Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

El objetivo general de este método es caracterizar el patrón de formación de embriones durante la embriogénesis de la planta utilizando el organismo modelo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la materia vegetal, como la embriogénesis en Arabidopsis. La principal ventaja de esta técnica es que la formación del patrón embrionario en la planta modelo Arabidopsis se puede caracterizar mediante la operación recomendada.

Quien demuestra el procedimiento es Jinlin Feng, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, agregue 100 semillas a un tubo de 1,5 mililitros. Agrega un mililitro de hipoclorito de sodio para esterilizar las semillas.

Invierta el tubo varias veces para asegurarse de que las semillas y la solución estén bien mezcladas. Después de cinco minutos, centrifugar el tubo a 1200 Gs durante 30 segundos. Retire el sobrenadante y lave las semillas con agua estéril cuatro veces para eliminar cualquier residuo de hipoclorito de sodio.

A continuación, agregue 4,4 gramos de mezcla de sales basales MS y 10 gramos de sacarosa a un litro de agua ultrapura. Revuelva para disolver la sal y la sacarosa. Usando hidróxido de potasio en un mol, ajuste el pH de la solución a 5.8.

Luego, agregue tres gramos de agente gelificante y esterilice la solución a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Vierta 30 mililitros del medio MS resultante en una placa de cultivo de 12 centímetros. Coloque las semillas esterilizadas en la placa MS.

Transfiera el plato a un refrigerador y manténgalo a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante tres días para estratificar las semillas. A continuación, mantenga la placa en una cámara de crecimiento en condiciones de días largos durante ocho días. Luego, transfiera las plantas a la tierra en una bandeja.

Cubra la bandeja con una tapa blanca transparente para evitar la pérdida de agua. Dejando un pequeño espacio para evitar la vitrificación de las plantas. Después de cinco días, retire la tapa y cultive las plantas en una cámara sin cita previa en condiciones de días largos.

Después de unos 20 días de crecimiento, use un hilo para marcar de 10 a 15 botones florales en la posición de los tallos de las semillas y la inflorescencia a las 8:00 p.m. Defina el comienzo de la polinización del óvulo cuando las yemas marcadas se abren para florecer a las 8:00 a.m. de la mañana siguiente. Para comenzar a preparar la solución de Hoyer, agregue 24 gramos de clorhidrato a un tubo de 50 mililitros. Envuelva el tubo completamente en papel de aluminio, asegurándose de que el papel de aluminio selle toda la luz.

Agregue nueve mililitros de agua ultrapura y tres mililitros de glicerol. Agite el tubo para disolver el clorhidrato. Luego, deje reposar la solución preparada de Hoyer durante la noche a temperatura ambiente para eliminar las burbujas.

Para empezar, coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de cristal de microscopio. Coloque una sílice, cultivada durante el número deseado de días después de la polinización, en el lado con el pseudotabique perpendicular a la superficie. Con una aguja de jeringa, divida los carpos a ambos lados del pseudotabique.

A continuación, fije los dos carpos disecados al portaobjetos para que los óvulos y la sílice sean visibles bajo un estereoscopio. Dispense 70 microlitros de la solución de Hoyer en el portaobjetos de vidrio. A continuación, sumerge un par de pinzas de punta fina en la solución para humedecer la punta.

Con el estereoscopio y las pinzas, mueva los óvulos a la solución de Hoyer para limpiar los embriones. Después de esto, aplique suavemente un cubreobjetos a la guía, asegurándose de no generar burbujas. Coloque la diapositiva terminada en una caja en una habitación oscura durante dos a 12 horas a temperatura ambiente.

Una vez que haya pasado el tiempo necesario, use la función DIC del microscopio para examinar los óvulos aclarados. Ubique los embriones bajo un campo de baja potencia y luego cambie a un campo de alta potencia para observar el patrón celular en los embriones desarrollados. Luego, examine los embriones en diferentes etapas de desarrollo.

Para comenzar, prepare el plásmido DR5 GFP e introdúzcalo en las plantas de tipo silvestre mediante la transformación mediada por agrobacterias a metasianos como se describe en el protocolo de texto. Seleccione las plantas T1 utilizando placas de medio MS que contengan hidrolisina. Luego, transfiera y cultive las plantas como se describe en el protocolo de texto para obtener plantas T3.

Con un hilo, marque los botones florales de la planta T3 homocigota en la posición de los tallos de las semillas en la inflorescencia a las 8:00 p.m. Después de esto, mezcle tres mililitros de glicerol con 47 mililitros de agua ultrapura para generar una solución de glicerol al 6%. A continuación, fije un trozo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjetos de cristal del microscopio. Coloque la silicona de una planta T3 en el portaobjetos con el pseudoseptum perpendicular a la superficie.

Con una aguja de jeringa, divida los carpos a ambos lados del pseudotabique. Fije los dos carpos disecados al portaobjetos para que los óvulos y la sílice sean visibles bajo un estereoscopio. A continuación, dispense 30 microlitros de glicerol al 6% en el portaobjetos.

Sumerge un par de pinzas de punta fina en la solución para humedecer la punta. Con el estereoscopio y las pinzas, mueva los óvulos a la solución de glicerol. Coloque suavemente un cubreobjetos en el portaobjetos.

A continuación, golpea el portaobjetos rápida y suavemente para extruir el embrión del óvulo. Después de esto, use microscopía de escaneo láser confocal para examinar el portaobjetos en busca de fluorescencia de proteínas fluorescentes verdes. Encuentre los embriones aislados bajo un campo de baja potencia y registre su ubicación.

Cambie a un campo de alta potencia y ajuste la fuente de luz de excitación a 488 nanómetros para observar la expresión de GR5 GFP en los embriones. A continuación, detecte la expresión de GFP y caracterice la formación del patrón embrionario como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, la embriogénesis en Arabidopsis se observa a través del aclaramiento del óvulo, como se puede observar.

Después de la eliminación del óvulo, los embriones en diferentes etapas de desarrollo se distinguen mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial. A continuación, se registra el patrón de expresión de GR5 GFP durante la embriogénesis bajo microscopía de barrido láser confocal. Se observa que DR5 se expresa en el polo de la raíz de los embriones globulares y en forma de corazón de tipo salvaje.

DR5 se expresa en las puntas embrionarias de los cotiledones y en la vasculatura de embriones maduros de tipo salvaje. Después de esto, se está examinando el papel de naa10 en Arabidopsis durante la embriogénesis. La hipótesis observada es que está dividida de manera anormal, con división torcida y vertical en naa10 en comparación con la división asimétrica transversal en plantas de tipo silvestre.

Como se ve aquí, los bueyes tienen una distribución casi uniforme en la mayoría de los embriones naa10 en la etapa globular, y retienen una señal más amplia en las hipótesis en comparación con los embriones de tipo salvaje. Estos resultados indican que la naa10 es necesaria para la embriogénesis, y que puede ser invocada a través de la vía de señalización de los bueyes en Arabidopsis. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cómo cultivar Arabidopsis como material vegetal.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras medidas como la hibridación in situ para responder a preguntas adicionales como la expresión de genes específicos de la célula. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la embriogénesis exploren el mecanismo molecular por el cual genes específicos median la embriogénesis en Arabidopsis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar la embriogénesis en Arabidopsis.