Name: Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a caracterizar la embriogénesis en Arabidopsis mediante microscopía DIC y confocal con marcadores GFP. Este método permite analizar la formación de patrones celulares y la función de genes en el desarrollo embrionario.

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Agradecemos a Dr. Jessica Habashi para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Dr. Xianyong Sheng de la centro de la imagen, Facultad de Ciencias de la vida, Capital Normal University (Beijing, China), para realizar la localización de ensayo DR5-GFP . Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias de Gobierno Municipal de Beijing (CIT &#38; TCD20150102) y de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31600248).

Nota: Este protocolo tiene tres partes: 1) observando la formación de patrones en embriones de Arabidopsis de tipo salvaje utilizando microscopía DIC; 2) caracterizar el embrión patrón formación a través de la observación de la expresión de la proteína del marcador mediante láser confocal de barrido microscopía; y 3) determinar el papel de un gen específico en la embriogénesis (usando el mutante de naa10 como ejemplo).
1. el óvulo claro
<ol>
	<li>Preparación de material de planta Nota: El protocolo descrito aquí es un ejemplo de cómo hacer crecer plantas sanas; otras maneras de crecer plantas sanas también trabajan.<ol>
		<li>Añade 100 a un tubo de 1,5 mL y luego añadir 1 mL de hipoclorito de sodio 1.5% (15 mL de 10% de cloro con 85 mL de agua de la mezcla) para esterilizar las semillas durante 5 minutos invertir el tubo varias veces para asegurar que las semillas y la solución bien mezcladas para esterilizar las superficie semillas completamente.</li>
		<li>Forzar las semillas en la parte inferior del tubo de centrifugación durante 30 s a 1.200 x g, eliminar el sobrenadante y lavar las semillas con agua destilada cuatro veces en un banco para eliminar el hipoclorito residual.</li>
		<li>Añadir a 1 L de agua ultrapura 4,4 g de mezcla sal basal Murashige y Skoog (MS) y 10 g de sacarosa. Revolver la mezcla para disolver las sales y la sacarosa. Ajustar la solución a pH 5.8 con 1 M de KOH, añadir 3 g de agente gelificante, como Phytagel, a la solución de sacarosa de MS y para esterilizar la solución a 121 ° C durante 15 min hacer MS medio.</li>
		<li>Vierta 30 mL de medio MS en una placa de cultivo de 12 cm para generar placas de medio MS.</li>
		<li>Coloque las semillas estériles en la placa MS. Transferir la placa a una cámara de crecimiento y mantenga la placa bajo condiciones de día largo (22 ° C por 16 h en la luz y 18 ° C durante 8 h en la oscuridad) después de la estratificación de la semilla (3 días a 4 ° C en la oscuridad).</li>
		<li>Después de 8 días de crecimiento, transferir las plantas al suelo (mezcla rica en nutrientes suelo y vermiculita en una proporción 1:1) en una bandeja, cubrir la bandeja con una tapa blanca, transparente por 5 días evitar pérdida de agua y deje un espacio para evitar la vitrificación de las plantas.</li>
		<li>Tomar la tapa de la bandeja y cultivar las plantas en una cámara independiente bajo condiciones de día largo (ver 1.1.5). Encender la luz en 6:00 y fuera a 22:00. Después de 20 días de crecimiento en la cámara de cabina, las plantas habrán floreció y produjo silicuas.</li>
		<li>Marca de tallos de brotes de la flor con un hilo en la posición de la semilla en la inflorescencia en 20:00 (no utilice la primera a la tercera flor; las silicuas generados a partir de estos capullos generalmente desarrollan algunas semillas abortadas, y esto puede alterar la proporción de normales a anormales óvulos). Definir el inicio de la polinización el óvulo como cuando el brote marcado se abre en flor en 8:00 la mañana siguiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de solución de Hoyer
	<ol>
		<li>Añadir a un tubo de 50 mL 24 g de hidrato de cloral y envuelva el tubo completamente con papel de aluminio (no son estables bajo luz soluciones de hidrato de cloral).</li>
		<li>A continuación, añadir 9 mL de agua ultrapura y 3 mL de glicerol a la solución anterior y agitar el tubo para disolver el hidrato de cloral. Para hacer solución de Hoyer, dejar que el tubo soporte de la noche a temperatura ambiente para eliminar cualquier burbuja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separación y separación del óvulo
	<ol>
		<li>Coloque un pedazo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjeto de microscopio. Coloque una silicua crecido para el número deseado de días después de la polinización (DAP) de la diapositiva con la pseudoseptum perpendicular a la superficie; Esto hará fácil dividir los carpelos (figuras 1A y 1B).</li>
		<li>Dividir los carpelos en ambos lados de la pseudoseptum con una aguja de jeringa y coloque los dos carpelos disecados a la diapositiva para que los óvulos en la silicua son visibles bajo un estereoscopio (figuras 1C y 1D).</li>
		<li>Dispensar de 70 μl de solución de Hoyer en el portaobjetos de cristal y luego humedecer la punta de un par de pinzas de punta fina con solución de Hoyer por inmersión. Usando el estereoscopio, mover los óvulos en la solución de Hoyer en el portaobjetos con las pinzas para limpiar los embriones. Se aplica un cubreobjetos a la diapositiva suavemente para evitar la generación de burbujas.</li>
		<li>Colocar la corredera acabada en una caja en un cuarto oscuro de 2-12 h (cuanto más madura un óvulo es, cuanto más tiempo se necesitará) a temperatura ambiente. Embriones en la etapa de 2/4-cell (DAP de 1-2) pueden observarse microscópicamente después de 2 h, mientras que los embriones entre el octante y estadios globulares (DAP 3) se observan después de 4 h. Embriones más maduros (4-8 UTA) pueden observarse después de 12 h.</li>
		<li>Examinar los óvulos hayan borrado usando la función DIC de un microscopio. Coloque los embriones en un campo de baja potencia (10 X) y luego cambiar a un campo de alta potencia (objetivo de inmersión del aceite del X 100) para observar el patrón celular en los embriones desarrollados.</li>
		<li>Examinar los embriones en diferentes etapas de desarrollo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Caracterización de patrones de embrión e identidad de la célula a través de la observación de la expresión de la proteína de marcador
<ol>
	<li>Preparación de materiales de planta
	<ol>
		<li>Clonar el promotor y la secuencia del marcador gene u hormona respuesta elemento de codificación y luego fusionarlo con una proteína fluorescente (como GFP); a continuación, inserte el construir el vector binario (por ejemplo, pCambia1300). Aquí, el elemento de respuesta a auxinas DR5 se presenta como un ejemplo10.</li>
		<li>Introducir el plásmido resultante del DR5-GFP en las plantas de tipo silvestre por tumefaciens de la agrobacteria-mediado transformación11. Seleccione las plantas de T1 utilizando placas de medio de MS con Higromicina (50 mg/mL de licor de madre, diluido 1:1, 000). Las plantas transgénicas se exhiben largas raíces y generar dos hojas de la roseta después de 8 días de crecimiento bajo las condiciones descritas en 1.1.5.</li>
		<li>Transferir las plantas transgénicas a tierra y cultivarlos como se indica en 1.1.6 y 1.1.7.</li>
		<li>Recoger las semillas de la T2 de las líneas T1 independiente. Sembrar las semillas en las placas de EM-Higromicina, seleccionar las plantas portadoras de una copia de la inserción del DR5-GFP (la proporción de plantas resistentes a las plantas sensibles será aproximadamente 3:1) y transferencia al suelo.</li>
		<li>Cultivar las plantas de T2 como se indica en 1.1.6 y 1.1.7.</li>
		<li>Recoger las semillas de la T3 de las plantas de T2. Sembrar las semillas en las placas de EM-Higromicina, seleccionar las plantas transgénicas homocigóticas (todas las plantas de una sola línea muestran resistencia Higromicina) y transferir al suelo.</li>
		<li>Marque los botones florales de las plantas homocigóticas de T3 como se indica en 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Observación de señal GFP
	<ol>
		<li>Mezclar 3 mL de glicerol con 47 mL de agua ultrapura para generar una solución de glicerol 6%.</li>
		<li>Adhiera un pedazo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjetos de vidrio y fijar una silicua como se indica en 1.3.1.</li>
		<li>Dividir los carpelos en ambos lados de la pseudoseptum con una aguja de jeringa y coloque los dos carpelos disecados en el portaobjetos bajo un estereoscopio como se indica en 1.3.2.</li>
		<li>Dispensar 30 μl de 6% de glicerol en el portaobjetos de cristal y colocar todos los óvulos de los carpelos disecados en la solución con unas pinzas de punta fina. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos.</li>
		<li>Como la capa de semilla y endospermo en cada óvulo pueden impedir la observación de las señales de la GFP en el embrión, extraer el embrión el óvulo. Puntee la diapositiva rápidamente y suavemente a extraer el embrión desde el óvulo (más madura un óvulo es, menos fuerza se debe aplicar a la diapositiva).</li>
		<li>Examinar el portaobjetos usando microscopía de láser confocal de la fluorescencia de GFP. Encontrar los embriones aislados en un campo de baja potencia (10 X) y registrar su ubicación, luego cambiar a un campo de alta potencia (objetivo de inmersión del aceite del X 100) para observar la expresión DR5-GFP en los embriones mediante el establecimiento de la fuente de luz de excitación de 488 nm para la detección de la señal de la GFP.</li>
		<li>Detectar la expresión de GFP en los embriones para seleccionar la línea T3 adecuada para su posterior análisis.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Caracterización de la formación embrionaria en un mutante letal embrión mediante separación del óvulo y marcador proteína observación: Naa10 como ejemplo
<ol>
	<li>Dibujo del embrión en plantas mutantes naa10
	<ol>
		<li>Preparar los materiales de planta como se indica en 1.1.1-1.1.7.</li>
		<li>Identificar la naa10+ / − plantas por PCR utilizando cebadores específicos del gen5y marca luego los capullos de la naa10+ / − plantas como se indica en 1.1.8.</li>
		<li>Realizar la separación del óvulo y la examinación microscópica del naa10+ / − embriones como se indica en 1.2 y 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análisis de la proteína del marcador naa10 embriones
	<ol>
		<li>Obtener convenientes líneas transgénicas DR5-GFP utilizando el procedimiento descrito en 2.1-2.2.</li>
		<li>Cruzar una línea transgénica homocigótica de DR5-GFP con un naa10+ / − planta para obtener naa10+ / − plantas que son homocigóticas para el marcador de la fluorescencia de GFP en la generación F2 (identificada por PCR de genes específicos) caracterizar naa10+ / −5 y observe la señal GFP bajo el microscopio utilizando una línea homocigótica del DR5-GFP .</li>
		<li>Marcar los botones florales de naa10+ / − plantas que son homocigóticas para DR5-GFP como se indica en 2.1.7.</li>
		<li>La búsqueda de la señal de la GFP en naa10 los embriones que son homocigotos para DR5-GFP como se indica en 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li>
<li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+flowering+plants%3A+setting+up+the+basic+body+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li>
<li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li>
<li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+plant%3A+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li>
<li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/genetics/abstract/0168-9525(93)90246-E">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li>
<li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li>
<li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aux%2FIAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li>
<li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li>
<li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li>
<li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Óvulo es un método útil para detectar la división celular y la evaluación de morfología durante la embriogénesis en Arabidopsis; usando esta técnica, embriones pueden ser observados directamente bajo DIC microscopía5,12. El paso crítico para la remoción del óvulo es paso 1.3.4. El tiempo requerido para la remoción del óvulo en el paso 1.3.4 es variable. Embriones en la etapa de 2/4-cell pueden observarse claramente después de 2 h en solución de Hoyer, qu...

Embriogénesis es el evento más temprano en el desarrollo de las plantas superior. Una forma de embriones maduros de un cigoto por división celular y diferenciación bajo estricto control genético1,2. Embriones de Arabidopsis son un modelo útil para estudiar el control de la morfogénesis porque la secuencia de divisiones celulares durante la embriogénesis sigue un patrón esperado3,4. Sin embargo, un embrión de Arabidopsis con una a varias células es demasiado pequeño para ser observado y analizado. Además, la mutación de ciertos genes puede causar embrión letalidad5, que indica el papel clave de estos genes en la embriogénesis. La caracterización de la formación de patrones en los mutantes letales para el embrión constituye una base para entender el mecanismo molecular por el que genes esenciales regulan el desarrollo embrionario.
Un método detallado se describe aquí para la caracterización de la formación de patrón del embrión en la planta modelo Arabidopsis por observación microscópica directa. El método implica la separación del óvulo seguido por la observación microscópica de un embrión. También se describe la caracterización de un mutante letal para el embrión.
La morfología de los embriones en diferentes etapas de desarrollo se puede determinar directamente por microscopia con los óvulos que han sido borrados solución6,7 de Hoyer. Estos óvulos exhiben un alto índice de refracción; así, este óvulo claro método es especialmente ventajoso para las muestras que deben ser observadas por microscopia de interferencia diferencial (DIC) de contraste.
Además, los genes que se expresan en una celda determinada o un número limitado de células durante la embriogénesis pueden utilizarse como marcadores para identificar las células en un embrión. Por lo tanto, la especificación de identidad celular durante la embriogénesis se puede anotar mediante el control de la expresión de proteínas del marcador etiquetado GFP utilizando microscopía de láser confocal. Por el contrario, observando el patrón de expresión de un gen funcional desconocida -GFP fusion durante la embriogénesis puede proporcionar un vínculo entre patrones de embrión y la expresión de ese gen y facilitar la identificación de nuevos genes que se requieren para la embriogénesis en Arabidopsis.
El método aquí descrito puede utilizarse también para caracterizar el fenotipo de un mutante letal para el embrión y para determinar el impacto del gen afectado en la embriogénesis a nivel celular. Además, en combinación con una comparación de los patrones de expresión de genes marcadores durante la embriogénesis entre plantas tipo salvaje y mutantes, el método puede producir pistas sobre los mecanismos moleculares y las vías de señalización implicadas en la embriogénesis8,9. De hecho, el método fue aplicado a las plantas de naa10 , y se encontró que la división anormal de la hipófisis en el mutante puede ser causada por un cambio en la distribución de la auxina durante embriogénesis5.

<table><tbody><tr><td>Hidrato de cloral</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige y Skoog Medio basal</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de crecimiento</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>cámara: AxioCam 506 color</td></tr><tr><td>Microscopía de escaneo láser confocal</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>filtros: BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>cámara: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>suelo rico en nutrientes</td><td>KLASMANN, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 ml</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 1,5 ml</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>de hipoclorito de sodio al 10%</td><td>Reactivo analítico doméstico</td></tr><tr><td>sacarosa</td><td></td><td></td><td>Reactivo analítico doméstico</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>Reactivo analítico doméstico</td></tr><tr><td>glicerol</td><td></td><td></td><td>Reactivo analítico doméstico</td></tr><tr><td>placa de cultivo Suministros</td><td></td><td></td><td>domésticos</td></tr><tr><td>Vermiculita</td><td></td><td></td><td>Suministros domésticos</td></tr><tr><td>portaobjetos de</td><td></td><td></td> vidrio <td>Suministros</td></tr><tr><td>domésticos aguja de jeringa</td><td></td><td></td><td>Suministros domésticos</td></tr><tr><td>pinzas de punta fina</td><td>Suministros domésticos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>banco</td><td></td><td></td> súper limpio <td>Equipo doméstico</td></tr></tbody></table>

un método para la caracterización de embriogénesis en arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Dada la naturaleza altamente predecible de su desarrollo, embriones de Arabidopsis se han utilizado como modelo de estudios de morfogénesis en plantas. Sin embargo, embriones en fase temprana de plantas son pequeños y contienen pocas células, haciéndolas difíciles de observar y analizar. Aquí se describe un método para caracterizar la formación de embriones de la planta bajo el microscopio utilizando el organismo modelo Arabidopsis. Tras la separación de óvulos frescos usando solución de Hoyer, pudieran observarse el número de celular de y morfología de los embriones, y su etapa de desarrollo podría ser determinado por microscopía de contraste de interferencia diferencial usando un 100 X lente de inmersión de aceite. Además, la expresión de proteínas del marcador específico etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) fue supervisada para anotar la especificación de identidad de la célula durante el dibujo de embrión por microscopía de láser confocal. Así, este método puede utilizarse para observar la formación de embriones de la planta de tipo salvaje a nivel celular y molecular y caracterizar el papel de genes específicos en modelar embrionario mediante la comparación de la formación de patrones en los embriones de las plantas de tipo silvestre y mutantes letales para el embrión. Por lo tanto, el método puede utilizarse para caracterizar la embriogénesis en Arabidopsis.

El método descrito en este documento puede utilizarse para observar la embriogénesis directamente bajo un microscopio, anotar la especificación de identidad celular durante la embriogénesis con marcadores específicos y caracterizar el papel de un gen en particular durante la embriogénesis.
Resultados representativos a partir del análisis de patrones (de la etapa de cigoto alargada a la etapa madura del bastón) en el tipo salvaje...

Este protocolo describe un método para la observación de embriogénesis en Arabidopsis vía separación de óvulo, seguido por la inspección de la formación de patrones de embrión bajo un microscopio.

Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

El objetivo general de este método es caracterizar la formación de patrones en embriones durante la embriogénesis vegetal utilizando el organismo modelo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vegetal, como la embriogénesis en Arabidopsis. La principal ventaja de esta técnica es que la formación de patrones del embrión en la planta modelo Arabidopsis puede caracterizarse mediante la operación recomendada.Quien demuestra el procedimiento es Jinlin Feng, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, agregue 100 semillas a un tubo de 1,5 mililitros. Añada un mililitro de hipoclorito de sodio para esterilizar las semillas.Invierta el tubo varias veces para asegurar que las semillas y la solución estén bien mezclados. Después de cinco minutos, centrifugue el tubo a 1200 Gs durante 30 segundos. Retire el sobrenadante y lave las semillas con agua estéril cuatro veces para eliminar cualquier residuo de hipoclorito de sodio.A continuación, agregue 4,4 gramos de la mezcla de sales basales MS y 10 gramos de sacarosa a un litro de agua ultrapura. Agite para disolver la sal y la sacarosa. Utilizando hidróxido de potasio al uno mol, ajuste el pH de la solución a 5,8.Luego, agregue tres gramos de agente gelificante y esterilice la solución a 121 grados Celsius durante 15 minutos. Vierta 30 mililitros del medio MS resultante en una placa de cultivo de 12 centímetros. Coloque las semillas esterilizadas en la placa de medio MS.Transfiera la placa a un refrigerador y manténgala a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante tres días para estratificar las semillas. A continuación, mantenga la placa en una cámara de crecimiento bajo condiciones de día largo durante ocho días. Luego, transfiera las plantas a suelo en una bandeja.Cubra la bandeja con una tapa blanca transparente para evitar la pérdida de agua. Deje un pequeño espacio para evitar la vitrificación de las plantas. Después de cinco días, retire la tapa y cultive las plantas en una cámara de crecimiento bajo condiciones de día largo.Después de aproximadamente 20 días de crecimiento, utilice un hilo para marcar de 10 a 15 capullos florales a la altura de los tallos seminales y la inflorescencia a las 8:00 PM. Defina el inicio de la polinización del óvulo cuando los capullos marcados se abran en flor como las 8:00 AM de la mañana siguiente. Para comenzar a preparar la solución de Hoyer, agregue 24 gramos de clorhidrato a un tubo de 50 mililitros. Envuelva completamente el tubo con papel de aluminio, asegurándose de que el papel selle por completo la luz.Añada nueve mililitros de agua ultrapura y tres mililitros de glicerol. Agite el tubo para disolver el clorhidrato. Luego, deje reposar la solución de Hoyer preparada durante la noche a temperatura ambiente para eliminar cualquier burbuja.Para comenzar, sujete un trozo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjetos de microscopio. Coloque un silicua, cultivado durante el número deseado de días posteriores a la polinización, de modo que el pseudosepto quede perpendicular a la superficie. Utilizando la aguja de una jeringa, corte los carpelos en ambos lados del pseudosepto.A continuación, sujete los dos carpelos diseccionados sobre el portaobjetos de manera que los óvulos y el silículo sean visibles bajo un estereoscopio. Añada 70 microlitros de solución de Hoyer sobre el portaobjetos de vidrio. Luego, sumerja un par de pinzas de punta fina en la solución para humedecer la punta.Utilizando el estereoscopio y pinzas, traslade los óvulos a la solución de Hoyer para limpiar los embriones. Después de esto, coloque suavemente una cubierta sobre el portaobjetos, asegurándose de no generar burbujas. Coloque el portaobjetos terminado en una caja dentro de una habitación oscura durante dos a doce horas a temperatura ambiente.Después de que haya transcurrido el tiempo necesario, utilice la función DIC del microscopio para examinar los óvulos clarificados. Localice los embriones bajo un campo de baja potencia y luego cambie a un campo de alta potencia para observar el patrón celular en los embriones desarrollados. A continuación, examine los embriones en diferentes etapas de desarrollo.Para comenzar, prepare el plásmido DR5 GFP e introdúzcalo en plantas silvestres mediante transformación mediada por agrobacterium a methassians, tal como se describe en el protocolo escrito. Seleccione las plantas T1 utilizando placas de medio MS que contengan hidrolisina. Luego, transfiera y cultive las plantas según se indica en el protocolo escrito para obtener plantas T3.Usando un hilo, marque los botones florales de la planta T3 homocigota en la posición de los tallos de las semillas en la inflorescencia a las 8:00 PM. A continuación, mezcle tres mililitros de glicerol con 47 mililitros de agua ultrapura para generar una solución de glicerol al 6%. Luego, fije un trozo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjetos de microscopio. Coloque una siliqua de la planta T3 sobre el portaobjetos con el pseudoseptum perpendicular a la superficie.Con una aguja de jeringa, separe los carpelos en ambos lados del pseudosepto. Fije los dos carpelos disecados sobre el portaobjetos de manera que los óvulos y el silicua sean visibles bajo un estereoscopio. A continuación, agregue 30 microlitros de glicerol al 6 % sobre el portaobjetos.Sumerja un par de pinzas de punta fina en la solución para humedecer la punta. Con el uso del estereoscopio y las pinzas, transfiera los óvulos a la solución de glicerol. Coloque suavemente una lámina de cobertura sobre el portaobjetos.A continuación, golpee suavemente y con rapidez el portaobjetos para extraer el embrión del óvulo. Después de esto, utilice microscopía confocal de barrido láser para examinar el portaobjetos en busca de fluorescencia de la proteína verde fluorescente. Localice los embriones aislados bajo un campo de baja potencia y registre su ubicación.Cambie a un campo de alta potencia y configure la fuente de luz de excitación en 488 nanómetros para observar la expresión de GR5 GFP en los embriones. Luego, detecte la expresión de GFP y caracterice la formación del patrón del embrión según se describe en el protocolo del texto. En este estudio, la embriogénesis en Arabidopsis se observa mediante la limpieza de óvulos, como se puede ver.Tras la eliminación del óvulo, los embriones en diferentes etapas de desarrollo son distinguibles mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial. El patrón de expresión de GR5 GFP durante la embriogénesis se registra luego mediante microscopía confocal de barrido láser. Se observa que DR5 se expresa en el polo radicular de los embriones globulares y en forma de corazón del tipo silvestre.Se observa expresión de DR5 en las puntas del cotiledón embrionario y en el sistema vascular de embriones silvestres maduros. A continuación, se examina el papel de naa10 en Arabidopsis durante la embriogénesis. La hipótesis observada es que la división es anormal, con divisiones sesgadas y verticales en naa10 en comparación con la división asimétrica transversal en plantas de tipo silvestre.Como se observa aquí, oxen presenta una distribución casi uniforme en la mayoría de los embriones naa10 en la etapa globular, y mantiene una señal más amplia en las hipótesis en comparación con los embriones silvestres. Estos resultados indican que naa10 es necesario para la embriogénesis y que podría estar involucrado a través de la vía de señalización de oxen en Arabidopsis. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cómo cultivar Arabidopsis como material vegetal.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras mediciones, como la hibridación in situ, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como la expresión de genes específicos de la célula. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la embriogénesis exploren el mecanismo molecular mediante el cual genes específicos median la embriogénesis en Arabidopsis. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar la embriogénesis en Arabidopsis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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