Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

El objetivo general de este experimento es determinar la posición cromosómica óptima de cualquier elemento de ADN mediante la inserción aleatoria mediada por transposones, experimentos de competencia y secuenciación del genoma completo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la replicación del ADN, como la importancia de la ubicación cromosómica de un elemento genético. La ventaja de esta técnica es que combina la inserción aleatoria basada en transposones con la selección del clon más apto por ventaja de crecimiento.

Aquí, se simplifica con la región E. coli DARS2. Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización cromosómica de la Escherichia coli, también se puede aplicar a otras bacterias. Después de preparar celdas electrocompetitivas como MG1655 delta DARS2 de acuerdo con el protocolo de texto, agregue un microgramo de pNKBOR DARS2 a 40 microlitros de celdas y transfiera la mezcla a una cubeta estéril preenfriada de 0,2 centímetros

Inserte la cubeta en la cámara de electroporación. Luego, electropore las celdas a 18 kilovoltios, 500 ohmios y 25 microfaradios. La constante de tiempo debe ser de unos cinco milisegundos y no debe producirse ningún arco.

Recupere rápidamente la suspensión bacteriana volviéndola a suspender en un mililitro de caldo LB precalentado y transfiéralo a un tubo de ensayo de 15 mililitros. Incubar las células en condiciones de crecimiento aireadas a 37 grados centígrados durante 30 minutos sin selección de antibióticos. A continuación, coloque las bacterias en las placas de agar LB suplementadas con 50 microgramos por mililitro de kanamicina e incube las placas a 37 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, contar las colonias de la electroporación. Una colonia se considera igual a la inserción de un transposón cromosómico. Agregue un mililitro de caldo LB a cada plato y lave todas las colonias.

Reutilice el mismo mililitro de caldo LB para aumentar la concentración bacteriana. Luego, agrupa todas las colonias en el mismo tubo de 50 mililitros. Agite el tubo para congelar el material de partida y mezcle un mililitro de suspensión celular con un mililitro de 50% de glicerol en hielo.

Transfiera los tubos a hielo seco durante 10 minutos. Una vez que los cultivos estén congelados, transfiéralos a un congelador a 80 grados centígrados negativos. Descongele la biblioteca de transposones desde menos 80 grados Celsius en hielo.

Mezcle pipeteando, luego transfiera 100 microlitros de la biblioteca de transposones a 10 mililitros de LB en un tubo de ensayo de 15 mililitros. Cultive las células aireadas con agitación continua a 37 grados centígrados durante ocho horas hasta la fase estacionaria. Ajuste los parámetros a las diferentes condiciones de crecimiento según lo desee.

Para propagar la población bacteriana aproximadamente cada 10 generaciones, transfiera 10 microlitros de la fase previamente estacionaria a 10 mililitros de medio fresco precalentado y haga crecer el cultivo durante otras ocho horas a la fase estacionaria. Después de cada 100 generaciones de competencia, guarde cinco muestras de un mililitro y guárdelas a 80 grados centígrados negativos. Prepare la sonda para la transferencia de Southern contra una sección de un kilobyte de la NKBOR mediante amplificación por PCR utilizando cebadores específicos como se indica aquí.

Ejecute los ejemplos con el siguiente programa. Etiquete el fragmento de PCR resultante con dATP marcado con P32 utilizando el sistema de cebador aleatorio según Smith y prepare el ADN celular total de acuerdo con el protocolo de texto. Digiere el ADN celular total con Pvul, que corta NKBOR que contiene la región de interés fuera de una región cubierta por la sonda.

Realizar un Southern blot utilizando gel de agarosa al 0,7% según Loebner-Olsen y von Freiesleben. Con el fin de utilizar el simple paso de genes para identificar los sitios de inserción de DARS2 a partir de clones individuales, después de 700 generaciones estimadas de competencia, aísle el ADN genómico para la plantilla de PCR esparciendo primero las bacterias en una placa de agar LB e incube a 37 grados Celsius durante la noche. Inocular el caldo LB con colonias individuales y cultivarlas durante la noche a 37 grados centígrados.

Luego, transfiera 20 microlitros a 200 microlitros de agua destilada esterilizada en autoclave. Convierte las colonias en una solución, luego calienta la mezcla a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a máxima velocidad durante cinco minutos, luego guardar el lisado celular a menos 20 grados Celsius para uso futuro.

A continuación, diseñe tres cebadores anidados para recocer dentro del transposón de elección, como se muestra aquí. Utilice 200 nanogramos de ADN genómico, un cebador anidado y un cebador aleatorio para preparar una reacción de PCR de 20 microlitros. A continuación, ejecute los ejemplos con el siguiente programa.

Para la segunda amplificación, use un microlitro de la primera reacción como plantilla y use dos cebadores anidados y el mismo cebador aleatorio. Lleve a cabo una tercera reacción de manera similar utilizando tres cebadores anidados, el mismo cebador aleatorio y un microlitro de la segunda reacción como plantilla. Ejecute los productos de la reacción final de PCR en un gel de agarosa al 1,5% y estatinas con bromuro de etidio.

Corte una banda en el rango de 100 a 800 pares de bases y aísle el ADN usando cualquier kit comercial de extracción de gel de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para llevar a cabo la citometría de flujo, equilibre cada cultivo bacteriano manteniéndolo en la fase de crecimiento exponencial durante al menos 10 generaciones. Mida el OD600 y asegúrese de que nunca supere 0,3.

Para llevar a cabo la excentricidad de rifampicina según el protocolo de texto, transfiera un mililitro de cultivo a un tubo de 15 mililitros que contenga 30 microlitros de RIF-CEF. Incubar el tubo a 37 grados centígrados agitando durante un mínimo de cuatro horas. Para la muestra EXP, transfiera un mililitro de cultivo de crecimiento exponencial a un tubo de 1,5 mililitros en hielo.

A continuación, se recogen las células por centrifugación a 15.000 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de etanol helado de 10 milimolares tris pH 7.5 y agregue un mililitro de etanol 77% helado. Guarde las muestras a cuatro grados centígrados hasta su uso.

Tiñir las células recolectando de 100 a 300 microlitros de células fijas por centrifugación a 15.000 veces G durante 15 minutos. Retire el sobrenadante y use 130 microlitros de solución de tinción de ADN para volver a suspender el pellet. Luego, incube las muestras en hielo y en la oscuridad durante 10 minutos.

Por último, utilice la citometría de flujo para determinar el origen por célula, la masa celular relativa y el contenido relativo de ADN. Después de la extracción de ADN del grupo inicial de transposones y cada 100 de las 700 generaciones estimadas de competencia, el ADN se cortó con Pvul, que se sabe que corta el transposón NKBOR DARS2 una vez en una región no cubierta por la sonda, y se realizó una transferencia de Southern. Como se muestra aquí, el grupo inicial de DARS2 carecía de bandas distintas, lo que muestra que DARS2 se insertó aleatoriamente en todo el cromosoma.

Con el tiempo, surgió un patrón en el que el gran grupo inicial de clones de DARS2 se convirtió en solo uno o unos pocos clones de DARS2 persistentes. Se utilizó la secuenciación del genoma completo para identificar los sitios de inserción de DARS2 desde el grupo de inicio. Y después de 400, 500 y 700 generaciones de competencia en un subconjunto representativo de inserciones secuenciadas, el 98% de todas las inserciones de DARS2 se encontraron cerca de la ubicación del cromosoma DARS2 de tipo salvaje.

Y el 2% se encontró en otras partes del cromosoma. Se demostró previamente que las células deficientes en DARS2 inician la replicación en sincronía y tienen una disminución en la concentración de origen en relación con las células de tipo salvaje. Aquí, la presencia de un elemento DARS2 en el terminal no restaura la sincronía o el contenido de origen celular a niveles de tipo salvaje, mientras que los clones de DARS2 seleccionados IR y RPPH inician la replicación en sincronía.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la posición cromosómica óptima de un elemento de ADN determinado. Esto se hace mediante inserciones aleatorias basadas en transposones, seguidas de experimentos de competencia y, finalmente, la secuenciación del genoma completo.