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El objetivo general de este ensayo de aversión al cobre basado en el estado nutricional es evaluar la respuesta de los nematodos a una sustancia química adversa y una fuente de alimento durante un período de cuatro horas. Esto permite la evaluación simultánea del estado nutricional. Este método puede ayudar al campo de la neurociencia conductual identificando mutantes que no modulan los patrones locomotores y la respuesta a una sustancia química adversa a pesar de las condiciones de inanición.

La principal ventaja de esta técnica es que puede realizarse durante un período de tiempo prolongado, lo que permite el análisis del estado nutricional a medida que los gusanos se vuelven progresivamente más hambrientos durante cuatro horas. Para preparar los organismos experimentales para el ensayo, seleccione 10 nematodos en etapa L4 por corriente, 24 horas antes de comenzar el ensayo, para garantizar que los organismos sean adultos jóvenes cuando se prueben. Para cada nematodo mutante o de control probado, seleccione 10 L4.

Mantenga los organismos L4, utilizando métodos estándar durante 24 horas en placas de agar estándar sembradas con OP50 E.Coli. 24 horas antes del ensayo, use una regla y un marcador permanente grueso para dibujar una línea en la parte inferior de una placa de medio de crecimiento de nematodos previamente preparada o NGM a lo largo del borde exterior. Marque una barrera de línea central equidistante de cada borde de la placa.

Semebre la placa con 50 microlitros de OP50 E.Coli en un solo lado de la barrera de cobre para crear un césped uniforme. Utilice las líneas marcadas en la parte inferior de la placa para asegurarse de que las bacterias no entren en contacto con la solución de cobre. Asegúrese de que la solución de cobre recorra el borde de la placa y forme una barrera en la línea central y transfiera las bacterias para que la solución de cobre no entre en contacto con la fuente de alimento.

Marque un segundo conjunto de placas sin OP50 E.Coli, para servir como control negativo. Deje que las bacterias se sequen, luego incube las placas a 37 grados Celsius durante la noche. Asegúrese de que las manchas de bacterias no se alteren al transferir los nematodos a un incubador a 37 grados Celsius.

Una perturbación excesiva podría alterar la ubicación o la forma del parche de alimento. Después de la incubación nocturna, retire las placas del incubador y usando la parte inferior marcada de la placa como guía, pipetee 100 microlitros de una solución recién preparada de sulfato de cobre (II) 0,5 molar en el borde del agar, para crear una barrera de cobre externa. Pipetee 25 microlitros de la solución de sulfato de cobre (II) para crear una barrera en la línea central.

Asegúrese de que la solución de sulfato de cobre (II) no entre en contacto con el parche de bacterias y permita que la solución de cobre se seque en la placa. Verifique la sequedad cada cinco minutos después de la transferencia, con un tisú de laboratorio, frotando ligeramente la solución cerca del borde de la placa para discernir. Inmediatamente antes del ensayo, transfiera los organismos experimentales a una placa de agar libre de bacterias y permita que los nematodos se muevan libremente durante un minuto para eliminar el exceso de bacterias.

A continuación, pipetee un mililitro de M9 en la placa con adultos jóvenes, que fueron transferidos 24 horas antes con el fin de lavar los gusanos en un tubo de microcentrifugación. Centrifugue los nematodos a 3, 000 x G durante un minuto. Los gusanos deberían formar un pellet en el fondo del tubo.

Aspire la solución M9 sin alterar el pellet de gusanos. Agregue un mililitro de solución M9 al pellet de gusanos. Invertir el tubo para mezclar los gusanos con la solución.

Si se transfirieron bacterias en exceso inicialmente con los gusanos, repita un total de cinco veces. Después del lavado final, aspire el sobrenadante hasta que queden 100 microlitros de solución M9 y el pellet de gusanos. Transfiera inmediatamente los gusanos de la solución una vez que se hayan completado los lavados.

Pipetee 20 microlitros del pellet de gusanos desde la parte inferior del tubo en la mitad libre de bacterias de la placa de ensayo, asegúrese de que se transfieran 10 gusanos a la placa de ensayo y que no haya comida contaminante presente. No se deben transferir bacterias a las placas de carrera de alimentos de cobre. Retire el exceso de solución M9 de los nematodos con un tisú de laboratorio dentro de un minuto.

Asegúrese de que la solución M9 no entre en contacto con la solución de sulfato de cobre (II) y que los gusanos y la superficie de agar permanezcan intactos. Deseche los gusanos que hayan sido eliminados accidentalmente con el tisú de laboratorio. Una vez que se haya eliminado la solución M9, y todos los gusanos hayan comenzado patrones locomotores no líquidos, es decir, cuando hayan dejado de agitarse.

Inicie el cronómetro del ensayo, si se incluyeron accidentalmente gusanos adicionales, retírelos eligiendo con aceite de halocarbono para asegurarse de que no se agreguen bacterias a la placa. Revise las placas de ensayo cada 30 minutos. Para las placas de ensayo con parches de bacterias, puntúe positivamente a los organismos si alcanzan el parche de alimentos durante un período de cuatro horas.

Para las placas de control negativo, puntúe positivamente a los organismos si han cruzado la barrera. Utilizamos el mutante N2 y npr-9 de pérdida de función y una cepa de sobreexpresión de npr-9, denominada npr-9 gana una función, para evaluar las respuestas a la inanición y la aversión al cobre. Al final del ensayo, el 100% de los organismos de tipo salvaje se reubicaron en la fuente de alimentos, mientras que los organismos de sobreexpresión npr-9 no modularon los patrones locomotores en respuesta al alimento y continuaron cruzando la barrera adversa incluso después de contactar la fuente de alimentos.

En una placa libre de alimentos, los organismos n2 o npr9 de pérdida de función rara vez cruzaban la barrera de cobre, mientras que los nematodos de sobreexpresión npr-9 cruzaban repetidamente la barrera de ida y vuelta. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar alterar la barrera de cobre al transferir nematodos y M9 y también mantener condiciones consistentes para cada cepa para evitar factores de confusión.