Un modelo de ratón de ingeniería genética de cáncer colorrectal esporádico
July 6th, 2017
Se presenta un protocolo para el establecimiento de un modelo genético de ratón de cáncer colorrectal por infección segmentaria de adenovirus y su vigilancia mediante colonoscopia de alta resolución.
El objetivo general de este procedimiento es lograr la infección segmentaria por adeno-cre en el colon en un modelo de ratón modificado genéticamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer colorrectal, o CCR, ya que proporciona un modelo excelente para estudiar la biología y el tratamiento del CCR. La principal ventaja de esta técnica es que cualquier laboratorio con experiencia en cirugía de pequeños roedores puede utilizar este modelo para producir tumores localizados en el colon altamente reproducibles y de fácil acceso.
Comience colocando un ratón anestesiado en posición supina y aplique ungüento en los ojos del animal. Coloque el ratón en una posición segura y luego confirme el nivel adecuado de sedación con un pellizco en los dedos de los pies. Realice una incisión de aproximadamente 15 milímetros en la línea media de la piel de la parte inferior del abdomen.
Luego, use fórceps para agarrar la musculatura de la pared abdominal y haga una incisión cuidadosa en el músculo con unas tijeras para abrir la cavidad abdominal. Después de identificar el colon distal, sujete cuidadosamente el tejido con una pinza delicada de aproximadamente 15 milímetros proximal al ano. A continuación, inserte un tubo de teflón flexible transanalmente avanzando cuidadosamente el tubo hasta que llegue a la oclusión luminal.
Anule el tubo con una cánula de calibre 30. Conecte una jeringa estándar de un mililitro a la cánula y enjuague el colon con varios mililitros de solución salina normal hasta que se haya evacuado toda la materia fecal. Una vez que el colon distal esté vacío, reemplace el tubo de solución salina por un nuevo tubo de teflón y use una segunda pinza para ocluir el colon aproximadamente tres milímetros distal a la primera pinza.
Usando una segunda jeringa de un mililitro equipada con una cánula de calibre 30, inyecte cuidadosamente de 50 a 80 microlitros de tripsina-EDTA al 0,25% en el segmento de colon pinzado. El colon debe inflarse lo suficiente como para romper la barrera mucosa sin perforar el segmento de tejido pinzado. Después de 10 minutos, retire la pinza distal.
A continuación, retira el tubo de tripsina y enjuaga el colon distal con 500 microlitros de solución salina normal. Después de insertar un nuevo tubo de teflón, vuelva a pinzar el colon e infle el tejido con 50 a 80 microlitros de la solución adenoviral. Después de 30 minutos, retire las pinzas y el tubo y cierre la pared abdominal con suturas de rápida absorción 6-0.
Cierre la piel con pinzas quirúrgicas para heridas y vigile al animal con una almohadilla térmica hasta que se recupere por completo. Para controlar el crecimiento tumoral mediante colonoscopia, coloque al animal anestesiado portador de tumor en posición supina sobre una almohadilla térmica e inserte el endoscopio por vía transanal en el tracto intestinal. Infle suavemente el aire bajo control visual para distender el colon.
Luego, empuje cuidadosamente el endoscopio hacia adelante hasta que se pueda identificar una lesión mucosa en el colon distal, guardando cada imagen endoscópica a medida que se adquiere para su posterior evaluación. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, retire lentamente el endoscopio y coloque el mouse en una almohadilla térmica de 38 grados Celsius hasta que se recupere por completo. Los tumores se pueden monitorear fácil y repetidamente a través de una colonoscopia sin mayor estrés para los animales.
Las manifestaciones de la enfermedad son muy similares al cáncer colorrectal humano, ya que los animales primero desarrollan adenomas y, en última instancia, adenocarcinoma en el colon distal. Dependiendo del genotipo condicional de los animales, los tumores también hacen metástasis en el peritoneo y el hígado. Si se utiliza un alelo fluorescente cre-reportero, las manifestaciones tumorales pueden identificarse fácilmente por la expresión de proteínas fluorescentes que, dependiendo del alelo reportero, pueden ser lo suficientemente brillantes como para ser visualizadas a la luz del día.
Desde el punto de vista histológico, el 95% de los tumores en desarrollo son adenocarcinomas muy parecidos al cáncer colorrectal humano y abarcan todo el espectro del desarrollo tumoral, desde el adenoma no invasivo hasta el adenocarcinoma que invade las estructuras circundantes. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 50 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar prestar especial atención a la vulnerabilidad del colon en todo momento.
La perforación conduce inevitablemente a peritonitis y sepsis y requiere la terminación del enema. No olvide que trabajar con adenovirus requiere medidas de seguridad de nivel dos de bioseguridad, ya que el virus puede ser peligroso.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo para establecer un modelo de ratón genéticamente modificado de cáncer colorrectal mediante infección adeno-cre segmental. El modelo se monitorea utilizando colonoscopia de alta resolución, proporcionando una herramienta valiosa para estudiar la biología y el tratamiento del cáncer colorrectal.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Investigación del cáncer colorrectal
- Modelos de ratón genéticamente modificados
- Oncología
Antecedentes
- El cáncer colorrectal (CCR) es una preocupación de salud significativa.
- Los modelos de ratón genéticamente modificados son esenciales para la investigación del cáncer.
- La infección adeno-cre segmental permite el desarrollo localizado de tumores.
- La colonoscopia de alta resolución ayuda en la vigilancia de tumores.
Propósito del estudio
- Establecer un modelo reproducible para la investigación del CCR.
- Facilitar el estudio de la biología y las opciones de tratamiento del CCR.
- Proporcionar un método accesible para laboratorios con experiencia en cirugía de roedores pequeños.
Métodos utilizados
- Infección adeno-cre segmental del colon.
- Uso de ratones anestesiados para procedimientos quirúrgicos.
- Aplicación de colonoscopia de alta resolución para el monitoreo de tumores.
- Creación de tumores localizados en el colon para fines de investigación.
Resultados principales
- El protocolo permite el establecimiento exitoso de tumores localizados.
- Alta repetibilidad de los resultados en diferentes ensayos.
- Accesibilidad para laboratorios con habilidades quirúrgicas básicas.
- Potencial para responder preguntas críticas en la investigación del CCR.
Conclusiones
- El modelo establecido es una herramienta valiosa para los estudios de CCR.
- Mejora la comprensión de la biología y el tratamiento del CCR.
- La investigación futura puede basarse en esta metodología para obtener más conocimientos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This genetically engineered mouse model addresses a critical gap in colorectal cancer research by providing a reproducible, immunocompetent system that closely mimics human tumor progression from adenoma to adenocarcinoma. The segmental adeno-cre infection approach enables localized tumor induction in the distal colon, reducing variability and supporting mechanistic de-risking in preclinical studies. Its compatibility with longitudinal monitoring via colonoscopy enhances translational continuity and supports predictive confidence in therapeutic evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a disease-relevant system with intact immune competence.
- Operational Value: Supports biological de-risking through uniform tumor development and histopathological fidelity to human colorectal cancer.
- Predictive Value: Facilitates target validation by allowing assessment of molecular pathways in a spatially controlled tumor microenvironment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, monitorable tumors via colonoscopy, enabling longitudinal biomarker tracking.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible platform for assessing drug response over time.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging workflows, supporting longitudinal study designs in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models the full spectrum of tumor progression, from adenoma to invasive adenocarcinoma, mirroring human disease.
- Metastatic Assessment: Enables evaluation of peritoneal and hepatic metastasis based on conditional genotype, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Fluorescent Tracking: When combined with cre-reporter alleles, allows non-invasive tumor visualization, enhancing endpoint detection in therapeutic trials.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for agents targeting colorectal carcinogenesis or metastatic progression.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of targets in a clinically relevant anatomical context.
- Screening Readiness: Enables standardized tumor induction and monitoring, facilitating consistent compound evaluation across studies.
- Analytics: Colonoscopic surveillance provides quantitative, repeatable readouts for tumor burden and progression kinetics.
- Translational Research: Histopathological and metastatic features align with human colorectal cancer, supporting biomarker-aligned preclinical studies.
- Enterprise Reuse: The surgical and monitoring protocol is reproducible across laboratories with basic rodent surgery expertise, enabling multi-site validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing a genetically defined, immunocompetent model of sporadic colorectal cancer.
- Operational Value: Standardized surgical technique and colonoscopic surveillance ensure reproducibility and reduce inter-animal variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of therapeutic efficacy and toxicity in a clinically predictive system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on tumor histology, metastatic potential, and treatment response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent survival surgery and aseptic technique to prevent colonic perforation and sepsis.
- Necessitates biosafety level two (BSL-2) facilities for handling adenoviral vectors.
- Depends on access to high-resolution colonoscopy equipment for longitudinal tumor monitoring.
- Requires conditional mutant mouse colonies with appropriate cre-loxP genotypes for targeted recombination.
- Limited to distal colon targeting; not suitable for pan-colonic or proximal tumor studies without protocol modification.
