Name: Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a grabar la plasticidad sináptica en rebanadas hipocampales agudas usando un sistema de perfusión reciclada con carbogenación. Este método estabiliza los niveles de oxígeno para registros electrofisiológicos de larga duración en neurociencia.

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W.W. realizó, analizados y había diseñado los experimentos y escribió el manuscrito. D.X. y C.P. ayudó en la preparación de la figura y llevado a cabo los experimentos. Este trabajo fue apoyado por NSFC (31320103906) y 111 (B16013) en T.B.

Los animales fueron mantenidos según las normas de cuidado de los animales y los procedimientos de los institutos de ciencia del cerebro y el estado clave de laboratorio médico Neurobiología de la Universidad de Fudan, Shanghai, China.
1. preparación de la solución
Nota: Consulte la tabla de materiales.
<ol>
	<li>Preparar el buffer de corte (solución de Gey modificado): 92 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 25 mM de glucosa, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-piruvato, 10 mM MgSO4y 0,5 mM de CaCl2.</li>
	<li>Ajustar el pH a 7,6 con 1 M NaOH sin carbogenation.</li>
	<li>Almacenar el buffer a 4 ° C. Nota: La valoración clarifica el líquido nublado. La osmolalidad es 305-310 mOsm. El carbogen21 contiene 5% de dióxido de carbono y el 95% de oxígeno.</li>
	<li>Preparar la aCSF diluyendo un 10 x solución de aCSF que no contienen bicarbonato y glucosa, dando una composición final: 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM de MgCl2y 1,25 mM KH2PO4.</li>
	<li>Añadir bicarbonato y glucosa para llegar a 10 mM glucosa y 26 mM NaHCO3.</li>
	<li>Carbogenate la aCSF a través de un tubo de silicona perforada con un extremo bloqueado inmediatamente después de agregar el NaHCO3.</li>
	<li>Medir el pH mientras que carbogenating (pH 7.3-7.4). Nota: La capacidad tampón puede ajustarse ligeramente alterando la cantidad de NaHCO3. Puesto que el pH resultante depende de la temperatura, es necesario comprobar el pH resultante mientras carbogenating en la temperatura de trabajo (por ejemplo, 30 ° C).</li>
</ol>
2. preparación de rebanadas Hippocampal agudas
Nota: Consulte la tabla de materiales.
<ol>
	<li>Coloque una malla de retención de rebanada en una cámara de incubación para rebanadas de cerebro agudo, llene la cámara con la aCSF y carbogenate (4-6 L/h) para por lo menos 30 min22 a 28-30 ° C.</li>
	<li>Enfriar los instrumentos quirúrgicos hasta 2-4 ° C.</li>
	<li>Coloque un vaso de vidrio llenado de agua fría y carbogenated corte tampón (2-4 ° C), en una mezcla de hielo y agua, cerca el vibratome.</li>
	<li>Anestesiar las ratas o los ratones hasta que desaparezcan de los reflejos corneales (30-50 s) utilizando isoflurano teniendo 500 μL en un frasco de vidrio de 2 L o 12.5 μL en un tubo de 50 mL.</li>
	<li>Aislar el cerebro usando un método descrito y visualizar en detalle en las publicaciones de Mathis et al. (2011) 23 y Yuanxiang et al. (2014) 24.</li>
	<li>Enfriar el cerebro hasta 2-4 ° C en un búfer de corte helado (para al menos 2 minutos) antes de cerebelo de disección y separación de los hemisferios.</li>
	<li>Utilice una hoja quirúrgica fría para diseccionar un pedazo de la corteza dorsal en un ángulo de 70° en el borde dorsal de cada hemisferio25 para obtener rodajas transversales de la ventral y la parte intermedia del hipocampo, como se muestra en la figura 1C y E.</li>
	<li>Con una espátula de cemento dental frío, transferencia de un hemisferio a un pedazo de papel de filtro para secar brevemente la superficie creada (s 1-2).</li>
	<li>Monte los dos hemisferios con superficies recién cortadas sobre la plataforma helada de corte con pegamento adhesivo de acción rápida; tienen el extremo caudal de la cara de hemisferios la hoja de afeitar (figura 1D).</li>
	<li>Coloque la plataforma de corte en la cámara de refrigeración de un vibratome y llenar esa cámara con el tampón de corte (2-4 ° C). Carbogenate utilizando un tubo de silicona perforada.</li>
	<li>Cortar rodajas de μm 350 vibratome adecuados parámetros (por ejemplo, velocidad de avance hoja: 1,2 mm/s, amplitud de la lámina: 1 mm).</li>
	<li>Aislar la formación hipocampal del subiculum y las cortezas entorrinal mediante dos cánulas de inyección (&#62; 28 G) como tijeras.</li>
	<li>Quite las burbujas de la malla de retención de rebanada de la cámara de incubación previamente preparados, utilizando una pipeta Pasteur.</li>
	<li>La transferencia de los sectores que tienen cierta transparencia en el pyramidale del estrato de la plataforma de corte de la malla de la cámara de incubación. Evitar cualquier plegable, estiramiento, superposición y flotante por aCSF y la rebanada de aspiración con una pipeta Pasteur de boca grande. Nota: Todo el procedimiento (paso 2.5-2.14) puede tomar 5-10 min; por lo tanto, es importante comprobar la temperatura de la solución tampón en el tiempo para mantener a 4 ° C.</li>
	<li>Incubar las rebanadas a 30 ° C al menos 1.5-2 h en la sala de incubación y proporcionar carbogen en 4-6 L/h. Nota: Ajuste el caudal de carbogen circular el búfer en la incubadora, pero evitar que las rodajas flotando.</li>
</ol>
3. las modificaciones de la Carbogenation de la aCSF reciclaje de pequeños embalses
<ol>
	<li>Agregar un conector de 3 vías tubo a la salida del sistema de reciclaje (figura 2B).</li>
	<li>Conectar el brazo medio del conector de 3 vías tubo con un tubo de suministro de carbogen y regular el caudal con un medidor de flujo de aire (3-4 L/h,D , figura 2y figura 4C).</li>
	<li>Agregar un segundo conector de 3 vías tubo a la entrada del sistema de reciclaje. Conectar el brazo medio al tubo hacia el calentador en línea, el brazo a un tubo de silicona delgada (10 cm de longitud) y el brazo inferior del tubo de entrada de la reserva (filtro de paso bajo; Figura 4 C).</li>
	<li>Coloque un exprimidor de tubo en un tubo de silicona delgada (OD: 2 mm) en una posición a lo largo del tubo donde la pulsación de la aCSF en la cámara de corte, generada por la bomba peristáltica, está en su mínimo. Nota: El carbogenation de salida (salida-carb.) modificación reduce la sensibilidad del nivel carbogenation para el volumen del embalse del aCSF, la aCSF tasa de reciclaje y tubo relativa posiciones dentro aCSF pequeños embalses (&#60; 50 mL; Figura 3). Sobre el filtro de paso bajo, una cierta cantidad de aire en el tubo de silicona fino reduce la pulsación de la corriente de la aCSF; así, el tubo debe llenarse con aire.</li>
</ol>
4.Grabación de las respuestas sinápticas en una cámara de corte de inmersión
Nota: Consulte la tabla de materiales.
<ol>
	<li>Precaliente la aCSF solución en un baño de agua a unos 28-30 ° C (Esto evitará la formación de burbujas en la cámara de grabación).</li>
	<li>Iniciar el sistema de reciclaje (4-5 mL/min) y activar el calentador en línea para equilibrar el sistema durante al menos 1 h.</li>
	<li>Remojo un pedazo pequeño de papel y una malla de nylon fijado en un alambre de platino en forma de U en la cámara de corte sumersión durante unos minutos (figura 4) de limpieza de lentes.</li>
	<li>Quite el alambre de platino en forma de U.</li>
	<li>Apague el reciclaje y coloque una rebanada en el papel de limpieza de lentes.</li>
	<li>Inmediatamente Coloque la malla de retención de rebanada encima de la rebanada, encender la bomba y dejar el segmento equilibre durante 30 min sin el objetivo de inmersión en la aCSF.</li>
	<li>La micropipeta de borosilicato (es decir, el electrodo de la grabación) se llenan de aCSF (punta de resistencia: 1-2 MΩ, llena 1/3 con aCSF) y montar en el soporte de pipeta.</li>
	<li>Compruebe el aislante del electrodo de estimulación metal colocando en la solución de NaHCO3 (&#62; 40 mM). Conecte el electrodo al polo negativo de un generador de voltaje de DC (1-2 V, polo positivo: alambre de plata o platino) y observar la formación de burbujas en la punta de un microscopio de disección (&#62; 60 aumentos).</li>
	<li>Coloque el electrodo de estimulación probado tungsteno aislamiento de epoxi manipulador y la referencia de los cables en la cámara del sector.</li>
	<li>Añada un segundo electrodo de referencia a la cámara y conéctela a la toma de referencia de la headstage del electrodo de la grabación (figura 4A).</li>
	<li>En el software de control de amplificador, haga clic en la casilla de "modo cero abrazadera" y continuar haciendo doble clic en la casilla "output gain lista". Elegir una ganancia de "100", haga doble clic en el "paso alto filtro cuadro de lista (Bessel)," elegir "0.1 Hz" y haga doble clic en el "paso bajo filtro cuadro de lista (AC)" para elegir "3 kHz."</li>
	<li>En el software de grabación, haga clic en el sobre "adquisición | Abrir protocolo." Elegir un protocolo que tiene posiciones permitiendo estímulos episódicos y la digitalización de potenciales amplificados en 10-20 kHz para 50-100 ms y desencadena automáticamente un aislador de estímulo 10 ms después del comienzo de una grabación episódica.</li>
	<li>Coloque la estimulación y electrodos de registro en línea y paralelo al pyramidale del estrato, por ejemplo (figura 4B y figura 5).</li>
	<li>Haga clic en "adquirir | Editar el protocolo"y elija la ficha"gatillo"(en la ventana emergente). Haga clic en la caja de "fuente del disparador" y elegir "barra espaciadora" como la fuente del disparador. Haga clic en el botón "OK". Haga clic en el botón "grabar" para iniciar la compra y observe la ventana emergente con un botón de disparo.</li>
	<li>En el estímulo aislador software, haga clic en la casilla de "control de la tensión" y escriba "0". Haga clic en el botón "Descargar". Haga clic en la ventana "software de grabación" y presiona la barra espaciadora. Repita este ciclo introduciendo secuencialmente los valores de 1 a 8, por ejemplo, en pasos de 1 mV en la caja de "control de la tensión".</li>
	<li>La fuerza del estímulo se correlacionan con valores de pendiente fEPSP y determinar la fuerza de la estimulación necesaria para obtener el 40% de la fEPSP-pendiente máxima. Haga clic en la "caja de control de voltaje" e introduzca el valor determinado. Haga clic en el botón "Descargar". Nota: Un aislador de estímulo se utiliza para aplicar tensión breve o pulsos de corriente para el tejido cerebral. Los pulsos bifásicos pueden tener 100 μs por fase.</li>
	<li>En el software de grabación, haga clic en el botón stop y luego en el menú de "Adquirir". Haga clic en protocolo de"Editar" y seleccione la ficha "gatillo" en la ventana emergente. Haga clic en la caja de la fuente de disparo y eligió el "temporizador interno" como la fuente del disparador. Haga clic en el botón "OK". Haga clic en el botón de grabación que se inicia la grabación automática de los potenciales de campo cada 30 s, por ejemplo. Haga clic en el botón "stop" después de 30-60 min.</li>
	<li>Haga clic en el menú de "Adquirir", haga clic en "Protocolo abierto", elija el protocolo de inducción deseado de plasticidad sináptica y haga clic en el botón "OK". Haga clic en el botón de "grabar" para activar automáticamente la alta frecuencia estimulación y registro. Haga clic en el botón "stop". Nota: En caso de estudios de plasticidad sináptica, aplicar uno de los paradigmas de inducción estándar para potenciación a largo plazo o depresión a largo plazo después de la grabación inicial prolongada. Ejemplos representativos de la modulación resultante de la transmisión sináptica se representan en la figura 7 y figura 8.</li>
	<li>En el software de grabación, haga clic en "adquirir | Abra el protocolo"y seleccione el mismo protocolo como en el paso 4.12. Haga clic en el botón "Aceptar" y haga clic en "registro". Mantenga el funcionamiento automáticamente las grabaciones del campo potencial para 2-4 h, por ejemplo. Haga clic en el botón "stop" para finalizar la grabación.</li>
	<li>En el caso de estudios farmacéuticos, aplique el compuesto directamente a la aCSF depósito si es permanente administración compuesta deseado (figura 6).</li>
</ol>
5. limpieza de la instalación y consejos
Nota: Ver abajo para consejos generales.
<ol>
	<li>Limpiar el sistema semanal de reciclaje 10% H2O2 para no más de 20 min, seguido de lavado con desionizada H2O. Nota: Etanol no se recomienda para la limpieza. Asimismo se recomienda no sumergir los cables de referencia y objetivo en H2O2.</li>
	<li>Retire la sal precipitada en la superficie de la lente del objetivo o alrededores de cámara con 0.1 N HCl y agua.</li>
	<li>Lave el borboteador carbogen en agua destilada o 0.1 N HCl.</li>
	<li>Sumergir la cámara de incubación de la rebanada en el 10% H2O2 durante 5 minutos una vez por semana y luego enjuague bien la cámara de incubación con desionizada H2O.</li>
	<li>En caso de electrodos de estimulación metal, enjuague la punta del electrodo estimulante con agua desionizada después de cada experimento y suavemente Limpie la punta del electrodo estimulante con una bola de algodón empapada con etanol para eliminar tejido residual.</li>
	<li>Reducir la resistencia de los electrodos de estimulación metal comercial eliminando el aislamiento en el extremo a través de un golpe cuidado con papel de lija.</li>
	<li>Reducir la pérdida de carbogen de la aCSF reciclaje a través de los tubos mediante la sustitución de los tubos de silicona con tubos de politetrafluoretileno.</li>
	<li>Mantenga los cables de plata de la grabación de electrodo y electrodo de referencia en lejía durante varios días para formar AgCl en la superficie del alambre.</li>
</ol>

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<li>Shetty, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Synaptic+Tagging%2FCapture+and+Cross-capture+using+Acute+Hippocampal+Slices+from+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Du, H., Lin, J., Zuercher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+efficiency+of+CO2+injection+into+seawater+by+a+venturi+than+a+conventional+diffuser+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour+Technol%22%5BJournal%5D)">Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system.</a> Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).</li>
<li>Weinman, J., Mahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Analysis+of+Electrical+Properties+of+Metal+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Electron+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes.</a> Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).</li>
<li>Fanselow, M. S., Dong, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+the+dorsal+and+ventral+hippocampus+functionally+distinct+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures.</a> Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+BDNF-gene+transcripts+with+short+3%27+UTR+in+hippocampal+CA1+neurons+improves+memory+formation+and+enhances+synaptic+plasticity-relevant+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways.</a> Neurobiol Learn Mem. , (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.

Aunque cámaras de rebanada de interfaz exhiben más sólidas respuestas sinápticas25,26,27,28, cámaras de inmersión proporcionan comodidad adicional para la grabación de la abrazadera del remiendo y de la fluorescencia proyección de imagen. Así, hemos descrito algunos aspectos de posibles grabaciones de campo en rebanadas hippocampal agudas usando una cámara de corte de inmersión comercial que pu...

En 1951, los experimentos de rebanada cerebral aguda registrados primero fueron realizados1. En 1971, después de éxito en vitro las grabaciones de la corteza piriforme2,3 y el descubrimiento que las neuronas hippocampal están interconectadas transversalmente en el eje septotemporal del hipocampo4, uno de los primeras grabaciones en vitro de la actividad neuronal hippocampal fue alcanzado5. La similitud de los parámetros neurofisiológicos o neurostructural de las neuronas bajo condiciones en vivo y en vitro son todavía objeto de un debate6, pero en 1975, Schwartzkroin7 indica que la basal propiedades de las neuronas se mantienen en vitro y esa estimulación de alta frecuencia (es decir, tetanization) de aferentes en la formación hipocampal induce una facilitación de larga duración de los potenciales sinápticos8. Electrofisiológica de la actividad neuronal en vitro ampliado en gran medida el estudio de los mecanismos celulares de la plasticidad sináptica dependiente de actividad9,10, que había sido descubierto en 1973 por Bliss et al. 11 en vivo experimentos con conejos.
El estudio de la actividad neuronal o la señalización de vías en rebanadas de cerebro y especialmente en rebanadas hippocampal agudas, es ahora una herramienta estándar. Sin embargo, sorprendentemente, en vitro experimentos han estar estandarizados, como lo demuestran los múltiples enfoques que existen para la preparación y mantenimiento de rebanadas hippocampal agudas. Reid et al. (1988) 12 repasa los desafíos metodológicos para el mantenimiento de rebanadas cerebrales agudas en diferentes tipos de cámaras de la rebanada y las opciones de baño nivel medio, pH, temperatura y oxígeno. Estos parámetros son todavía difíciles de controlar en la cámara de grabación debido a los elementos por encargo en vitro rebanada-grabación configuraciones. Pueden encontrar publicaciones que podría ayudar a superar algunos de los retos metodológicos y describen nuevos tipos de cámaras de rebanada de inmersión, como un sistema intersticial microperfusion 3D del13, una cámara con mejor flujo laminar y oxígeno de la fuente14, un sistema con control de temperatura computarizado15y un sistema de grabación multi cámara16. Ya que estas cámaras no son fáciles de construir, mayoría de los científicos se basan en cámaras de corte disponibles en el mercado. Estas cámaras pueden montarse en un sistema de microscopio, permitiendo la combinación de electrofisiología y de fluorescencia de imagen17,18,19. Puesto que estas cámaras guardar las rebanadas de cerebro sumergidas en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF), un alto flujo de la solución tampón debe mantenerse, aumentar el gasto de uso de la droga. Para ello, hemos incorporado un sistema de perfusión reciclaje con carbogenation de salida que proporciona la estabilidad suficiente para la grabación a largo plazo de los potenciales de campo en una cámara de corte de inmersión usando un volumen relativamente pequeño de la aCSF. Además, resumimos cómo el uso de este sistema experimental carbogenation/perfusión afecta el resultado de la plasticidad sináptica dependiente de actividad10 y cómo la inhibición de la cinasa del factor 2 de elongación eucariotas (eEF2K) modula sináptica transmisión20.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes> reactivos requeridos</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reactivo químico Sinopharm, China</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reactivo químico Sinopharm, China</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Reactivo químico Sinopharm, China</td><td>10017618</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &punto medio; 6H2O</td><td>Reactivo químico Sinopharm, China</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Reactivo químico Sinopharm, China</td><td>10005861</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sinopharm Reactivo químico, China</td><td>10018960</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Reactivo químico Sinopharm, China</td><td>10010518</td><td></td></tr><tr><td>NaH2 PO4</td><td>Reactivo químico Sinopharm, China</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma</td><td>A4043</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Reactivo químico Sinopharm, China</td><td>20025118</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Reactivo químico Sinopharm, China</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas y materiales para la disección</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decapitadores</td><td>Aparato Harvard</td><td>55-0012</td><td>para la decapitación de ratas</td></tr><tr><td>Tijeras de vendaje</td><td>SCHREIBER</td><td>12-4227</td><td>para decapitación de ratón</td></tr> cuchilla <tr><td>de doble filo</td><td>Flying Eagle, China</td><td>74-C</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras IRIS</td><td>RWD, China</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>Bone Rongeurs</td><td>RWD, China</td><td>S22002-14</td><td></td></tr><tr><td>Cuchara</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 152-13</td><td></td></tr><tr><td>espátula de cemento dental</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 016-15</td><td></td></tr><tr><td>excavadora dental de doble extremo</td><td>Blacksmith Surgical, EE. UU.</td><td>BS-415-017</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo vibratorio</td><td>Leica, Alemania</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>cuchilla quirúrgica&nbsp;</td><td>RWD, China</td><td>S31023-02</td><td></td></tr><tr><td>soporte quirúrgico</td><td>RWD, China</td><td>S32007-14</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipos y materiales de electrofisiología</fuerte></td>Vertical Extractor de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetas</td><td>Narishige, Japón</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aislamiento de vibraciones</td><td>Meirits, Japón</td><td>ADZ-A0806</td><td></td></tr><tr><td>grabación de tipo sumergido Cámara</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador de 4</td><td>ejes Sutter, EE. UU</td>. <td>MP-285, MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de platino</td><td>World Precision Instruments</td><td>PTP406</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices, EE. UU.</td> Sistema de adquisición de datos <td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dispositivos moleculares, EE. UU.</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Anaysis software</td><td>Molecular Devices, EE. UU.</td> Microscopio de fluorescencia <td>Clampex 10.2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon, Japón</td> Fuente de luz <td>LED FN1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lumen Dynamics Group, Canadá</td><td>X-cite 120Micropipetas LED</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aparato Harvard</td><td>GC150TF</td><td>registro extracelular</td></tr><tr><td>Micropipetas de borosilicato</td><td>Sutter, EE. UU</td>. <td>BF150-86</td><td>pinza de parche</td></tr><tr><td>electrodo de tungsteno</td><td>A-M Systems, EE. UU.</td><td>575500</td><td></td></tr><tr><td>bomba peristáltica</td><td>más larga, China</td><td>BT00-300T</td><td></td></tr><tr><td>tubos para bomba peristáltica</td><td>ISMATEC, Wertheim, Alemania</td><td>SC0309</td><td>1x caudal de entrada, ID: 1,02 mm</td></tr><tr><td>tubos para bomba peristáltica</td><td>ISMATEC, Wertheim, Alemania</td><td>SC0319</td><td>2x tubos para salida, ID: Cámara CCD de 2,79 mm</td></tr><tr><td></td><td>PCO, Alemania</td><td>pco.edge sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>papel de limpieza de lentes</td><td>Tubo</td> de centrífuga cónico Kodak <td></td><td></td></tr><tr><td>de 50 ml</td><td>Precámara 339652</td><td></td><td></td>Thermo scientific</tr><tr><td></td><td>Calentador en línea Warner Instruments</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>Controlador</td><td>de temperatura SF-28</td><td></td>de <td>Warner Instruments</td></tr><tr><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Aunque los experimentos en rebanadas de cerebro han estado en uso desde 1951, siguen existiendo problemas que reducen la probabilidad de lograr un análisis acertado y estable de la modulación de la transmisión sináptica al realizar grabaciones intracelulares o potenciales del campo. Este manuscrito describe aspectos metodológicos que pueden ser útiles en la mejora de las condiciones experimentales para el mantenimiento de rebanadas cerebrales agudas y para la grabación de potenciales postsinápticos excitatorios de campo en una cámara de inmersión disponibles en el mercado con una unidad de salida carbogenation. La carbogenation de la salida ayuda a estabilizar el nivel de oxígeno en los experimentos que se basan en el reciclaje de un depósito tampón pequeño para mejorar la rentabilidad de experimentos con drogas. Además, el manuscrito presenta experimentos representativos que examinan los efectos de la carbogenation diferentes modos y paradigmas de estimulación de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la transmisión sináptica.

En la sección de protocolo, nos describe la preparación de aguda rebanadas hippocampal de la parte intermedia y ventral de la formación hipocámpica (figura 1) de ratones C57BL/6 machos y ratas Wistar macho (5-8 semanas). La posición de los hemisferios en la plataforma de la máquina de cortar ayuda a mantener estable y elimina la necesidad de estabilización con agar o agarosa. El sistema de perfusión se basa en una bomba peristáltica en alta rotación para dar ...

Este protocolo describe la estabilización del nivel de oxígeno en un pequeño volumen de tampón reciclado y aspectos metodológicos de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la grabación en rebanadas hippocampal agudas sumergidas.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método que asegure un medio simplificado de carbogenación del ACSF de reciclaje en pequeños volúmenes y lograr grabaciones prolongadas de potenciales de campo utilizando una cámara de registro montada en un microscopio de fluorescencia. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de las neuroplasticidades relacionadas con las vías ligninas subyacentes que regulan la transmisión sináptica y la formación de la memoria en un modo celular del aprendizaje y los recuerdos. La principal ventaja de esta técnica es que ayuda a estabilizar el nivel de oxígeno en un pequeño reservorio biológico, mejorando así la eficiencia de costos de los experimentos que utilizan antagonistas o agonistas específicos.La preparación de cortes agudos del hipocampo es demostrada por los estudiantes de doctorado, Xia y Weiguang, de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, utilice una hoja quirúrgica fría para diseccionar un fragmento del cortex dorsal en un ángulo de 70 grados a lo largo del borde dorsal de cada hemisferio. Con una espátula de cemento dental fría, transfiera cada hemisferio a un trozo de papel de filtro para secar brevemente la superficie.Monte las dos hemisferios con superficies recién cortadas sobre la plataforma de corte fría con hielo utilizando pegamento adhesivo de acción rápida, de modo que el extremo caudal de los hemisferios quede orientado hacia la cuchilla de afeitar. A continuación, coloque la plataforma de corte dentro de la cámara de enfriamiento de un vibrátomo. Llene la cámara con tampón de corte a dos o cuatro grados Celsius y carbogenícelo.A continuación, corte secciones de 350 micrómetros utilizando ajustes adecuados del vibrotomo. Aísle la formación del hipocampo del subículo y las cortezas entorrinales utilizando dos cánulas de inyección como tijeras. Retire las burbujas de la malla portasecciones de la cámara de incubación previamente preparada usando una pipeta de Pasteur.Luego, transfiera las secciones que presentan cierta transparencia en el estrato piramidal desde la plataforma de corte hacia la malla de la cámara de incubación utilizando una pipeta Pasteur de gran boca. En este paso, agregue un conector de tubo de tres vías a la salida del sistema de reciclaje. Conecte el brazo central del conector de tubo de tres vías a un tubo de suministro de carbógeno y regule el caudal mediante un medidor de flujo de aire.A continuación, agregue un segundo conector de tubo de tres vías a la entrada del sistema de reciclaje. Conecte el brazo central al tubo que va hacia el calentador en línea, el brazo superior a un tubo de silicona delgado y el brazo inferior al tubo de entrada proveniente del depósito. Luego, coloque un prensatubos en un tubo de silicona delgado en una posición a lo largo del tubo donde la pulsación del ACSF en la cámara de cortes generada por la bomba peristáltica sea mínima.Ahora, remoje previamente un pequeño trozo de papel para limpieza de lentes y una malla de nailon fijada en un alambre de platino en forma de U en la cámara de inmersión durante unos minutos. Después, retire el alambre de platino en forma de U. Apague la recirculación y coloque un corte en el papel para limpieza de lentes.Luego, coloque inmediatamente la malla que sostiene el corte sobre el mismo. Encienda la bomba y deje que el corte se equilibre durante 30 minutos sin sumergir el objetivo en ACSF. Mientras tanto, llene el electrodo de registro con ACSF y colóquelo en el porta-pipetas.Verifique el aislamiento del electrodo de estimulación metálico colocándolo en una solución de bicarbonato de sodio. Conecte el electrodo al polo negativo de un generador de voltaje de corriente continua y observe la formación de burbujas en la punta bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, coloque el electrodo de tungsteno con aislamiento apóxico ya probado en el soporte del manipulador y el alambre de referencia en la cámara para secciones.Agregue un segundo electrodo de referencia a la cámara y conéctelo al enchufe de referencia del cabezal del electrodo de registro. En el software de control del amplificador, haga clic en el cuadro del modo de fijación a cero, luego haga doble clic en el cuadro de lista de ganancia de salida. Seleccione una ganancia de 100, haga doble clic en el cuadro del filtro de paso alto, elija tres kilohercios y haga doble clic en el cuadro de lista del filtro de paso bajo CA para seleccionar 0,1 hercio.En el software de registro, haga clic en adquirir, abrir protocolo. Elija un protocolo que tenga configuraciones que permitan estimulaciones episódicas y la digitalización de potenciales amplificados a 10-20 kilohercios durante 50-100 milisegundos y que active automáticamente un aislador de estímulo 10 milisegundos después del inicio de un registro episódico. Coloque los electrodos de estimulación y registro en línea y paralelos al estrato piramidal.Posteriormente, haga clic en adquirir, editar protocolo y seleccione la pestaña de activación en la ventana emergente. Haga clic en el cuadro de fuente de activación y elija la barra espaciadora como fuente de activación. Luego, haga clic en el botón aceptar y en el botón grabar para comenzar la adquisición.En el software del aislador de estímulos, haga clic en el cuadro de control de voltaje e ingrese cero. Haga clic en el botón de descarga. A continuación, haga clic en la ventana del software de grabación y presione la barra espaciadora.Repita este ciclo ingresando secuencialmente valores desde 1000 hasta 8000. Correlacione la intensidad de estimulación con los valores de la pendiente del FEPSP y determine la intensidad de estimulación necesaria para obtener el 40 % de la pendiente máxima del FEPSP. Haga clic en el cuadro de control de voltaje e ingrese el valor determinado.A continuación, haga clic en el botón de descarga. En el software de grabación, haga clic en el botón de detener y luego en el menú adquirir. Haga clic en editar protocolo y seleccione la pestaña de activación en la ventana emergente.A continuación, haga clic en el cuadro de fuente de disparo y seleccione el temporizador interno como fuente de disparo. Haga clic en el botón aceptar, seguido del botón de grabación, que inicia la grabación automática de potenciales de campo cada 60 segundos. Haga clic en el botón de detención después de 30 a 60 minutos.En el software de registro, haga clic en adquirir, abra el protocolo y seleccione el mismo protocolo que el registro de línea base. Haga clic en el botón aceptar y luego haga clic en grabar. Continúe ejecutando automáticamente las grabaciones de potenciales de campo durante dos a cuatro horas.Cuando finalice, haga clic en el botón de detención para terminar la grabación. Esta figura muestra grabaciones representativas de la potenciación dependiente de la actividad en la transmisión sináptica utilizando carbogenación de flujo saliente y carbogenación del depósito con reciclaje de un pequeño reservorio de ACSF. La potenciación se indujo después del punto cero mediante tres trenes de 100 hercios por segundo.Esta figura muestra que la carbogenación del flujo de salida con reciclaje de un pequeño reservorio de ACSF mejoró la inducción de la DTM en comparación con experimentos con carbogenación del reservorio únicamente. Una vez dominada, la preparación del corte puede realizarse en cinco a diez minutos y se puede obtener también una grabación estable de potenciales de campo durante varias horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante ajustar el nivel de carbogenación, la velocidad de perfusión, la posición de los electrodos y el estímulo de estrés de su equivalencia específica.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el registro de parche, la microscopía forense, con el fin de responder preguntas adicionales, como la virilización de la localización celular de las sondas de ravin en respuesta a la inducción de la plasticidad sináptica dependiente de la actividad. Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la neuroplasticidad exploren la plasticidad sináptica dependiente de la actividad como un mecanismo celular del aprendizaje y la memoria en cortes hipocampales in vitro de ratones transgénicos y bien caracterizados genéticamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la preparación aguda de cortes del hipocampo temporal y de cómo obtener condiciones estables para el registro a largo plazo de las transmisiones sinápticas utilizando un pequeño volumen de ACSF reciclado.No olvide que trabajar con animales y compuestos químicos puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y la desinfección adecuada al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Neurociencia

En este artículo se describen los procedimientos para la preparación de rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas del cerebro asociadas con el envejecimiento y relacionadas con la edad las enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer.

Preparación de la aguda rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas durante el envejecimiento y la patología amiloide

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Investigación de sináptica Tagging / Captura y Cruz de captura utilizando aguda hipocampo rebanadas de Roedores

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Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

Aprende a grabar la plasticidad sináptica en rebanadas hipocampales agudas usando un sistema de perfusión reciclada con carbogenación. Este método estabiliza los niveles de oxígeno para registros electrofisiológicos de larga duración en neurociencia.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión (Video) | JoVE Journal

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

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