Name: Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a determinar la posición cromosómica óptima de elementos de ADN en Escherichia coli mediante inserción aleatoria mediada por transposones, experimentos de competencia y secuenciación del genoma completo.

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Los autores fueron financiados por subvenciones de la Fundación de Novo Nordisk, la Fundación Lundbeck y la Fundación Nacional de investigación danés (DNRF120) a través del centro de respuesta bacteriana al estrés y persistencia (BASP).

1. colección de la biblioteca del Transposon Nota: el locus cromosómico de DARS2 fue clonado en la mini Tn 10-basado transposon, NKBOR (en pNKBOR) 21, resultando en NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR pueden obtenerse en línea 22. pNKBOR es un vector basado en R6K suicida que requiere el π de la proteína del iniciador para replicación 23. Plásmido pJFM1 por lo tanto es capaz de replicar en una cepa de e. coli (por ejemplo, Dh5α λ pir) que contiene una copia cromosómica del gene del pir. Sin embargo, cuando pJFM1 se transforma en el Pir-deficiente wildtype MG1655, pJFM1 no pueden replicar, llevando a la selección de clones resistentes a kanamicina generados por las inserciones aleatorias de NKBOR:: DARS2 en el cromosoma bacteriano. Para simplificar, estas se denominan inserciones DARS2. Vea la figura 1 para una presentación esquemática de la metodología de.
<ol><li>Preparar espectro MG1655 Δ DARS2 de crecimiento de las células en caldo de lisogenia (LB) a 37 ° C 24.</li>
	<li>Electroporate pJFM1 en Δ de espectro MG1655 DARS2, según González et al. 24 <ol><li>agregue 1 μg de pJFM1 (en 1 μl de agua) a 40 μl de espectro MG1655 de e. coli Δ DARS2 y transferir esta mezcla a una cubeta de brecha de 0.2 cm estéril, previamente enfriada. Insertar la cubeta en la cámara de electroporación. Electroporate a 18 kV, Ω 500 y 25 μF; la constante de tiempo debe ser ~5.0 ms, y no hay formación de arcos ocurre.</li>
		<li>Recuperar rápidamente la suspensión bacteriana por resuspender en 1 mL de caldo LB precalentado y transfiéralo a un tubo de ensayo de 15 mL.</li>
		<li>Deje las células recuperar por incubar bajo condiciones de crecimiento aireada a 37 ° C por 30 min, sin la selección antibiótica. Plato de las bacterias en placas de agar LB con kanamicina 50 μg/mL e incubar a 37 ° C durante la noche.</li>
	</ol></li> <li>Contar las colonias de la electroporación: una colonia se considera igual a una inserción del transposón cromosómica. 
	Nota: Las colonias pueden ser contadas por el ojo o con un contador de colonias. El número de colonias es inversamente proporcional a la distancia media que separa los transposones localizados en el cromosoma de cada clon.</li>
	<li>Agregue 1 mL de caldo LB a cada placa y lava todas las colonias, 1 mL de LB caldo debe ser suficiente para lavar ~ 100.000 colonias. Vuelva a usar el mismo 1 mL de caldo LB para aumentar la concentración bacteriana. Piscina de todas las colonias en el mismo tubo de 50 mL.</li>
	<li>Vortex el tubo y el material de inicio (t = 0). Para congelarlo, mezclar 1 mL de la suspensión celular con 1 mL de glicerol al 50% en el hielo. Transferir los tubos para secar hielo durante 10 minutos. Una vez que las culturas son congeladas, transferirlos a un congelador de-80 ° C. 
	Nota: Una concentración de células de un mínimo de 50.000 ufc/mL se espera en este paso.</li>
</ol> 2. Concurso de experimento en libras <ol><li>deshielo la biblioteca transposon de-80 ° C en hielo. Mezclar por pipeteo.</li>
	<li>Transferir 100 μl de la biblioteca del transposon a 10 mL de LB en un tubo de ensayo de 15 mL.</li>
	<li>Crecen las células, aireadas por agitación continua (250 rpm), de 8 h a 37 ° C a la fase estacionaria (es decir, OD 600 = ~ 4.0). Ajustar estos parámetros a diferentes condiciones de crecimiento, según se desee.</li>
	<li>Propagar la población bacteriana por continuos traslados en medio fresco precalentado cada ~ 10 generaciones. Para ello, transferir 10 μl de la cultura de la anterior fase estacionaria a 10 mL de LB fresco y a la fase estacionaria de crecimiento para otro 8 h (es decir, OD 600 = ~ 4.0). 
	Nota: Como la densidad óptica inicial y final son iguales, una dilución de 1,000-fold corresponde a ~ 10 generaciones de crecimiento (2 10 = 1.024). La población bacteriana puede ser propagada directamente en medio fresco precalentado o guardada 0-4 ° C (en hielo) y al día siguiente. LB se utilizó aquí para tantos doblajes celulares en más breve tiempo posible (un tiempo de duplicación cerca de 22 min).</li>
	<li>Después de cada 100 generaciones de la competencia, ahorrar cinco muestras de 1 mL a-80 ° C (como se describe en el paso 3.3).</li>
	<li>Si las diferencias de aptitud entre las células que contienen inserciones de transposones individual se esperan que sean pequeños, tener la duración de la competencia largo; aquí, generaciones 700 (t = 700) fueron utilizados.</li>
</ol> 3. Southern Blot análisis para controlar el experimento en tiempo de competencia <ol><li>prepara la sonda para el Southern blot (sección de 1 kb de la NKBOR) realizando la amplificación de la reacción en cadena (PCR) polimerasa usando las cartillas específicas: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat y NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
	<ol><li>Incubar a 98 ° C por 30 s para desnaturalización inicial. Luego, realizar 35 ciclos a 98 ° C por 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 45 s. Para la extensión final, uso 72 ° C durante 10 minutos 
		Nota: La plantilla para la reacción de PCR fue una de plásmido purificado pNKBOR 21.</li>
		<li>El fragmento resultante de la polimerización en cadena de la etiqueta con [α - 32P] dATP utilizando el sistema de cebador al azar, según Smith 25.</li>
	</ol></li> <li>Preparar la DNA celular total según Løbner-Olesen y von Freiesleben 26 para t = 0 y seleccionado momentos hasta t = 700 Estimado las generaciones de la competencia.</li>
	<li>Digerir el DNA celular total con Pvu, que corta el NKBOR que contiene la región de interés una vez solamente en una región no cubierto por la sonda, 1 unidad de Pvu puedo ser solía totalmente digest 1 μg de substrato ADN. 
	Nota: La sonda reconoce fragmentos que contenían parte de transposones, junto con el ADN cromosómico de diferentes longitudes, dependiendo del sitio de inserción.</li>
	<li>Realizar un Southern blot usando un gel de agarosa al 0,7% según Løbner-Olesen y von Freiesleben 26.</li>
</ol> 4. Identificación de los Clones más aptos <ol><li>gene fácil de uso a pie, según lo descrito por Harrison et al. 27, para identificar los sitios de inserción DARS2 de clones solo (aislados en placas de LB) después de generaciones unas 700 de la competencia; las bandas más en el Southern blot, los más aislados son necesarios para cubrir todas las inserciones de transposones.
	<ol><li>Aislar ADN genómico para plantilla de PCR. Propagación de bacterias en un agar LB con kanamicina 50 μg/mL de la placa e incuban a 37 ° C durante la noche. Crecen solo colonias durante la noche en caldo LB a 37 ° C y posteriormente transferir 20 μl a 200 μL de agua destilada esterilizada (o usar de la purificación de DNA, como en el paso 3.2).
		<ol><li>Vortex para mezclar. Calentar la mezcla a 100 ° C para 10 min y centrifugar a velocidad máxima durante 5 minutos excepto la celda lisada a-20 ° C para su uso futuro.</li>
		</ol></li> <li>Diseño tres cebadores anidados a templar en el transposon de elección (ver figura 2 para una representación gráfica de la estrategia PCR). 
		Nota: Diseñar cebadores anidados debe asegurar que anidado cartilla 3 está más cercana a las conocidas 5 &#39; final de transposones ADN, seguido por Nested Primers 2 y 1. El espaciado entre anidados cartilla 3 y los 5 &#39; final de la t conocidaransposon ADN debería ser suficiente para una lectura a través secuencia de la DNA conocida del ADN desconocido (para encontrar el sitio de inserción del transposón cromosómicos específicos). Para NKBOR se utilizaron los siguientes iniciadores anidados: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg y pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. También se utilizan primers al azar que contienen los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción conocidos. Para asegurar un resultado, uno debe utilizar al menos dos diferentes primers al azar. Los sitios de restricción para las enzimas de restricción (e.g.,Sau 3AI y Hin dIII) deben estar ubicados en los 3 &#39; final y precedido por diez bases al azar así que 5 &#39; - NNNNNNNNNNGATC - 3 &#39; y 5 &#39; - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 &#39; son los iniciadores que contiene un Sau 3AI sitio (GATC) y un Hin dIII (PALINDROMIC), respectivamente, donde N = A, T, G o C.</li>
		<li>Uso 200 ng de ADN genómico en una 20 μl PCR la reacción. Incubar a 98 ° C por 30 s para la desnaturalización de la inicial. Realizar ciclos de 25 a 98 ° C por 30 s, 50 ° C por 15 s y 72 ° C durante 4 minutos. Para la extensión final, use 72 ° C para 10 min uso pares de cartilla de anidar la cartilla 1 y uno de los iniciadores al azar.</li>
		<li>Utilizar pares de cartilla que consta de 2 anidadas de la Primer y la misma cartilla al azar de la amplificación de la segunda, con 1 μl de la reacción anterior como plantilla.</li>
		<li>Repetir paso 4.1.4 con pares de primer consisten en 3 anidadas de la Primer y la cartilla al azar mismo.</li>
		<li>Ejecutar los productos de la reacción final de la PCR en un gel de agarosa al 1.5% y tinción con bromuro de etidio. Cortar una banda en el rango de 100-800 bp y aislar el ADN usando cualquier comercial gel de DNA extracción kit según el fabricante &#39; dirección s. Resuspender el DNA en 15 μl de agua. 
		Nota: PRECAUCIÓN. Bromuro de etidio es tóxico y debe manipularse con cuidado.</li>
		<li>La secuencia de la banda aislada en el paso anterior (paso 4.1.6), con 3 anidadas de la Primer como la cartilla de la secuencia, usando Sanger secuenciación en un proveedor comercial.</li>
	</ol></li> <li>Realizar WGS.
	<ol><li>WGS realizar sobre el total de ADN extraído de seleccionado muestras recolectadas durante el experimento de la competencia, según lo descrito por Frimodt-Møller et al 4.</li>
	</ol></li> <li>Realizar el análisis de secuenciación.
	<ol><li>Lee fin de alinear junto a 150 Ns contiguos a NKBOR, AF310136.1 1.904 &#8230; 2.204 Bowtie2 28 con un intervalo entre subcadenas de semilla (S, 1, 1,15) y un número máximo de caracteres ambiguos (L, 0, 0.9).</li>
		<li>Seleccionar la Lee alineada y luego volver a alinear a ambos ref MG1655 | NC_000913.3 y NKBOR gb | AF310136 usando blastN 29</li> <li>asignar transposición posiciones de inserción en las ensambladuras MG1655-NKBOR.</li>
	</ol></li></ol> 5. Citometría de flujo <ol><li>recoger muestras para citometría de flujo.
	<ol><li>Balance cada cultura por mantener en la fase de crecimiento exponencial durante al menos 10 generaciones. Compruebe el OD 600 y asegúrese de que no exceda 0.3.</li>
		<li>Recoge dos tipos de muestras de flujo.
		<ol><li>De RIF-descentramiento, transfiera 1 mL de cultivo a un tubo de 15 mL que contenga 30 μl de RIF-CEF (300 μg/mL rifampicina y cefalexina de 36 μg/mL disueltos en 12,5 mM NaOH). Dejar a 37 ° C durante un mínimo de 4 h de agitación. 
			Nota: La rifampicina bloquea indirectamente la iniciación de la replicación de cromosomas permitiendo continuas rondas de replicación continúen hasta su finalización. Cephalexin previene la división celular, que resulta en replicación descentramiento (RIF-descentramiento) y la acumulación de células con cromosomas replicados completamente. El número de cromosomas completamente replicados es igual al número de origen en el momento del tratamiento con rifampicina y cefalexina 20.</li>
			<li>Para la muestra de EXP, transferencia 1 mL de la exponencialmente creciente cultura a un tubo de 1,5 mL en hielo.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Fijar las celdas como sigue. La cosecha de las células por centrifugación a 15.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en 100 μl de Tris, pH helada 10 mM 7.5 y añadir 1 mL de etanol al 77% helada. Almacenar las muestras a 4 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Mancha las células como sigue. Cosecha 100-300 μL de células fijas por centrifugación a 15.000 x g durante 15 minutos retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 130 μl de &#34; solución de tinción de DNA &#34; (90 μg/mL mitramicina, 20 bromuro de etidio μg/mL, 10 mM MgCl 2 y 10 mM Tris pH 7.5). Poner las muestras en hielo y en la oscuridad; las muestras están listas para el análisis de citometría de flujo después de 10 minutos 
	Nota: Otros ADN manchas de bromuro de etidio y mitramicina puede también ser utilizado 30 , 31.</li>
	<li>Determinar el origen celular, la masa relativa de la celda y el contenido relativo de ADN por citometría de flujo análisis.
	<ol><li>Realizar citometría de flujo, como se describió anteriormente 32. Ejecutar RIF-descentramiento y EXP-muestras utilizando el citometría de flujo fabricante &#39; instrucciones . Para células con tinción Bromuro etidio y mitramicina, longitudes de onda 395 y 440 nm de excitación y recoger la fluorescencia sobre 565 nm.
		<ol><li>Para determinar el relativa relativo y masa ADN contenido de celda, ejecutar el EXP-las muestras para obtener la dispersión de luz hacia adelante solo-parámetro versus histogramas número celular y la intensidad de fluorescencia versus histogramas número celular para un mínimo de 30.000 eventos correspondiente a la señal de celular.</li>
			<li>La distribución de luz dispersada hacia delante uso de solo-parámetro para medir la relativa promedio celular Massachusetts 
			Nota: La luz dispersada hacia adelante es una medida de la masa celular promedio 20.</li>
			<li>Distribuciones de solo-parámetro de intensidad uso fluorescencia para medir el ADN promedio contenido 20.</li>
			<li>Obtener la concentración de ADN como la relación de medio contenido de ADN a la célula promedio masa 20.</li>
		</ol></li> <li>Determinar el número de orígenes por la célula.
		<ol><li>Muestras de RIF-descentramiento de la gestión para obtener la intensidad de la fluorescencia del solo-parámetro versus celular número histogramas para un mínimo de 30.000 eventos correspondientes a la señal de celular.</li>
			<li>Distribuciones de solo-parámetro de intensidad uso fluorescencia para determinar el número de cromosomas en cada célula 20.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Calcular el índice de asincronía (Ai).
	<ol><li>Calcular la inteligencia artificial, según lo descrito por Løbner-Olesen et al. 32, usando las distribuciones de parámetro de intensidad de fluorescencia de las muestras de descentramiento de la RIF y la fórmula Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), donde fx es las células de la fracción con x número de los cromosomas replicados completamente. Consideran iniciaciones asincrónica cuando A &#62; 0.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen ningún interés financiero que compiten.

La metodología utilizada aquí toma ventaja de las técnicas de vanguardia para responder a una pregunta difícil con respecto a la posición óptima de genomic de un elemento genético. La inserción al azar del elemento genético (mediada por el transposon) permite la fácil y rápida recopilación de miles de clones, que luego se pueden hacer para competir entre sí para seleccionar la posición óptima del elemento genético investigado (es decir, el clon más apto).
Aquí, DARS2 fue inse...

La función de cualquier elemento genético puede verse afectada por su localización en el genoma. En las bacterias, esto resulta fundamentalmente de interferencia por la transcripción de genes vecinos, local topología de ADN o dosis de gen asociado de replicación. En particular, los procesos de replicación del DNA y la segregación son controlados, al menos en parte, por las regiones cromosómicas no codificante1y el funcionamiento de estas regiones depende de situación/contexto genómico. En e. coli, los ejemplos son el sitio de dif , necesario para la hermana de resolución del cromosoma2; Secuencias KOPS, necesarias para de la segregación del cromosoma3; datos, DARS1y DARS2 regiones, requeridas para el control de la replicación cromosómica adecuada (abajo; 4). se presenta un método que permite la reubicación al azar, la selección y la determinación del contexto genético óptimo de cualquier elemento genético, ejemplificados aquí por el estudio de la región no codificante de DARS2 .
En e. coli, DnaA es la proteína del iniciador responsable de filamento de la DNA en la replicación solo origenoriCy para la contratación de la helicasa DnaB5,6,7. DnaA pertenece a la AAA+ (es decir, asociados a diversas actividades de ATPasas) proteínas y puede enlazar ATP y ADP con similar alta afinidad5. El nivel de DnaAATP picos en iniciación8, donde DnaAATP forma un multimer en oriC que activa el ADN dúplex apertura9. Después de la iniciación, oriC se hace disponible para la iniciación debido a secuestro por un mecanismo que implica el atascamiento de la proteína SeqA hemimethylated oriC10,11. Durante el secuestro, se reduce el nivel de DnaAATP por al menos dos mecanismos: la regulación inactivación de DnaA (RIDA)12,13 y datos-DnaA dependienteATP hidrólisis (DDAH)14 ,15. RIDA y DDAH promoción la conversión de DnaAATP aADPde DnaA. Antes de una nueva ronda de iniciación, DnaAADP se reactiva a DnaAATP en secuencias específicas de reactivación de DnaA (DARS): DARS1 y DARS216,17. La cromosómica datos, DARS1y DARS2 regiones son no codificante y actuar de una manera como acompañante para modular DnaAATPADP interconversión de /DnaA. Estas regiones, las afueras del origen de replicación, que al montaje de un complejo de DnaA para cualquiera la inactivación (datos; 14) o activación (DARS1 y DARS2; 17) de DnaA. Eliminación de DARS2 en una celda no altera masa doblar tiempo pero resulta en replicación asincrónica iniciación15,16,18. Sin embargo, DARS2-células deficientes tienen un gimnasio costo comparado con un tipo de salvaje lo contrario isogénicas durante ambos competencia de continuo crecimiento en medio rico o en el establecimiento de la colonización en el intestino de ratón18. Esto indica que incluso pequeños cambios en la concentración de asincronía/origen tienen un efecto negativo en fitness bacteriano. En e. coli, hay una presión selectiva para mantener la simetría (es decir, dos brazos de la replicación de casi igual longitud) de cromosoma19. Los datos, DARS1y DARS2 regiones tienen la misma distancia relativa a oriC en todo e. coli cepas secuenciadas18, a pesar de grandes variaciones en el tamaño del cromosoma.
Aquí, utilizamos la región DARS2 de e. coli como ejemplo para la identificación de los puestos cromosómicas óptimos para su función. DARS2 fue insertado en el transposon NKBOR y la resultante NKBOR:: transposonDARS2 posteriormente se inserta al azar en el genoma de MG1655 ΔDARS2. Así generó una colección de células, cada posesión DARS2 colocado en un lugar diferente en el cromosoma. Se realizó un en vitro competencia experimento, donde todas las células de la colección fueron agrupadas y compitieron entre sí durante el crecimiento continuo en libras para un estimado generaciones 700. El resultado del experimento de competencia monitoreados/determinó mediante Southern blot, gene fácil caminar y secuenciación del genoma completo (gt; Figura 1). Clones de punto final resueltas por gene fácil caminar se caracterizaron por citometría de flujo para evaluar los parámetros de ciclo celular. En un análisis cytometric del flujo, tamaño de celda, el contenido de ADN y sincronía de iniciación se pueden medir para un gran número de células. En citometría de flujo, un flujo de células pasa un haz de luz de la longitud de onda adecuada para excitar el ADN teñido, que entonces está simultáneamente registrado por photomultipliers que recogen la fluorescencia emitida, una medida de contenido de ADN, siempre la las células se tiñen para ADN. La luz dispersada hacia adelante es una medida de masa celular20.
El experimento de competencia en vitro que presentamos aquí se utiliza para abordar las cuestiones relativas a la importancia de la posición cromosómica y el contexto genómico del elemento genético. El método es fácil de usar e imparcial.

<table><tbody><tr>Agua <td></td><td>Mili-Q esterilizada en autoclave</td><td>Ninguna</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación, 0,1 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P41050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MicroPulsador Sistema de electroporación</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780029&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, polvo (Lennox L agar)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Placas de Petri de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Tubos de Centrífuga Cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL Tubos de Centrífuga Cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; Tubos criogénicos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad (2 U/&micro; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>dATP, [&alpha;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &micro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU012H250UC</td><td></td></tr><tr><td>DECAprime II Kit de etiquetado de ADN</td><td>Espectrofotómetro Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1455</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SF/MBV/03.32</td><td>Farmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Hermle&nbsp; &nbsp; &nbsp; SF/MBV/03.46</td> Centrífuga <td>Hermle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ole Dich&nbsp; SF/MBV/03.29</td><td>Ole Dich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 2.0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Sodio</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>96% Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Ultra puro</td><td>BRL</td><td>5509UA</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Merck</td><td>2445</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasa A tipo II A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de sodio (SDS)</td><td>Merck</td><td>13760</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L 6876</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>405-7</td><td></td></tr><tr><td>0.5M Na-EDTA pH 8.0</td><td>BRL</td><td>5575 UA</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich 10106801001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PvuI (10 U/&micro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0621</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa ultrapura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>DNA Gel Load Dye (6X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris-Borato-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>clorhídricoSigma-Aldrich</td><td>433160</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; Papeles de 3MM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030931</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20&times; Concentrado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond-N+</td><td>GE Healthcare RPN119B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina - Fracción V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Ácido desoxirribonucleico sal sódica de testículos de salmón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Carestream Kodak &nbsp; BioMax &nbsp; película ligera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z373494</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; Kit de extracción de gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1111&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; kit de limpieza para PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1020</td><td></td></tr><tr><td>T100&nbsp; Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Espectrofotómetro</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rifampicina</td><td>Serva</td><td>34514.01</td><td></td></tr><tr><td>Cefalexina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Mitramicina</td><td>Serva</td><td>29803.02</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Apogee A10</td><td>Apogee</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de la óptima localización cromosómica de un elemento de dna en escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

La posición o posiciones cromosómica óptima de un determinado elemento de ADN fue/fueron determinada por la inserción al azar mediada por transposones, seguido por la selección de fitness. En bacterias, el impacto del contexto genético de la función de un elemento genético puede ser difícil de evaluar. Varios mecanismos, incluyendo efectos topológicos, interferencia transcripcional de genes vecinos, o dosis de gen asociado de replicación, pueden afectar la función de un elemento genético. Aquí, describimos un método que permite la integración al azar de un elemento de DNA en el cromosoma de Escherichia coli y seleccionar las ubicaciones más favorables mediante una competencia de crecimiento simple experimentan. El método aprovecha de un bien-descrito transposones-sistema de inserción al azar, juntada con una selección de los más aptos clone(s) ventaja del crecimiento, un procedimiento que es fácilmente ajustable a las necesidades experimentales. Puede determinarse la naturaleza de la clone(s) más aptos por todo el genoma que ordenaba en una población clonal múltiples compleja o por gene fácil para la identificación rápida de clones seleccionados. Aquí, la región no codificante de ADN DARS2, que controla la iniciación de la replicación del cromosoma de e. coli, fue utilizada como ejemplo. La función de DARS2 es conocida por ser afectados por dosis de gen asociado de replicación; el más DARS2 obtiene el origen de replicación del ADN, más activo se convierte. DARS2 fue insertado al azar en el cromosoma de un DARS2-elimina la tensión. Los clones resultantes que contienen inserciones individuales se agruparon y compitieron entre sí a cientos de generaciones. Finalmente, los clones más aptos se caracteriza y contiene DARS2 en proximidad cercana a la ubicación original de DARS2 .

Una mancha blanca /negra meridional fue hecha para verificar que DARS2 se distribuyó al azar a lo largo del cromosoma en la biblioteca de transposon (t = 0) y que los clones más aptos persistiría en el tiempo. El Southern blot fue realizada en la DNA extraída de la piscina de transposon inicial (en t = 0) y cada 100 estimado de 700 generaciones de competencia (figura 3). Aquí, la DNA celular total de cada punto del tiempo fue digerido con Pvu</em...

Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

El objetivo general de este experimento es determinar la posición cromosómica óptima de cualquier elemento de ADN dado mediante inserción aleatoria mediada por transposones, experimentos de competencia y secuenciación del genoma completo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la replicación del ADN, como la importancia de la ubicación cromosómica de un elemento genético. La ventaja de esta técnica es que combina la inserción aleatoria basada en transposones con la selección del clon más apto mediante ventaja de crecimiento.Aquí, se simplifica mediante la región DARS2 de E.coli. Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización cromosómica de Escherichia coli, también puede aplicarse a otras bacterias. Después de preparar células electrocompetentes, como MG1655 delta DARS2, según el protocolo descrito en el texto, añada un microgramo de pNKBOR DARS2 a 40 microlitros de células y transfiera la mezcla a una cubeta estéril preenfriada de 0,2 centímetros de separación.Introduzca la cubeta en la cámara de electroforesis. Luego, electroforese las células a 18 kilovoltios, 500 ohmios y 25 microfaradios. La constante de tiempo debe ser de aproximadamente cinco milisegundos y no debe ocurrir arco eléctrico.Recupere rápidamente la suspensión bacteriana resuspendiéndola en un mililitro de caldo LB precalentado y transfiérala a un tubo de ensayo de 15 mililitros. Incube las células bajo condiciones de crecimiento aeróbico a 37 grados Celsius durante 30 minutos sin selección con antibiótico. Luego, siembre las bacterias en placas de agar LB suplementadas con 50 microgramos por mililitro de kanamicina e incube las placas a 37 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, cuente las colonias procedentes de la electrotransformación. Se considera que una colonia equivale a una inserción del transposón en el cromosoma. Añada un mililitro de caldo LB a cada placa y lave todas las colonias.Reutilice el mismo mililitro de caldo LB para aumentar la concentración bacteriana. Luego, reúna todas las colonias en el mismo tubo de 50 mililitros. Vortexee el tubo para congelar el material inicial y mezcle un mililitro de suspensión celular con un mililitro de glicerol al 50% en hielo.Transfiera los tubos a hielo seco durante 10 minutos. Una vez que las culturas estén congeladas, colóquelas en un congelador a menos 80 grados Celsius. Derrita la biblioteca de transposones desde menos 80 grados Celsius sobre hielo.Mezcle mediante pipeteo, luego transfiera 100 microlitros de la biblioteca de transposones a 10 mililitros de LB en un tubo de ensayo de 15 mililitros. Incube las células con agitación continua y aireación a 37 grados Celsius durante ocho horas hasta la fase estacionaria. Ajuste los parámetros a diferentes condiciones de crecimiento según sea necesario.Para propagar la población bacteriana aproximadamente cada 10 generaciones, transfiera 10 microlitros de la fase previamente estacionaria a 10 mililitros de medio fresco precalentado y cultive la muestra durante otras ocho horas hasta la fase estacionaria. Después de cada 100 generaciones de competencia, guarde cinco muestras de un mililitro y almacénelas a 80 grados Celsius negativos. Prepare la sonda para el Southern blot frente a una sección de un kilobase del NKBOR mediante amplificación por PCR utilizando cebadores específicos como se indican aquí.Analice las muestras utilizando el siguiente programa. Etiquete el fragmento de PCR resultante con dATP marcado con P32 utilizando el sistema de cebadores aleatorios según Smith y prepare el ADN celular total según el protocolo descrito en el texto. Diga el ADN celular total con Pvul, que corta NKBOR conteniendo la región de interés fuera de una región cubierta por la sonda.Realice una transferencia Southern utilizando un gel de agarosa al 0,7 % según Loebner-Olsen y von Freiesleben. Para utilizar la técnica de caminata génica sencilla con el fin de identificar los sitios de inserción de DARS2 a partir de clones individuales, tras aproximadamente 700 generaciones de competencia, aísle el ADN genómico para usarlo como molde en la PCR extendiendo primero bacterias en una placa de agar LB e incube a 37 grados Celsius durante la noche. Inocule caldo LB con colonias individuales y crezca las culturas durante la noche a 37 grados Celsius.Luego, transfiera 20 microlitros a 200 microlitros de agua destilada autoclavada. Vortexee las colonias hasta disolverlas, luego caliente la mezcla a 100 grados Celsius durante 10 minutos. Centrifugue las muestras a velocidad máxima durante cinco minutos y guarde el lisado celular a menos 20 grados Celsius para uso futuro.A continuación, diseñe tres cebadores anidados para que se hibriden dentro del transposón de elección como se muestra aquí. Utilice 200 nanogramos de ADN genómico, el primer anidado uno y un cebador aleatorio para preparar una reacción de PCR de 20 microlitros. Luego, ejecute las muestras utilizando el siguiente programa.Para la segunda amplificación, utilice un microlitro de la primera reacción como molde y emplee el cebador anidado dos y el mismo cebador aleatorio. Realice una tercera reacción de manera similar utilizando el cebador anidado tres, el mismo cebador aleatorio y un microlitro de la segunda reacción como molde. Somete los productos de la reacción final de PCR a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y tiña con bromuro de etidio.Recorte una banda en el rango de 100 a 800 pares de bases y aísle el ADN utilizando cualquier kit comercial de extracción de geles de ADN según las instrucciones del fabricante. Para realizar citometría de flujo, equilibre cada cultivo bacteriano manteniéndolo en fase de crecimiento exponencial durante al menos 10 generaciones. Mida la DO600 y asegúrese de que nunca supere 0,3.Para realizar la eliminación de rifampicina según el protocolo descrito en el texto, transfiera un mililitro de cultivo a un tubo de 15 mililitros que contenga 30 microlitros de RIF-CEF. Incube el tubo a 37 grados Celsius con agitación durante un mínimo de cuatro horas. Para la muestra EXP, transfiera un mililitro de cultivo en fase exponencial a un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo.A continuación, recoger las células por centrifugación a 15.000 × g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Re-suspender el precipitado en 100 microlitros de tris frío con hielo 10 milimolar pH 7,5 y añadir un mililitro de etanol al 77 % frío con hielo. Almacenar las muestras a cuatro grados Celsius hasta su uso.Tiña las células recolectando de 100 a 300 microlitros de células fijadas mediante centrifugación a 15.000 × g durante 15 minutos. Retire el sobrenadante y use 130 microlitros de solución colorante para ADN para resuspender el sedimento. Luego, incube las muestras en hielo y en la oscuridad durante 10 minutos.Finalmente, utilice citometría de flujo para determinar el origen por célula, la masa celular relativa y el contenido relativo de ADN. Tras la extracción de ADN del pool inicial de transposones y cada 100 generaciones aproximadamente de un total de 700 generaciones de competencia, el ADN se digirió con Pvul, enzima que se sabe corta una sola vez al transposón NKBOR DARS2 en una región no cubierta por la sonda, y se realizó un análisis de Southern blot. Como se muestra aquí, el pool inicial de DARS2 carecía de bandas definidas, lo que indica que DARS2 se había insertado al azar a lo largo del cromosoma.Con el tiempo, surgió un patrón en el que la población inicial grande de clones DARS2 se redujo a uno o pocos clones DARS2 persistentes. Se utilizó secuenciación del genoma completo para identificar los sitios de inserción de DARS2 a partir de la población inicial, y tras 400, 500 y 700 generaciones de competencia en un subconjunto representativo con secuenciación de inserción, se encontró que el 98 % de todas las inserciones DARS2 estaban cerca de la ubicación cromosómica natural del tipo salvaje de DARS2.Y el 2% se encontraron en otras partes del cromosoma. Se ha demostrado previamente que las células deficientes en DARS2 inician la replicación de manera sincrónica y presentan una disminución en la concentración de orígenes en comparación con las células de tipo salvaje. Aquí, la presencia de un elemento DARS2 en el extremo no restaura la sincronía ni el contenido celular de orígenes a los niveles de tipo salvaje, mientras que los clones seleccionados de DARS2, IR y RPPH, sí inician la replicación de manera sincrónica.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la posición cromosómica óptima de un elemento de ADN determinado. Esto se realiza mediante inserciones aleatorias basadas en transposones, seguidas de experimentos de competencia y, finalmente, secuenciación completa del genoma.

determination-optimal-chromosomal-location-s-for-dna-element

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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El ensayo de translocación HO-estimulado monitores de una sola hebra de recocido después de la creación de ADN de doble filamento se rompe en múltiples loci en...

Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae</em

Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes...

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Fuente: Kazi, M. I., et. al., Generación de bibliotecas de inserción de transposones en bacterias gramnegativas para secuenciación de alto rendimiento. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la selección, cuantificación y preservación de bacterias receptoras Gram-negativas portadoras de inserciones de transposones basadas en la resistencia a la kanamicina.

Aislamiento de bacterias gramnegativas con inserciones de transposones genómicos

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Presentado aquí es un método simple para crear una biblioteca de inserción del transposón alta densidad en Escherichia coli o Shigella flexneri mediante Conjugación bacteriana. Este protocolo permite la creación de una colección de cientos de miles de mutantes únicos en bacterias por la inserción genómica al azar de un transposón.

Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

La hemizigosidad recíproca a través de la secuenciación (RH-seq) es un nuevo y poderoso método para mapear la base genética de una diferencia de rasgos entre especies. Los grupos de hemizygotes son generados por la mutagénesis de la transposon y su estado físico es rastreado a través del crecimiento competitivo usando la secuenciación alta a lo largo de la secuenciación. El análisis de los datos resultantes identifica los genes subyacentes al rasgo.

Mapeo genético de las diferencias de termotolerancia entre especies de levadura Saccharomyces a través del análisis de hemizygosity recíproca en todo el genoma

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Este es un método adaptado para identificar factores candidatos de colonización de insectos en un simbionte beneficioso de Burkholderia. El huésped escarabajo está infectado con una biblioteca mutante aleatoria generada a través de la mutagénesis del transposón, y la complejidad de la biblioteca después de la colonización se compara con un control cultivado in vitro.

Secuenciación de transposon-inserción como herramienta para dilucidar factores de colonización bacteriana en un simbionte de gladiolos de Burkholderia de escarabajos lagria villosa

Aprende a determinar la posición cromosómica óptima de elementos de ADN en Escherichia coli mediante inserción aleatoria mediada por transposones, experimentos de competencia y secuenciación del genoma completo.

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones (Video) | JoVE Journal

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

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