Mejorar la aplicación de la amina de biotinilado dextrano de alto peso Molecular para la proyección de talamocorticales remontar en la rata

El objetivo general de este video es demostrar un protocolo refinado para la aplicación de BDA de alto peso molecular para estudiar el marcaje neuronal óptimo en el sistema nervioso central. Esta medida puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las redes neuronales. Visualizando la estructura de marco del etiquetado neuronal a través de circuitos neuronales.

La principal ventaja de esta técnica es que brinda la oportunidad de iniciar un circuito neuronal local y sus características químicas. Prepare una jeringa de microlitros, equipada con una micropipeta de vidrio, y pruébela extrayendo parafina líquida. Después de anestesiar a la rata utilizando un protocolo aprobado, confirme la anestesia profunda por la ausencia de reacción a un pellizco de cola.

A continuación, afeitar la parte superior de la cabeza del animal con una maquinilla de afeitar eléctrica y frotar el sitio quirúrgico con yodo al 10% de povidona, seguido de etanol al 70%. Asegure a la rata en el dispositivo estereotático insertando barras romas en las orejas y colocando los incisivos superiores de la rata en el soporte de la boca. Aplique un ungüento oftálmico en los ojos.

Use guantes y paños quirúrgicos estériles para mantener las condiciones estériles. Limpie de nuevo la piel de la cabeza del sitio quirúrgico con etanol al 70%. Después de hacer una incisión sagital en la piel con un bisturí, a lo largo de la sutura sagital, use aplicadores estériles con punta de algodón para raspar el músculo y el periostio del cráneo.

Utilizando coordenadas predefinidas de un atlas, determine la ubicación de la craneotomía. Realice una craneotomía con un taladro de rebabas con una broca de punta redonda para perforar hasta una profundidad de aproximadamente un milímetro hasta que las meninges sean visibles. Extirpar la duramadre con micropinzas para exponer la corteza cerebral sobre el lugar de la inyección.

Expulse la parafina líquida de la microjeringa y luego extraiga la solución de BDA al 10%. Monte la jeringa en el aparato de microinyección y conecte la microbomba. Bajo un microscopio estereoscópico, manipule el aparato de microinyección.

Inserte la micropipeta de vidrio llena en el VPM a través de la superficie cortical del cerebro, a una profundidad de 5,8 milímetros. A continuación, utilice la microbomba para inyectar a presión 100 nanolitros de 10% de BDA en el VPM, durante un período de tres minutos. Después de cinco minutos, retire lentamente la pipeta.

Sutura la herida con hilo estéril, luego coloca a la rata en un área de recuperación cálida, hasta que recupere la conciencia y esté completamente recuperada. Después de sacrificar a la rata, use tijeras y fórceps para abrir la cavidad torácica de la rata y acceder al corazón. Inserte un catéter intravenoso en el ventrículo izquierdo, hacia la aorta, y luego abra el pabellón auricular derecho.

En primer lugar, perfundir con solución salina al 0,9% a temperatura fisiológica, durante uno o dos minutos, hasta que la sangre que sale del corazón esté clara. Y luego continuar con 250 a 300 mililitros de paraformaldehído al 4%, en tampón de fosfato 0,1 molar. Post-fijar el cerebro diseccionado en paraformaldehído al 4% durante dos horas a temperatura ambiente.

A continuación, transfiera el cerebro a sacarosa al 30% en PBS de 0,1 molares y crioproteja durante tres días a cuatro grados centígrados. Después de tres días, cuando el cerebro se haya hundido en la solución, divida el cerebro en tres bloques en la dirección coronal con la ayuda de una matriz cerebral. El bloque central contiene el núcleo posteromedial ventral del tálamo en la corteza somatosensorial primaria.

Monte el bloque central del cerebro en la etapa de congelación del micrótomo deslizante para seccionar en el plano coronal y la sección a 40 micras cuando está congelado. Recoja las secciones en un plato de seis pocillos, que contenga 0,1 molar de PBS. Comience a teñir enjuagando las secciones en PBS de 0,1 molares durante aproximadamente un minuto con balanceo.

A continuación, transfiera las secciones a una solución mezclada de estreptavidina-AF594 en una tinción de Nissl fluorescente verde AF500/525 en PBS 0,1 molar que contenga 0,3% de Triton X-100 e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Después de teñir, lavar las secciones tres veces en PB de 0,1 molares con mecedoras. Monte las secciones en los portaobjetos del microscopio utilizando técnicas histoquímicas estándar.

Seque las secciones al aire durante aproximadamente una hora. Aplique 50% de glicerina en agua destilada a las secciones troescentes y cubra el deslizamiento antes de obtener imágenes de los portaobjetos. Esta fotomicrografía representativa muestra el sitio de inyección de BDA en rojo del núcleo posteromedial ventral del tálamo sobre el fondo de la tinción de Nissl verde.

Aquí se muestra el marcaje torescente de BDA, incluidos los axones de talamilo corticol en la capa cuatro y las neuronas talámicas corticales en las capas cinco y seis. A modo de comparación, esta fotomicrografía demuestra que el marcaje convencional de BDA con un procedimiento estándar de peroxidasa de avidina-biotina revela un patrón similar de marcaje neuronal al marcaje de BDA torescente. Esta vista de mayor aumento de una sección rotescente marcada con BDA muestra los árboles axonales marcados anterógradamente en detalle, en rojo.

Aquí se muestra en detalle el cuerpo de la célula neuronal marcado retrógradamente, las dendritas y las espinas dendríticas. Una vez dominada, la craneotomía y la inyección estereotáxica se pueden realizar en 20 a 30 minutos, si se realizan correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar BDA de alto peso molecular para revivir las conexiones neuronales y la estructura detallada del etiquetado neuronal.