Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

Este manuscrito describe protocolos estándar para la medición de la hiperfosforilación de tau, medición de enlace de tau a los microtúbulos y la localización de tau intracelular después de tratamientos con fármacos. Estos protocolos pueden utilizarse repetidamente para la detección de drogas u otros compuestos que enlace la hiperfosforilación o microtúbulos tau.

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la fosforilación de tau, la capacidad de unión a los microtúbulos de tau y la localización de tau, utilizando microscopía confocal en células de cáncer colorrectal. Este método puede ser eficaz para la mayoría de los campos de investigación biológica, especialmente la investigación del cáncer y la demencia, donde la fosforilación y la unión de microtúbulos son factores importantes. La principal ventaja del ensayo de fosforatasa presentado es que proporciona una manera fácil de percibir la fosforilación completa de las muestras de proteínas.

La principal ventaja del ensayo de unión a microtúbulos es que es un procedimiento simple para separar las proteínas de unión a microtúbulos de las fracciones no vinculantes. Sin embargo, los principales beneficios de la técnica de localización de tau es que requiere una cantidad relativamente pequeña de anticuerpos primarios y secundarios. Para comenzar este procedimiento, prepare todos los reactivos como se describe en el protocolo de texto.

Transfiera aproximadamente un millón de células HCT 116 a placas de cultivo que contengan un medio esencial mínimo suplementado con 10 % de suero fetal bovino y 1 % de estreptomicina de penicilina. Cuando las células alcancen el 65% de confluencia, utilice un aspirador para eliminar el medio suplementado con FBS. Luego, agregue MEM sin suero, que contenga curcumina o cloruro de litio.

Incubar a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de esto, lave las celdas con 10 mililitros de PBS helado. Agregue un mililitro de PBS helado y luego use un raspador de celdas para raspar las celdas y transferirlas a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.

Centrifugar durante cuatro minutos a 1800 veces G y cuatro grados Celsius. Suspendemos los gránulos de células en 100 microlitros de tampón RIPA completo a cuatro grados centígrados durante 20 minutos, asegurándonos de golpear los tubos con regularidad para lisar las células. A continuación, sonicar brevemente las muestras a una amplitud del 10%, pulsando durante 0,2 segundos y apagándolas durante 0,2 segundos, durante un total de 2 segundos.

Centrifugar la célula homogeneizada a 22, 570 veces G y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos marcados y luego mida la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford, como se describe en el protocolo de texto. Después de preparar muestras que contengan 20 microgramos de proteína total, agregue dos microlitros de tampón de fosfatasa alcalina y 10 microlitros de fosfatasa alcalina a cada uno.

A continuación, añade agua destilada, de forma que el volumen final de cada muestra sea de 20 microlitros. Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante una hora. Mientras se incuban las muestras, prepare muestras adicionales a la misma concentración, pero sin fosfatasa para comparar.

Después de una hora, detenga la reacción agregando EDTA a una concentración final de 50 milimolares u ortovanadato de sodio a una concentración final de 10 milimolares. Agregue el tampón de carga de gel 4XSDS recién preparado que contiene 400 milimolares de DTT. Usando un bloque de calor, incube las muestras a 100 grados centígrados durante cinco minutos.

Agite las muestras y luego déjelas enfriar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. A continuación, cargue 13 microlitros de muestra por pocillo, así como la escalera de peso molecular en un gel de poliacrilamida al 10%. Conecte el sistema de electroforesis a una fuente de alimentación y ajuste el voltaje a 70 voltios durante 20 minutos para mover las muestras de proteínas del gel de apilamiento al gel de resolución.

Después de esto, aumente a 125 voltios y haga funcionar el gel durante aproximadamente 70 a 120 minutos hasta que las muestras y la escalera de proteínas lleguen al final del gel. Usando un sistema de electrotransferencia húmeda, transfiera el gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno a 100 voltios durante aproximadamente 100 minutos. A continuación, incubar la membrana para secar en albúmina sérica bovina al 4% durante 90 minutos a temperatura ambiente.

Incubar la transferencia durante la noche en una solución primaria de anticuerpos a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lave la mancha tres veces en PBST, lavándola durante siete minutos cada vez. Incubar en la solución de anticuerpos secundarios insegura durante 90 minutos a temperatura ambiente.

Luego, lave con PBST cuatro veces y cada lavado dure siete minutos. Revele la mancha utilizando un kit de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cubra la mancha revelada con una envoltura de plástico transparente y, a continuación, adquiera imágenes de quimioluminiscencia de la mancha con un sistema de imágenes de quimioluminiscencia disponible en el mercado.

Después de preparar muestras frescas, incubarlas a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Ultracentrifugar las muestras a 100.000 veces G y 25 grados Celsius durante 60 minutos. A continuación, transfiera 120 microlitros de cada sobrenadante que contenga tau no unido a tubos separados, limpios y etiquetados.

Agregue 120 microlitros de tampón de muestra Fibic al pellet que contiene tau unido. Después de mezclar bien, mediante vórtice y pipeteo, transfiera la mezcla a tubos limpios y etiquetados. Después de preparar muestras de concentración de proteína equivalente, agregue tampón de carga de gel 4XSDS fresco que contenga 400 milimolares de DTT.

Utilice un bloque de calor para incubar las muestras a 100 grados centígrados durante cinco minutos. Agite las muestras y luego déjelas enfriar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Cargue 13 microlitros de muestra por pocillo y la escala de peso molecular en un gel de poliacrilamida al 10%.

Conecte los electrodos positivo y negativo del sistema de electroforesis a una fuente de alimentación y luego ajuste el voltaje a 70 voltios durante 20 minutos. Después de esto, aumente a 125 voltios y haga funcionar el gel durante aproximadamente 70 a 120 minutos hasta que las muestras y la escalera de proteínas lleguen al final del gel. Use un sistema de electrotransferencia húmeda para transferir el gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno a 100 voltios durante aproximadamente 100 minutos.

Incubar la membrana para secar en albúmina sérica bovina al 4% durante 90 minutos a temperatura ambiente. Luego, incubar durante la noche en una solución primaria de anticuerpos a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave la mancha cuatro veces con PBST y cada lavado dura siete minutos.

Incubar la mancha lavada en la solución de anticuerpos secundaria correspondiente durante 90 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave con PBST durante siete minutos repitiendo el lavado un total de cuatro veces. Revele la mancha con un kit de quimioluminiscencia.

Cubra con una envoltura de plástico transparente y adquiera imágenes utilizando un sistema de imágenes de quimioluminiscencia. Para comenzar, coloque los cubreobjetos en los pocillos de una placa de cubierta de tejido de seis pocillos y luego siembre 250.000 células en cada pocillo en el medio de cultivo recomendado. Después de 24 horas, enjuague las células dos veces con PBS.

Agregue MEM sin suero, que contenga curcumina e incube a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada que contenga 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de esto, vuelva a lavar las celdas con PBS helado. Fije las células en formaldehído al 3,7% en una incubadora a 37 grados centígrados, en la oscuridad.

Lave las celdas con PBS y luego fije las celdas en metanol helado a 20 grados centígrados durante 15 minutos. Después de esto, incube las células en hielo en 3%BSA y 0.1%Triconex 100 en PBS durante 10 minutos. Lave las células con PBS y luego incube en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.

A continuación, agregue 60 microlitros de solución de anticuerpos primarios a la pieza de fluoruro de polivinilideno cortada en cada pocillo. La colocación de los cubreobjetos de manera que las células entren en contacto con la solución de anticuerpos. Incubar durante la noche a 4 grados centígrados en una cámara oscura y húmeda.

Al día siguiente, lave las celdas cuatro veces con PBS. Agregue 80 microlitros de la solución de anticuerpo secundario a cada una de las piezas de fluoruro de polivinilideno, colocando los cubreobjetos de manera que las células entren en contacto con la solución de anticuerpos. Incubar en una cámara oscura y húmeda a temperatura ambiente durante dos horas.

Después de esto, lave las células cuatro veces con PBS. Monte las muestras en el medio de montaje con DAPI y, a continuación, fije los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio. Luego incubar en una cámara oscura a temperatura ambiente durante una hora y media.

Con un microscopio confocal, examine los portaobjetos. En este estudio, la fosforilación específica de tau se evalúa utilizando un anticuerpo fosfo-tau. Se observa que las células tratadas con curcumina expresan una disminución de tau a medida que aumenta la concentración de curcumina.

Por otro lado, se observa que la expresión de fosfo-tau aumenta a concentraciones más bajas de curcumina, disminuyendo solo a concentraciones muy altas. A continuación, se examinan las células tratadas con cloruro de litio. Como se puede observar, la expresión tanto de tau como de fosfo-tau disminuye significativamente bajo el tratamiento con cloruro de litio.

A continuación, se evalúa la fosforilación general mediante un ensayo de fosfotasa. Se observa que la tau migra más rápido en las muestras tratadas con fosfatasa en comparación con la muestra de control no tratada, lo que indica que la muestra de control está fosforilada. Las muestras de células tratadas con curcumina mostraron resultados muy similares, lo que indica que las líneas celulares de cáncer colorrectal del tratamiento no redujeron la fosforilación de tau.

Tanto las muestras tratadas con fosfatasa como las no tratadas electroforizaron casi el mismo rango en las muestras de células tratadas con cloruro de litio, lo que indica una reducción en la fosforilación de tau. A continuación, se establece con éxito el ensayo de unión microtubular de muestras celulares utilizando tau 352 como control positivo. Como se muestra aquí, tanto el tratamiento con curcumina como con baja concentración de cloruro de litio da como resultado una inhibida de la actividad de unión de microtúbulos.

A continuación, se realiza una microscopía confocal. Después del tratamiento con curcumina, se observa que la tau se transloca al núcleo. Esto respalda estudios anteriores, que informan que la tau nuclear es un actor clave en la protección del ADN neuronal.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de fosfatasa para determinar la fosforilación completa de las muestras de proteínas y cómo realizar un ensayo de unión a microtúbulos. Debería ser capaz de averiguar cómo ejecutar un ensayo de inmunofluorescencia mediante microscopía confocal utilizando varias cantidades más pequeñas de anticuerpos. Los procedimientos presentados aquí son rentables y potencialmente ayudarán en el descubrimiento y desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para tratar diferentes tipos de cáncer y tau-forese.