Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método que garantice medios simplificados de carbogenación de ACSF reciclado de pequeño volumen y lograr registros a largo plazo de potenciales de campo utilizando una cámara de registro montada en un microscopio de fluorescencia. Este método puede ayudarnos a responder las preguntas clave en el campo de las neuroplasticidades relacionadas con las vías subyacentes de lignina que regulan la transmisión sináptica y la formación de la memoria en un modo celular de aprendizaje y recuerdos. La principal ventaja de esta técnica es que ayuda a estabilizar el nivel de oxígeno de un pequeño reservorio biológico para mejorar la rentabilidad de los experimentos que utilizan antagonistas o agonistas específicos.

La preparación de los cortes agudos de hipocampo es demostrada por los estudiantes de doctorado, Xia y Weiguang de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, use una cuchilla quirúrgica fría para diseccionar una parte de la corteza dorsal en un ángulo de 70 grados a lo largo del borde dorsal de cada hemisferio. Con una espátula de cemento dental frío, transfiera cada hemisferio a un trozo de papel de filtro para secar brevemente la superficie.

Monta los dos hemisferios con superficies recién cortadas en la plataforma de corte helada con pegamento adhesivo de acción rápida para que el extremo caudal de los hemisferios quede frente a la hoja de afeitar. A continuación, coloque la plataforma de corte en la cámara de enfriamiento de un vibrátomo. Llene la cámara con el tampón de corte a dos o cuatro grados centígrados y carbóquela.

Después de eso, corte rodajas de 350 micrómetros con la configuración adecuada de vibrotome. Aísle la formación del hipocampo del subículo y las cortezas entorrinales utilizando dos cánulas de inyección como tijeras. Retire las burbujas de la malla de sujeción de la cámara de incubación previamente preparada con una pipeta pasteur.

A continuación, transfiera las rodajas que tienen cierta transparencia en el estrato piramidal desde la plataforma de corte en la malla de la cámara de incubación con una pipeta pasteur de boca grande. En este paso, agregue un conector de tubo de tres vías al flujo de salida del sistema de reciclaje. Conecte el brazo central del conector de tubo de tres vías a un tubo de suministro de carbógeno y regule el caudal con un medidor de flujo de aire.

Después de eso, agregue un segundo conector de tubo de tres vías a la entrada del sistema de reciclaje. Conecte el brazo central al tubo que mira hacia el calentador en línea, el brazo superior a un tubo delgado de silicona y el brazo inferior al tubo de entrada desde el depósito. A continuación, coloque un exprimidor de tubos en un tubo fino de silicona en una posición a lo largo del tubo en la que la pulsación del ACSF en la cámara de corte generada por la bomba peristólica sea mínima.

Ahora, remoje previamente un pequeño trozo de papel limpiador de lentes y una malla de nailon fijada en un alambre de platino en forma de U en la cámara de corte de inmersión durante unos minutos. Después de eso, retire el alambre de platino en forma de U. Apague el reciclaje y coloque una rebanada en el papel de limpieza de lentes.

Luego, coloque inmediatamente la malla de sujeción de la rebanada encima de la rebanada. Encienda la bomba y deje que la rebanada se equilibre durante 30 minutos sin sumergir el objetivo en ACSF. Mientras tanto, llene el electrodo de registro con ACSF y móntelo en el soporte de pipeta.

Verifique el aislamiento del electrodo de estimulación metálico colocándolo en una solución de bicarbonato de sodio. Conecte el electrodo al polo negativo de un generador de voltaje de CC y observe la formación de burbujas en la punta bajo un microscopio de disección. A continuación, coloque el electrodo de estimulación de tungsteno aislado con apoxi probado en el soporte del manipulador y el cable de referencia en la cámara de corte.

Añada un segundo electrodo de referencia a la cámara y conéctelo a la toma de referencia de la etapa principal del electrodo registrador. En el software de control del amplificador, haga clic en el cuadro de modo de pinza cero, luego haga doble clic en el cuadro de lista de ganancia de salida. Elija una ganancia de 100, haga doble clic en el recipiente de la caja de filtro de paso alto, elija tres kilohercios y haga doble clic en el cuadro de lista de filtros de paso bajo AC para elegir 0,1 hercios.

En el software de grabación, haga clic en adquirir, protocolo abierto. Elija un protocolo que tenga los ajustes que permitan estimulaciones episódicas y la digitalización de potenciales amplificados de 10 a 20 kilohercios durante 50 a 100 milisegundos y que active automáticamente un aislador de estímulos 10 milisegundos después del inicio de una grabación episódica. Coloque los electrodos de estimulación y registro en línea y paralelos al estrato piramidal.

A continuación, haga clic en adquirir, editar protocolo y elija la pestaña del activador en la ventana emergente. Haga clic en el cuadro de la fuente del activador y elija la barra espaciadora como fuente del activador. Luego, haga clic en el botón Aceptar y haga clic en el botón Grabar para iniciar la adquisición.

En el software del aislador de estímulos, haga clic en el cuadro de control de voltaje e ingrese cero. Haga clic en el botón de descarga. A continuación, haz clic en la ventana del software de grabación y pulsa la barra espaciadora.

Repita este ciclo introduciendo secuencialmente los valores de 1000 a 8000. Correlacione la fuerza de estimulación con los valores de la pendiente FEPSP y determine la fuerza de estimulación necesaria para obtener el 40% del máximo de la pendiente FEPSP. Haga clic en el cuadro de control de voltaje e ingrese el valor determinado.

A continuación, haga clic en el botón de descarga. En el software de grabación, haga clic en el botón de parada y luego en el menú de adquisición. Haga clic en editar protocolo y elija la pestaña del activador en la ventana emergente.

Luego, haga clic en el cuadro de la fuente de activación y elija el temporizador interno como fuente de activación. Haga clic en el botón Aceptar, seguido del botón de grabación que inicia el registro automático de potenciales de campo cada 60 segundos. Haga clic en el botón de parada después de 30 a 60 minutos.

En el software de grabación, haga clic en adquirir, abrir protocolo y elija el mismo protocolo que la grabación de referencia. Haga clic en el botón Aceptar y, a continuación, haga clic en Grabar. Siga ejecutando automáticamente las grabaciones de potencial de campo durante dos a cuatro horas.

Cuando finalice, haga clic en el botón Detener para finalizar la grabación. Esta figura muestra los registros representativos de la potenciación dependiente de la actividad de la transmisión sináptica utilizando la carbogenación de salida y la carbogenación del yacimiento con el reciclaje de un pequeño depósito de ACSF. La potenciación fue inducida después del punto de tiempo cero por tres veces 100 hercios por segundo en trenes.

Esta figura muestra que la carbogenación de salida con el reciclaje de un pequeño depósito de ACSF mejoró la inducción de LTD en comparación con los experimentos con carbogenación de yacimiento solamente. Una vez dominado, la preparación del corte se puede realizar en cinco a 10 minutos y también se puede lograr un registro de potencial de campo estable durante muchas horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante ajustar el nivel de carbogenación, la velocidad de perfusión, la posición de los electrodos y el estrés de estimulación de su equivalencia específica.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la pinza de parche, la microscopía forense para responder a las preguntas adicionales como la virilización de la savia, la localización celular de los sondeos de ravin en respuesta a la inducción de la plasticidad sináptica dependiente de la actividad. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la neuroplasticidad exploren la plasticidad sináptica dependiente de la actividad como un modo celular de aprendizaje y memoria en cortes de hipocampo in vitro de genes de ratón transgénicos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la preparación de cortes agudos desde el hipocampo temporal y cómo obtener condiciones estables para el registro a largo plazo de las transmisiones sinápticas utilizando un pequeño volumen de ACSF reciclado.

No olvide que trabajar con animales y compuestos químicos puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y la desinfección adecuada al realizar este procedimiento.