general de este modelo quirúrgico y del método de análisis de imágenes es observar el efecto de su tratamiento en un modelo preclínico de fractura por compresión vertebral relacionada con la osteoporosis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa glial, como cuál podría ser un tratamiento eficaz para las fracturas por compresión vertebral relacionadas con la osteoporosis, y cómo ayudaría dicho tratamiento en la regeneración ósea. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza ratas desnudas, por lo que los tratamientos novedosos pueden evaluarse in vivo sin preocupaciones por rechazo inmunológico.Además, la regeneración ósea que subyace a este método aquí presentado es semiautomatizada, por lo que es más precisa y depende menos del usuario que los métodos publicados previamente. El procedimiento será demostrado por la Doctora Wafa Tawackoli, científica investigadora de nuestro laboratorio. Primero, induzca anestesia en una rata osteoporótica utilizando isoflurano al 5 % en oxígeno al 100 %, luego transfiera a una máscara nasal con isoflurano al 2-3 % para el mantenimiento.Afeite el área abdominal utilizando una afeitadora eléctrica. Pase un antiséptico a base de yodo en gluconato de clorhexidina al 0,5 % seguido de etanol al 70 %. Aplique una pomada veterinaria en los ojos para prevenir la sequedad durante la anestesia.Aplique un estímulo de presión en el dedo del pie para asegurar un plano de anestesia adecuado. Si no se observa respuesta, inicie el procedimiento. Coloque la rata anestesiada en posición recumbente dorsal sobre una almohadilla calefactora ajustada a 37 grados Celsius y extienda las extremidades utilizando un sistema de retracción con fijador magnético.Inyecte al rato subcutáneamente con carprofeno antes de comenzar el procedimiento quirúrgico. Después de hacer una incisión de cinco a ocho centímetros en la piel, comenzando un centímetro por debajo del proceso xifoides y a través de la línea media, use tijeras quirúrgicas para realizar una incisión en la aponeurosis a través de la línea alba para acceder a la cavidad abdominal. Exponga la cavidad abdominal utilizando separadores. Desplace los intestinos hacia el lado derecho de la rata para exponer la aorta abdominal y el riñón izquierdo. Para evitar la deshidratación, use gasas estériles humedecidas para envolver los órganos internos. Utilice retractores adicionales según sea necesario para exponer la aorta.Palpe la columna lumbar y luego proceda a exponerla. Utilice termocauterio para exponer la cara anterior de los cuerpos vertebrales lumbares L4 a L5 y aíslelos del tejido conectivo y los músculos circundantes. Utilice un hisopo de algodón para eliminar la sangre y los tejidos residuales de la vértebra L4.A continuación, utilice una broca estéril de dos centímetros de diámetro para hacer un defecto óseo de cinco milímetros de profundidad en el centro de la cara anterior expuesta del cuerpo vertebral. Aplique la mínima presión necesaria para perforar únicamente la cortical ventral y el hueso trabecular subyacente. Evite perforar a través de la cortical dorsal.Luego, taladre las vértebras L5 de la misma manera para crear dos defectos por rata. Una vez finalizado el taladrado, devuelva los intestinos a la cavidad abdominal y retire los retractor. A continuación, utilice sutura quirúrgica sintética absorbible de vicryl en patrón continuo para suturar la aponeurosis.Cierre la piel utilizando una sutura monofilamento de nailon no absorbible 4-0 en un patrón simple interrumpido. Luego, aplique 100 microlitros de adhesivo tópico para la piel encima y entre las suturas cutáneas para asegurar el cierre completo de la piel. Después de inyectar al ratón solución de Ringer con lactato a 37 grados Celsius para prevenir hipotermia y deshidratación, y buprenorfina para alivio del dolor postoperatorio, permita que el animal se recupere de la anestesia sobre una almohadilla térmica.Al día siguiente del procedimiento quirúrgico, induzca anestesia con isoflurano como antes. Escanee la rata utilizando un escáner micro-CT in vivo. Después del escaneo y la recuperación de la anestesia, devuelva la rata a su jaula de alojamiento.Para separar los datos de las vértebras para su análisis, haga clic en el programa de evaluación de micro-TC y seleccione la muestra del menú. Luego, use el ratón para delimitar individualmente cada vértebra en una sección. Utilice la barra Z para ir a la siguiente sección y delinee las vértebras individuales de la misma manera.Guarde la vértebra contorneada como un archivo independiente haciendo clic en archivo, guardar GOBJ cada par de cortes. Luego, después de establecer la vértebra de referencia, impórtela a un entorno de micro-TC. Aplique el VOI definido para la vértebra de referencia a la vértebra diana registrada haciendo clic en el programa de evaluación de micro-TC, archivo, cargar GOBJ y seleccionando el GOBJ creado previamente.Finalmente, envíe el VOI para su evaluación utilizando un programa de evaluación de micro-TC. Esta imagen 3D frontal muestra una imagen representativa del defecto vertebral un día después de la creación del defecto. La formación ósea en el vacío se indica en rojo.Esta es una imagen sagital 2D de la misma zona, y finalmente una imagen axial 2D. Como se observa aquí, la formación ósea ocurre con el tiempo y se detecta mediante imágenes longitudinales. Se calculó la densidad del volumen óseo y la densidad aparente, y se compararon utilizando un ANOVA de dos vías con medidas repetidas y corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples.Como se observa aquí, la densidad de volumen óseo y la densidad aparente aumentan significativamente a partir de las dos semanas posteriores a la creación del defecto vertebral. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la histología e inmunohistoquímica para responder preguntas adicionales, como qué células están presentes y qué proteínas se expresan en el defecto. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear múltiples defectos vertebrales en ratas desnudas y analizar la regeneración ósea a lo largo del tiempo en estos defectos.

semiautomated-longitudinal-microcomputed-tomography-based

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un examen longitudinal de la pérdida ósea en los fémures y tibias de ratones adultos se llevó a cabo después de una lesión de la médula espinal utilizando secuencial de dosis baja de rayos X de los análisis. La pérdida de hueso tibia se detectó durante todo el estudio, mientras que la pérdida ósea en el fémur no se detectó hasta 40 días después de la lesión.

Evaluación longitudinal de ratón posteriores pérdida de masa ósea del miembro después de una lesión de la médula espinal utilizando Novel, En vivo Metodología

Aunque los modelos de ratón son herramientas invaluables para la ingeniería de tejidos óseos, los modelos de defectos de huesos largos son escasos. Esta necesidad motivó el desarrollo del presente protocolo, que utiliza una placa de bloqueo con cuatro tornillos y una plantilla específica para realizar y estabilizar un defecto femoral, reproducible, de tamaño crítico y de baja morbilidad.

Establecimiento de un defecto segmentario Modelo femoral de tamaño crítico en ratones estabilizado por osteosíntesis Plate

Este documento indica a los usuarios de escáneres de tomografía micro computada (µCT) en vivo cómo anestesiar, correctamente la posición y sujetar las extremidades de una rata para el mínimo movimiento durante la proyección de imagen de alta resolución de la tibia. El resultado es imágenes de alta calidad que pueden ser procesados para cuantificar con precisión la microarquitectura ósea.

Posicionamiento adecuado y la contención de una rata de extremidades para la proyección de imagen enfocada de alta resolución del hueso utilizando la microarquitectura In Vivo Micro-tomografía computada

Presentamos un flujo de trabajo para segmentar y cuantificar los huesos trabeculares para imágenes 2D y 3D basados en el límite exterior del hueso utilizando un plugin de ImageJ. Este enfoque es más eficiente y preciso que el actual enfoque de contorno de mano manual y proporciona cuantificaciones capa por capa, que no están disponibles en software comercial actual.

Límite exterior asistida por segmentación y cuantificación de huesos Trabecular por un Imagej Plugin

Aquí, presentamos un protocolo para fracturar iatrogénicamente el eje del fémur de ratas albinas Wistar y hacer un seguimiento del desarrollo del callo. Este modelo de osteotomía de fémur puede ayudar a los investigadores a evaluar el proceso de curación de fracturas y a estudiar cómo un medicamento podría influir en la curación de fracturas.

Protocolo para el desarrollo de un modelo de osteotomía de fémur en ratas albinas Wistar

La microtomografía computarizada (μCT) es una herramienta de imagen no destructiva que es fundamental para evaluar la estructura ósea en estudios preclínicos, sin embargo, existe una falta de consenso sobre los procedimientos de μCT para analizar el callo de cicatrización ósea. Este estudio proporciona un protocolo de μCT paso a paso que permite el seguimiento de la cicatrización de fracturas.

Evaluación de la cicatrización de fracturas óseas mediante microtomografía computarizada

Este protocolo presenta un método económico y eficiente para la evaluación cuantitativa de la microarquitectura ósea en un modelo murino de osteoporosis mediante la combinación de técnicas de tinción de hematoxilina-eosina (HE) y microtomografía computarizada (Micro-CT).

Evaluación de la microarquitectura ósea trabecular en un modelo murino de osteoporosis

El protocolo muestra la construcción de un modelo de entrenamiento simple y rentable con soporte de peso en ratas para la osteonecrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides utilizando cinta terapéutica elástica.

Modelo de soporte de peso libre de tensión de osteonecrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides en ratas

Presentamos un método para analizar una región de interés (ROI) definida por el usuario en un modelo longitudinal de defecto radial in vivo en rata. Este método permite el análisis comparativo entre diferentes andamios previamente limitados por las variaciones en el campo de visión de la tomografía microcomputarizada (μCT), la orientación de la muestra y la presencia basal del andamio.

Análisis de imágenes de tomografía microcomputarizada longitudinal para la región de interés definida por el usuario en defectos óseos de tamaño crítico

Proponemos un protocolo para evaluar la regeneración ósea en varios niveles jerárquicos. Este enfoque multimodal permite el análisis estructural a diferentes escalas de longitud, abordando eficazmente los desafíos en la preparación de la muestra. También proporciona un flujo de trabajo fiable para evaluar la eficacia de los biomateriales en la promoción de la regeneración ósea.

Enfoque multimodal para evaluar la regeneración ósea y el rendimiento en andamios

Aprende a crear fracturas vertebrales en ratas desnudas osteoporóticas y analiza la regeneración ósea mediante tomografía microcomputarizada semiautomatizada longitudinal. Este método permite evaluar tratamientos preclínicos sin rechazo inmunológico.

Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis (Video) | JoVE Journal

Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis

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