Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación

En este video, se presentarán dos métodos, la biotinilación de la superficie celular y la biotinilación de persecución de pulsos. En la siguiente demostración, usaremos astrocitos. Estos son los tipos de células gliales más abundantes en el cerebro, y resultan expresar nuestra proteína de interés, que es la acuaporina-4.

Los métodos que utilizamos en este artículo podrían aplicarse a muchos tipos diferentes de células, y podrían incluir células en suspensión o células adherentes. Estas técnicas se pueden utilizar para estudiar la expresión de la superficie celular y la internalización de prácticamente cualquier proteína transmembrana, siempre que posea un dominio extracelular accesible a la biotina. El objetivo general de este ensayo de biotinilación de la superficie celular es determinar los efectos de la laminina en la expresión del canal permeable al agua Aquaporin-4 en la membrana plasmática de los astrocitos.

Para comenzar este procedimiento, retire los cultivos de astrocitos de la incubadora y deseche el medio por aspiración. Lave las celdas tres veces con cuatro mililitros de CM-PBS frío y coloque los platos sobre hielo picado. Retire el CM-PBS por aspiración y luego pipetee dos mililitros de tampón de biotina en cada pocillo.

Incline suavemente los platos hacia adelante y hacia atrás varias veces para asegurar una cobertura completa antes de colocar los cultivos en hielo durante 30 minutos. A continuación, retire el tampón de biotina, sustitúyalo por cuatro mililitros de tampón de enfriamiento y mantenga los cultivos en hielo durante 10 minutos. A continuación, aspire y reemplace con la misma cantidad de tampón de enfriamiento antes de dejar los cultivos en hielo durante 10 minutos.

A continuación, deseche el tampón de enfriamiento y lave las células tres veces con cuatro mililitros de CM-PBS refrigerado. Después de esto, raspe las células en un mililitro de CM-PBS enfriado y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga. A continuación, granule las células por centrifugación a 100 g durante tres minutos en una microcentrífuga refrigerada ajustada a cuatro grados centígrados.

Después de eso, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón de lisis. Luego, deje las muestras en hielo durante 30 minutos, vórtice cada cinco minutos. A continuación, centrifugar el lisado a 14.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular cualquier detergente y materiales solubles.

Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Guarde 50 microlitros del lisado y agréguele 25 microlitros de tampón de carga tres X. Posteriormente, desnaturalizarlo calentándolo a 95 grados centígrados en un baño seco.

Esta es la fracción de entrada, que contiene tanto proteínas biotiniladas de la superficie celular como proteínas citosólicas no biotiniladas. Con una punta de pipeta cortada, transfiera 75 microlitros de perlas de estreptavidina y agarosa al lisado e incube a cuatro grados centígrados durante tres horas en un agitador. Después de eso, granule las perlas de estreptavidina agarosa por centrifugación a 1, 500 g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados.

Guarde 50 microlitros del sobrenadante y agregue 25 microlitros de tres tampones de carga X. Luego, desnaturalícelo a 95 grados centígrados en un baño de agua o un bloque calefactor. Representa la fracción intracelular y está compuesta principalmente por proteínas citosólicas no biotiniladas.

Después, vuelva a suspender las perlas peletizadas en un mililitro de tampón de lavado y muévalo durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Granule las cuentas y deseche el sobrenadante. Repita este proceso cuatro veces más para minimizar la unión inespecífica de proteínas citosólicas no biotiniladas.

Agregue 50 microlitros de tampón de carga diluido a una X usando tampón de lisis. Libera biotina y estreptavidina de las perlas desnaturalizándolas a 95 grados centígrados. Esta fracción debe contener únicamente proteínas biotiniladas de la superficie celular.

Posteriormente, separar las fracciones de entrada, superficie celular e intracelular mediante SDS-PAGE y analizar mediante Western blot. El objetivo general del experimento de biotinilación de persecución de pulsos es determinar la tasa aproximada de internalización de Aquaporin-4 en astrocitos. Primero, retire los cultivos de astrocitos de la incubadora y aspire el medio.

Luego, lave las celdas tres veces con cuatro mililitros de CM-PBS frío y coloque los platos sobre hielo picado. Aspire el CM-PBS y luego pipetee tres mililitros de tampón de biotina en cada plato. Incline los platos hacia adelante y hacia atrás varias veces para asegurarse de que el tampón esté bien distribuido y déjelos en hielo durante 30 minutos.

Luego, aspire el tampón de biotina y reemplácelo con cinco mililitros de medio tibio. Incubar una placa de cultivo a 37 grados centígrados durante 15 minutos y una segunda placa a la misma temperatura durante 30 minutos. Deje otro plato a cuatro grados centígrados como muestra de minuto cero.

Al final del período de incubación, deseche el medio y lave las células tres veces con cuatro mililitros de CM-PBS refrigerado. A continuación, aspire el CM-PBS y, a continuación, pipetee seis mililitros de tampón reductor sobre las células y deje la muestra en hielo durante 15 minutos. Luego, reemplace el medio con seis mililitros de tampón reductor fresco y coloque la muestra en hielo durante 15 minutos más.

Este paso es crítico ya que el glutatión contenido dentro del tampón reductor escindirá el moasis de biotina que queda en la superficie celular. Esto garantiza que solo las proteínas internalizadas serán marcadas con biotina. Después de eso, retire la solución reductora y reemplácela con seis mililitros de tampón de enfriamiento.

Deje la muestra en hielo durante otros 15 minutos y repita el paso de enfriamiento una vez más. Luego, deseche el tampón de enfriamiento y lave las células tres veces, con cuatro mililitros de PBS enfriado. Aspire el CM-PBS y luego raspe las células en un mililitro de PBS refrigerado, utilizando un elevador de celdas, y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga.

Granular las células por centrifugación a 100 g durante tres minutos. Después de tres minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón de lisis. Deje la muestra en hielo durante 30 minutos y en vórtice cada cinco minutos.

Centrifugar el lisado a 14.000 g, durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, para granular el detergente y los materiales solubles. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Guarde 50 microlitros de este lisado y agregue tampón de carga.

Posteriormente, desnaturalizar las células a 95 grados centígrados, en un baño seco. Esta es la fracción de entrada, que contiene tanto proteínas endocitosas biotiniladas como proteínas no biotiniladas. Con una punta de pipeta cortada, añadir 150 microlitros de la suspensión de estreptavidina agarosa al lisado e incubar a cuatro grados centígrados durante tres horas, en un agitador.

Después de tres horas, granule las perlas de estreptavidina agarosa por centrifugación, a 1.500 g durante 30 segundos, a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender las cuentas en un mililitro de tampón de lavado y muévalas durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Granule las cuentas y deseche el sobrenadante.

Repita este proceso cuatro veces más para minimizar la unión inespecífica de proteínas citosólicas no biotiniladas. A continuación, granule las perlas por centrifugación a 1.500 g durante 30 segundos, a cuatro grados centígrados. Deseche el tampón de lavado suprayacente y agregue 50 microlitros de un tampón de carga.

Libera biotina y estreptavidina de las perlas, desnaturalizando a 95 grados centígrados. Esta fracción debe contener únicamente proteínas de la superficie celular internalizadas. A continuación, separe la entrada, la superficie de la celda y las fracciones no unidas, mediante SDS-PAGE, y analice mediante Western blot.

Aquí se muestran la superficie celular, las fracciones intracelulares y totales de los astrocitos no tratados, y los astrocitos tratados con laminina 24 nanomolar, sondeados para acuaporina-4 y beta-distroglicano. Este histograma ilustra las diferencias en los niveles de superficie celular de acuaporina-4, en los astrocitos no tratados y tratados con laminina, normalizados frente a beta-dytroglicano. En esta figura, las fracciones de proteína internalizadas recolectadas a cero, 15 y 30 minutos, fueron probadas para Aquaporin-4.

Y este histograma, resume la internalización de Aquaporin-4, para cuatro experimentos independientes, normalizados contra los valores para el punto de tiempo de minuto cero. El asterisco indica un aumento estadísticamente significativo en la cantidad de acuaporina-4, endocitada entre 15 y 30 minutos. Cuando se usa glutatión para romper el enlace disulfuro en el análogo de biotina escindible, la contribución de la superficie celular Aquaporin-4 a la fracción biotinilada se reduce drásticamente.

Lo que da como resultado una clara diferencia entre las muestras de minuto cero y las de 15 minutos. Cuando se omite el paso, la señal que se origina en el grupo de superficie de celda hace que el cambio entre los dos puntos de tiempo sea indetectable. Siguiendo este procedimiento, se podrían aplicar otros métodos como la inmunofluorescencia y la microscopía TIRF para responder preguntas adicionales, incluido el tráfico físico de la carga.