Name: Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprende métodos de biotinilación para analizar la expresión en superficie celular y tasas endocíticas de Aquaporin-4 en astrocitos primarios. Estas técnicas permiten estudiar la dinámica de proteínas de membrana en neurociencia.

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Este proyecto fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud PG # 20R47867.

1. Determinación de la expresión relativa de proteína de superficie celular en astrocitos por biotinilación NOTA: Aquí se ilustra la aplicación de esta técnica de biotinilación al estudio de los efectos de la molécula de matriz extracelular laminina en la localización de la superficie celular del canal permeable al agua aquaporin-4 (AQP4). Los materiales especializados requeridos para este ensayo incluyen sulfo-NHS-LC-biotina y resina de estreptavidina-agarosa (ver Tabla de Materiales ). <ol><li> Utilizando el método descrito en Noel et al. 12 , preparar cultivos de astrocitos corticales aproximadamente 2 semanas antes del ensayo y cultivarlos en matraces de cultivo ventilados de 75 cm2. Cuando los astrocitos son confluentes del 80 al 90%, separarlos de la superficie del cultivo usando tripsina al 0,05%, y luego pasarlos 1: 3. </li><li> A las 48 h antes del ensayo, cuando las células están de nuevo 80 - 90% confluentes, los astrocitos de paso 1: 3 (que representan el cEn formato de cultivo) sobre placas de cultivo celular de 60 mm de manera que sean&gt; 70% confluentes el día en que se lleve a cabo el experimento. Asegúrese de que las células estén distribuidas uniformemente entre los platos. </li><li> A las 16 h antes del ensayo, pipetear laminina en medio de cultivo hasta una concentración final de 24 nM, e incubar a 37 ° C. </li><li> Inmediatamente antes del ensayo, se prepara lo siguiente y se coloca en hielo o se refrigera: CM-PBS (100 mg / L de MgCl $ ₂ $ 6H $ ₂ $ O y 100 mg / L de CaCl $ ₂ $ en 1X PBS, pH 7,4), tampón de biotina (50 mM de NH $ ₄ $ Cl en CM-PBS), tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM y NaCl 5 mM EDTA, 1% de triton X-100, 1X inhibidor de proteasa), tampón de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS al 6%, glicerol al 30%, DTT 300 mM y azul al 0,01% de bromofenol) Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X - 100, 1X inhibidor de la proteasa cóctel). </li><li> Movimiento rápido del ojoOve platos que contienen los cultivos de astrocitos de la incubadora, y descartar el medio. </li><li> Lavar las células tres veces con 4 ml de CM-PBS enfriado, y colocar los platos sobre hielo triturado. </li><li> Pipetee 2 mL de tampón de biotina en cada pocillo y incline suavemente los platos hacia adelante y hacia atrás unas cuantas veces para asegurar una cobertura completa. Dejar en el hielo durante 30 min. </li><li> Eliminar el tampón de biotina utilizando un aspirador, y reemplazar con 4 ml de tampón de enfriamiento rápido. Dejar en el hielo durante 10 min. </li><li> Aspirar el tampón de temple, y reemplazar con un volumen equivalente del mismo. De nuevo, dejar en el hielo durante 10 min. </li><li> Deseche el tampón de enfriamiento rápido y lave las células tres veces con 4 ml de CM-PBS enfriado. </li><li> Raspe las células en 1 mL de CM-PBS enfriado utilizando un elevador de células, y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga. </li><li> Pellet células por centrifugación a 100 xg durante 3 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 μl de tampón de lisis. </li><li> Dejar las muestras en hielo durante 30 min, agitar cada 5 min o plAs en un rotador de extremo a extremo a 4 ° C. </li><li> Centrifugar el lisado a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar cualquier material insoluble en detergente. Transferir el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga. <ol><li> Ahorre 50 μl de este lisado y agregue tampón de carga. Luego desnaturalizarla calentando a 95 ° C en un baño seco; Ésta es la fracción de &quot;entrada&quot;, que contiene tanto proteínas de superficie celular biotiniladas, como proteínas citosólicas no biotiniladas. </li></ol></li><li> Alargue la abertura de una punta de pipeta cortando aproximadamente 0,5 cm de material de su extremo usando un par de tijeras afiladas. Utilizando esta punta de pipeta, transfiera 75 μL de perlas de estreptavidina-agarosa (normalmente almacenadas a 4 ° C) al lisado, e incube a 4 ° C durante 3 h en agitador / balancín. <ol><li> Como la estreptavidina-agarosa se vende frecuentemente como una suspensión que contiene 50% de perlas en volumen, suspendida en una solución antimicrobiana, tritura la suspensión para asegurar que las perlasSe suspenden uniformemente y luego pipetean 150 μl de la suspensión en cada muestra. </li></ol></li><li> Estimular las bolas de estreptavidina-agarosa por centrifugación a 1500 xg durante 30 s a 4 ° C. <ol><li> Guardar 50 μl del sobrenadante (añadir el tampón de carga y desnaturalizarlo a 95 ° C en un baño de agua o un bloque de calefacción); Esto representa la fracción &quot;intracelular&quot;, y está compuesto principalmente por proteínas citosólicas no biotiniladas. </li></ol></li><li> Resuspender las perlas en forma de gránulo en 1 ml de tampón de lavado y rozar durante 3 min a 4 ° C. Perlas de gránulos (como en la etapa 1.16), y desechar el sobrenadante. Repita este proceso 4x para minimizar la unión no específica de proteínas citosólicas no biotiniladas. </li><li> Se aglomeran las perlas por centrifugación (1500 xg durante 30 s a 4 ° C) y se desecha el tampón de lavado superpuesto. Añadir 50 μl de tampón de carga 1X (diluido usando tampón de lisis). Liberar biotina y estreptavidina de perlas desnaturalizando esto a 95 ° C; Esta fracciónUld sólo contienen proteínas de la superficie celular biotinilada (fracción &quot;superficie celular&quot;). <ol><li> Separar la entrada, la superficie celular, y las fracciones intracelulares por SDS-PAGE 13 , y analizar por Western Blotting [ 14] . NOTA: Mientras usamos un gel de degradado prefabricado de 4 - 20% en nuestros experimentos, un gel de separación de 12-14% con una capa de apilamiento al 4% (cada uno conteniendo SDS al 0,1%) debería ser suficiente para las proteínas de interés en este estudio. También debe utilizarse un patrón de peso molecular del intervalo de tamaños apropiado. Obsérvese que a veces puede haber un cambio ascendente observable en las masas moleculares aparentes de las proteínas biotiniladas. </li></ol></li></ol> 2. Determinación de la tasa de internalización de proteínas de la superficie celular en astrocitos por biotinilación NOTA: En lo que sigue, se describe un experimento de biotinilación de pulsación-persecución típico usado en este caso para rastrear la endocitosis de AQP4 en astrocitos. EstaSe basa en el método utilizado por Madrid et al. 15 . Los materiales especializados requeridos incluyen sulfo-NHS-SS-biotina, resina de estreptavidina-agarosa, glutatión reducido y yodoacetamida (véase la Tabla de Materiales ). <ol><li> Preparar cultivos de astrocitos corticales de ratón en placas de 60 mm utilizando los métodos descritos en la sección anterior. Asegúrese de que las células son aproximadamente el 70% confluentes en el día del ensayo, y que cada plato contiene un número equivalente de células. </li><li> Inmediatamente antes del ensayo, se prepara lo siguiente y se coloca sobre hielo o se refrigera: CM-PBS (100 mg / L de MgCl $ ₂ $ 6H $ ₂ $ O y 100 mg / L de CaCl $ ₂ $ en 1X PBS, pH 7,4), tampón de biotina ), Tampón reductor (glutation reducida 50 mM, NaCl 75 mM y NaOH 75 mM), tampón de enfriamiento rápido (yodoacetamida 50 mM, BSA al 1%, en CM - PBS), Tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM y EDTA 5 mM, triton X-100 al 1%, 1X), tampón de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS al 6%, glicerol al 30%, DTT 300 mM y azul al 0,01% de bromofenol) y tampón de lavado (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1,5 mM, 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1X inhibidor de proteasa cóctel). </li><li> Preparar el medio de cultivo celular fresco (DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), penicilina / estreptomicina al 1% y L-glutamina al 1%) y colocarlo en un baño de agua a 37ºC. </li><li> Eliminar los cultivos de astrocitos de la incubadora, y aspirar el medio con un aspirador. </li><li> Lavar las células tres veces con 4 ml de CM-PBS enfriado, y colocar los platos sobre hielo triturado. </li><li> Pipetee 3 mL de tampón de biotina en cada plato, incline los platos hacia adelante y hacia atrás unas cuantas veces para asegurar que el tampón esté bien distribuido y deje esto en hielo durante 30 min. </li><li> Aspirar el tampón de biotina, y reemplazarlo con 5 mL de medio caliente. Incubar un plato de cultivo a 37 ° C durante 15 min, y un segundo plato a la misma temperatura durante 30 min. Deja otro plato a 46; C como la muestra de 0 min. </li><li> Al final del período de incubación, se desecha el medio y se lavan las células tres veces con 4 ml de CM-PBS enfriado. Pipetear 6 ml de tampón reductor sobre las células, y dejar en hielo durante 15 min. </li><li> Eliminar el tampón reductor y luego reemplazar con 6 ml de tampón reductor fresco. Colóquelo en hielo durante 15 minutos más. </li><li> Eliminar la solución reductora y reemplazar con 6 ml de tampón de enfriamiento rápido. Dejar en hielo durante 15 min. </li><li> Repita el paso de enfriamiento una vez más. </li><li> Deseche el tampón de enfriamiento rápido y lave las células tres veces con 4 ml de PBS enfriado. </li><li> Raspe las células en 1 mL de PBS enfriado utilizando un elevador de células, y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga. </li><li> Pellet células por centrifugación a 100 xg durante 3 min. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 500 μ l de buffer de lisis. </li><li> Dejar esto en hielo durante 30 min y agitar cada 5 min. Alternativamente, coloque las muestras en un rotador de extremo a extremo a 4 ° C durante esta duración. </li><li> Centrifugar laA 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar los materiales insolubles en detergente, y luego transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Ahorre 50 μl de este lisado, agregue tampón de carga y desnaturación a 95 ° C en un baño seco; Ésta es la fracción de &quot;entrada&quot;, que contiene tanto proteínas endocitadas biotiniladas, como proteínas no biotiniladas. </li><li> Utilizando una punta de pipeta cortada, añada 150 μL de la suspensión de estreptavidina-agarosa al lisado e incube a 4 ° C durante 3 h en agitador / balancín. Vea 1.15 para más detalles sobre este paso. </li><li> Estimular las bolas de estreptavidina-agarosa por centrifugación a 1.500 xg durante 30 s a 4 ° C. </li><li> Resuspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado y rozar durante 3 min a 4 ° C. Perlas de gránulos (según el paso 2.18), y desechar el sobrenadante. Repita este proceso 4x para minimizar la unión no específica de proteínas citosólicas no biotiniladas. </li><li> Perlas de pelet mediante centrifugación a 1.500 xg durante 30 s, a 4 ° C, y descarte oveRlying buffer de lavado. Añadir 50 mu l de tampón de carga 1X (diluido usando tampón de lisis). Liberar biotina y estreptavidina de perlas desnaturalizando a 95 ° C; Esta fracción debe contener sólo proteínas de la superficie celular internalizadas (fracción &quot;endocytosed&quot;). </li><li> Separar la entrada, la superficie de la célula, y las fracciones no unidas por SDS-PAGE 13 , y analizar por western blotting [ 14] . NOTA: Mientras usamos un gel de degradado prefabricado de 4 - 20% en nuestros experimentos, un gel de separación de 12-14% con una capa de apilamiento al 4% (cada uno conteniendo SDS al 0,1%) debería ser suficiente para las proteínas de interés en este estudio. También debe utilizarse un patrón de peso molecular del intervalo de tamaños apropiado. Obsérvese que a veces puede haber un cambio ascendente observable en las masas moleculares aparentes de las proteínas biotiniladas. </li></ol>

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Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Modificaciones: Como estos métodos fueron diseñados para su uso con células adherentes, hemos especificado el uso de PBS que contiene 100 mg / L de MgCl2 ∙ 6H 2 O y 100 mg / L de CaCl2 (CM-PBS) para las etapas de lavado y como la base de ciertos tampones para asegurar que las células permanecen unidas a la superficie de cultivo y que las uniones célula-célula no se interrumpen. Sin embargo, los protocolos también se pueden aplicar a tipos de células no adhe...

Las proteínas en la superficie celular desempeñan una variedad de funciones centrales para mantener la función celular. En numerosos casos, su actividad depende o modulada por procesos endocíticos que los secuestran temporalmente en sitios intracelulares o que los dirigen hacia vías de degradación 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Aquí, destacamos dos enfoques basados ​​en la biotinilación diseñados para permitir al usuario identificar y aislar específicamente proteínas expresadas en la membrana plasmática, y las nuevas internalizadas. A través de estos métodos, se puede cuantificar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de cualquier proteína de interés, permitiendo así una evaluación más clara de su regulación. Determinación de la expresión relativa de la proteína de la superficie celular por biotinilación La biotina, o vitamina B7, anteriormente conocida como vitamina H 6 , es una pequeña molécula soluble en agua que puede usarse para modificar químicamente grupos reactivos de amina, sulfhidrilo y carboxilo de moléculas biológicas. El cultivo actual de reactivos de biotinilación de la superficie celular consiste principalmente en ésteres de N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) sulfonados y impermeables a la membrana de biotina o sus derivados, diseñados para reaccionar con las aminas presentes en las cadenas laterales de residuos de lisina de proteínas expresadas en La superficie celular cuando éstas se desprotonan en condiciones básicas, dando como resultado que este último forme un enlace amida con el resto biotina 7 . Las proteínas de la superficie celular modificadas de este modo pueden aislarse a continuación mediante el uso de avidina, una proteína tetramérica de 66 - 69 kDa que posee una gran afinidad por la biotina, uniéndose a ésta con una constante de disociación de aproximadamente 10-15 , marcándola como una de las Las interacciones no covalentes más fuertes conocidas 8 </suP&gt; , 9 . En estudios previos se han utilizado varios métodos alternativos para cuantificar la expresión de proteínas en la superficie celular. El etiquetado de células no permeabilizadas usando anticuerpos marcados fluorescentemente específicos para la proteína de interés, seguido por visualización a través de microscopía de fluorescencia, por ejemplo, es un enfoque comúnmente empleado, pero depende en gran medida de la disponibilidad de anticuerpos que pueden unirse a epítopos extracelulares. Más recientemente, también se han empleado con éxito métodos que implican el uso de proteínas quiméricas que portan fluoróforos sensibles al pH que reaccionan a estar expuestos a medios ácidos. Sin embargo, tales ensayos implican usualmente la expresión exógena de estas construcciones en líneas celulares en las que la proteína de interés no se encuentra de forma nativa. Estos enfoques son, no obstante, capaces de proporcionar información valiosa sobre la localización subcelular y el itinerario exocítico de laY por lo tanto deben usarse conjuntamente con los enfoques basados ​​en la biotinilación descritos aquí si las herramientas están disponibles. En un ensayo de biotinilación típico, las células se lavan primeramente a fondo en PBS a 4ºC. Esto elimina cualquier traza de proteínas de suero introducidas por el medio de cultivo, asegurando así que éstas no consumirán cantidades en exceso de biotina en la siguiente etapa. Más importante aún, la reducción de la temperatura hace que la endocitosis desacelere significativamente. A continuación se añade el reactivo de biotinilación. A continuación, se lavan de nuevo las células y después se incuban con un tampón de enfriamiento que contiene glicina o NH4Cl, cuyo propósito es inactivar todas las trazas restantes de biotina sin reaccionar. A continuación se lisan las células, tras lo cual se agrega estreptavidina inmovilizada con agarosa para precipitar las proteínas biotiniladas. El análisis se realiza comúnmente mediante Western Blot, lo que permite la relativa expresión de la superficie celular de diversos prOteins a ser cuantificados. Debido a la base de este ensayo, es adecuado para su uso sólo con proteínas que poseen porciones expuestas al medio extracelular. Las proteínas transmembrana multipaso, que poseen probablemente un número de lisinas reactivas dentro de sus regiones de bucle, son las más susceptibles a este método, mientras que las proteínas de una sola pasada tienden a ser menos susceptibles a ser biotiniladas. Incluso en estos casos, existe la posibilidad de que los cambios conformacionales o las interacciones intermoleculares puedan ocluir ciertos sitios reactivos, dando como resultado un rendimiento de biotinilación inferior al esperado. Determinación de la tasa de internalización de las proteínas de la superficie celular por biotinilación Los principios de este ensayo son en gran parte similares a los de la biotinilación de la superficie celular, con un número de excepciones, el más importante de los cuales es el uso de reactivos de biotinilación reversibles. Los grupos de biotina (de estos) poseen disuLos enlaces fijos, dentro de sus estructuras, que son susceptibles a agentes reductores; Esto se explota para garantizar que sólo las proteínas de la superficie celular tomadas en sitios intracelulares durante el período de ensayo se dejará biotinilado. Un ensayo generalmente tiene lugar de la siguiente manera. Primero se lavan las células y se biotinilan con reactivos fríos, después se reintroduce el medio de cultivo celular a 37 ° C y las células se devuelven a la incubadora; Esto hace que las proteínas de la superficie celular marcadas se sometan a endocitosis. El agente reductor glutatión - que no puede penetrar en la membrana - se añade entonces para romper los enlaces disulfuro de los restos de biotina unidos a proteínas que permanecen en la superficie celular. Finalmente, los enlaces disulfuro rotos se hacen reaccionar con yodoacetamida, consumiendo los grupos tiol lábil e impidiendo que los enlaces se reformen. Como antes, las células se lisan a continuación, y las proteínas marcadas se precipitan usando estreptavidina-agarosa. El disco de limitacionesUssed en la sección anterior también se aplican aquí debido a las similitudes compartidas entre los métodos. Además, vale la pena tener en cuenta que los cambios de temperatura implicados en este ensayo impiden la determinación exacta de la cantidad de proteína que se endocitosa para cada incremento de tiempo, particularmente en el caso de proteínas rápidamente internalizadas o que reciclan rápidamente. Por lo tanto, el ensayo sólo proporciona una estimación semicuantitativa de las tasas endocíticas. La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total puede usarse para rastrear la absorción de cada vesícula cargada y proporcionar una medición más precisa de la cinética de la endocitosis. Por lo tanto, puede proporcionar un complemento muy útil para este ensayo, suponiendo que una construcción quimérica etiquetada con fluorescencia de la proteína de interés está disponible [ 11] .

<table><tbody><tr><td>Cloruro de amonio (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiaminatetraacetato disódico dihidratado ( EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Bio-Rad</td><td>#163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de la membrana basal del sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Descongelar en hielo.</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-&beta;-actina de ratón (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-&beta;-distroglicano de ratón (43DAG1/8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidasa AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidasa AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión reducido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Resina de estreptavidina y agarosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-AQP4 de conejo</td><td>Alomone</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base (Trizma base)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Las proteínas de la superficie celular median una amplia gama de funciones. En muchos casos, su actividad está regulada por procesos endocíticos que modulan sus niveles en la membrana plasmática. Aquí, presentamos protocolos detallados para 2 métodos que facilitan el estudio de estos procesos, los cuales se basan en el principio de la biotinilación de las proteínas de la superficie celular. El primero está diseñado para permitir la determinación semi-cuantitativa de los niveles relativos de una proteína particular en la superficie celular. En él, los residuos de lisina de las proteínas de membrana plasmática de células se marcan primero con un resto de biotina. Una vez que las células se lisan, estas proteínas pueden ser precipitadas específicamente mediante el uso de estreptavidina inmovilizada con agarosa explotando la afinidad natural de ésta con la biotina. Las proteínas aisladas de tal manera pueden analizarse a continuación mediante un procedimiento de transferencia Western estándar. El segundo método proporciona un medio para determinar la velocidad endocítica de una partículaAr de la superficie celular durante un período de tiempo. Las proteínas de la superficie celular se modifican primero con un derivado de biotina que contiene un enlace disulfuro escindible. Las células se desplazan de nuevo a condiciones normales de cultivo, lo que provoca la captación endocítica de una proporción de proteínas biotiniladas. A continuación, los enlaces disulfuro de los grupos de biotina no internalizados se reducen usando el agente reductor impermeable a la membrana glutatión. A través de este enfoque, las proteínas endocitadas pueden aislarse y cuantificarse con un alto grado de especificidad.

El uso de la biotinilación de la superficie celular para evaluar la expresión de la membrana plasmática de AQP4 en astrocitos Los cultivos de astrocitos tratados con laminina y las células control no tratadas se sometieron a biotinilación de superficie celular utilizando los métodos descritos. Las proteínas biotiniladas se precipitaron con estreptavidina conjugada con agarosa, y luego se separaron por SDS-PAGE. Las fracciones de la superficie celular fueron probad...

En este informe se presentan dos métodos basados ​​en la biotinilación, diseñados para determinar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas expresadas en la membrana plasmática.

Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

En este video, se presentarán dos métodos: biotinilación en la superficie celular y biotinilación de pulso y caza. En la siguiente demostración, utilizaremos astrocitos. Estos son los tipos de células gliales más abundantes en el cerebro, y resulta que expresan nuestra proteína de interés, la Acuaporina-4.Los métodos que utilizamos en este artículo podrían aplicarse a muchos tipos celulares diferentes, que podrían incluir tanto células en suspensión como células adherentes. Estas técnicas pueden emplearse para estudiar la expresión en la superficie celular y la internalización de prácticamente cualquier proteína transmembrana, siempre que posea un dominio extracelular accesible a la biotina. El objetivo general de este ensayo de biotinilación de superficie celular es determinar los efectos de la laminina sobre la expresión del canal permeable al agua Aquaporina-4 en la membrana plasmática de los astrocitos.Para comenzar este procedimiento, retire los cultivos de astrocitos del incubador y deseche el medio mediante aspiración. Lave las células tres veces con cuatro mililitros de CM-PBS frío y coloque las placas sobre hielo triturado. Retire el CM-PBS mediante aspiración y luego pipetee dos mililitros de tampón de biotina en cada pocillo.Incline suavemente las placas hacia adelante y hacia atrás varias veces para asegurar una cobertura completa antes de colocar los cultivos en hielo durante 30 minutos. Posteriormente, retire el tampón de biotina, reemplácelo con cuatro mililitros de tampón de bloqueo y mantenga los cultivos en hielo durante 10 minutos. A continuación, aspire y reemplace con la misma cantidad de tampón de bloqueo antes de dejar los cultivos en hielo durante 10 minutos.Luego, deseche el tampón de extinción y lave las células tres veces con cuatro mililitros de CM-PBS frío. A continuación, raspe las células en un mililitro de CM-PBS frío y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrifugado. Después, forme un pellet celular por centrifugación a 100 g durante tres minutos en un microcentrífugo refrigerado ajustado a cuatro grados Celsius.A continuación, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 500 microlitros de tampón de lisis. Luego, deje las muestras en hielo durante 30 minutos, vortexeando cada cinco minutos. A continuación, centrifugue el lisado a 14.000 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para obtener un precipitado con cualquier detergente y materiales solubles.Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrifugado. Guarde 50 microlitros del lisado y agregue 25 microlitros de tampón de carga tres X. Posteriormente, desnáturalo mediante calentamiento a 95 grados Celsius en un baño seco.Esta es la fracción de entrada, que contiene tanto proteínas de la superficie celular biotiniladas como proteínas citosólicas no biotiniladas. Utilizando una punta de pipeta cortada, transfiera 75 microlitros de perlas de agarosa con estreptavidina al lisado e incúbelo a cuatro grados Celsius durante tres horas en agitación. Después, centrifugue las perlas de agarosa con estreptavidina a 1.500 ×g durante 30 segundos a cuatro grados Celsius para formar el precipitado.Guarde 50 microlitros del sobrenadante y agregue 25 microlitros de tampón de carga tres veces X. Luego, desnaturalice a 95 grados Celsius en un baño de agua o un bloque calefactor. Esta fracción representa la fracción intracelular y está compuesta principalmente por proteínas citosólicas no biotiniladas.Posteriormente, re suspenda las perlas sedimentadas en un mililitro de tampón de lavado y agítelas durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Sedimente las perlas y deseche el sobrenadante. Repita este proceso cuatro veces más para minimizar la unión no específica de proteínas citosólicas no biotiniladas.Añada 50 microlitros de tampón de carga diluido a una concentración de uno X utilizando tampón de lisis. Libere la biotina y la estreptavidina de las perlas mediante la desnaturalización a 95 grados Celsius. Esta fracción debe contener únicamente proteínas biotiniladas de la superficie celular.Posteriormente, separe las fracciones de entrada, superficie celular e intracelular mediante SDS-PAGE y analice por inmunotransferencia. El objetivo general del experimento de biotinilación pulsocaza es determinar la tasa aproximada de internalización de la acuaporina-4 en astrocitos. Primero, retire los cultivos de astrocitos del incubador y aspire el medio.Luego, lave las células tres veces con cuatro mililitros de CM-PBS frío y coloque las placas sobre hielo triturado. Aspire el CM-PBS y luego agregue tres mililitros de tampón de biotina en cada placa mediante pipeta. Incline las placas hacia adelante y hacia atrás varias veces para asegurar una buena distribución del tampón y déjelas sobre hielo durante 30 minutos.Luego, aspire el tampón de biotina y sustitúyalo con cinco mililitros de medio tibio. Incube un cultivo a 37 grados Celsius durante 15 minutos y un segundo cultivo a la misma temperatura durante 30 minutos. Deje otro cultivo a cuatro grados Celsius como muestra de tiempo cero.Al final del período de incubación, deseche el medio y lave las células tres veces con cuatro mililitros de CM-PBS frío. Posteriormente, aspire el CM-PBS y luego pipetee seis mililitros de tampón reductor sobre las células, dejando la muestra en hielo durante 15 minutos. A continuación, reemplace el tampón con seis mililitros de tampón reductor fresco y coloque la muestra en hielo durante 15 minutos adicionales.Este paso es crítico, ya que el glutatión contenido en el tampón reductor escindirá el resto de biotina presente en la superficie celular. Esto asegura que únicamente las proteínas internalizadas estarán marcadas con biotina. A continuación, retire la solución reductora y sustitúyala con seis mililitros de tampón amortiguador.Deje la muestra en hielo durante otros 15 minutos y repita el paso de extinción una vez más. Luego, deseche el tampón de extinción y lave las células tres veces con cuatro mililitros de PBS frío. Aspire el CM-PBS y luego raspe las células en un mililitro de PBS frío, utilizando un levantador celular, y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrifugado.Centrifugar las células a 100 g durante tres minutos para formar un precipitado. Después de tres minutos, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 500 microlitros de tampón de lisis. Dejar la muestra en hielo durante 30 minutos y agitar en vórtex cada cinco minutos.Centrifugar el lisado a 14 000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para formar un precipitado con el detergente y los materiales solubles. A continuación, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Guardar 50 microlitros de este lisado y añadir tampón de carga.Posteriormente, desnature las células a 95 grados celsius en un baño seco. Esta es la fracción de entrada, que contiene tanto proteínas endocitadas biotiniladas como proteínas no biotiniladas. Utilizando una punta de pipeta cortada, agregue 150 microlitros de la suspensión de agarosa estreptavidina al lisado e incube a cuatro grados celsius durante tres horas en un agitador.Después de tres horas, centrifugar las perlas de agarosa con estreptavidina a 1.500 g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados. Suspender nuevamente las perlas en un mililitro de tampón de lavado y agitar durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Centrifugar las perlas y desechar el sobrenadante.Repita este proceso otras cuatro veces para minimizar la unión no específica de proteínas citosólicas no biotiniladas. Luego, haga un pellet de las perlas mediante centrifugación a 1.500 g durante 30 segundos a cuatro grados Celsius. Deseche el tampón sobrenadante de lavado y agregue 50 microlitros de tampón de carga 1x.Liberar la biotina y la estreptavidina de las perlas mediante desnaturalización a 95 grados Celsius. Esta fracción debe contener únicamente proteínas de la superficie celular internalizadas. Luego, separar las fracciones de entrada, de superficie celular y no unidas mediante electroforesis SDS-PAGE y analizar mediante inmunotransferencia (Western blotting).Se muestran aquí las fracciones de superficie celular, intracelular y total provenientes de astrocitos no tratados y de astrocitos tratados con 24 nanomoles de laminina, analizadas para Aquaporina-4 y beta-distroglicano. Este histograma ilustra las diferencias en los niveles de Aquaporina-4 en la superficie celular de astrocitos no tratados y tratados con laminina, normalizados frente al beta-distroglicano. En esta figura, las fracciones de proteínas internalizadas recolectadas a los cero, 15 y 30 minutos fueron analizadas para Aquaporina-4.Y este histograma resume la internalización de la acuaporina-4, correspondiente a cuatro experimentos independientes, normalizados respecto a los valores del punto temporal de cero minutos. El asterisco indica un aumento estadísticamente significativo en la cantidad de acuaporina-4 endocitada entre los 15 y los 30 minutos. Cuando se utiliza glutatión para romper el enlace disulfuro en el análogo de biotina escindible, la contribución de la acuaporina-4 de la superficie celular a la fracción biotinilada se reduce drásticamente.Lo que resulta en una diferencia clara entre las muestras de cero minutos y de 15 minutos. Cuando se omite este paso, la señal proveniente del grupo de proteínas en la superficie celular hace que el cambio entre los dos puntos de tiempo sea indetectable. Tras seguir este procedimiento, se podrían aplicar otros métodos como inmunofluorescencia y microscopía de fluorescencia por reflexión interna total (TIRF) para responder preguntas adicionales, incluyendo el tráfico físico de la carga.

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Investigación

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Neurociencia

Endocitosis regulado regula los niveles de expresión de la superficie celular de la mayoría de las proteínas de la membrana. Aquí se utilizan los reactivos reducible, la membrana impermeant biotinilación para medir la tasa de endocitosis del transportador de dopamina (DAT), una proteína de membrana politópica. El método facilita un método directo para medir la tasa de endocitosis de la mayoría de las proteínas de la membrana plasmática.

Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Este video muestra el aislamiento de proteínas intracelulares y de superficie celular a partir de un cultivo de astrocitos. El cultivo de astrocitos se coloca en hielo para inhibir la endocitosis y, a continuación, las proteínas de la superficie celular se marcan con un reactivo de biotinilación. Las células se lisan para liberar las proteínas biotiniladas de la superficie celular y las proteínas intracelulares no biotiniladas. Por último, las perlas recubiertas de estreptavidina se utilizan...

Aislamiento de proteínas intracelulares y de superficie celular a partir de un cultivo de astrocitos

Este video muestra un método para evaluar la internalización de proteínas diana en los astrocitos corticales de ratón utilizando biotinilación, seguida de lisis celular, extracción de proteínas basada en estreptavidina, desnaturalización y análisis de Western blot para confirmar la internalización exitosa.

Evaluación de la internalización de proteínas de superficie diana utilizando un derivado de la biotina

Fuente: Creighton, B. A., et al. Visualización y análisis del transporte intracelular de orgánulos y otras cargas en astrocitos. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la visualización del transporte de carga intracelular en astrocitos cultivados utilizando una sonda acidotrópica fluorescente que etiqueta selectivamente vesículas endolisosomales ácidas. Las imágenes de lapso de tiempo y la adquisición de pila Z con un microscopio confocal permiten el seguimiento de la carga marcada con...

Visualización del transporte intracelular de carga en astrocitos cultivados

El tráfico de membrana implica el transporte de proteínas desde la membrana plasmática hasta el interior de la célula (es decir, endocitosis) seguido de un tráfico a los lisosomas para su degradación o a la membrana plasmática para su reciclaje. Los métodos descritos en este artículo están diseñados para estudiar la endocitosis y el reciclaje de las proteínas de la membrana plasmática.

Los ensayos de protección de L-glutatión basados en células para estudiar la endocitosis y el reciclaje de proteínas de la membrana plasmática

El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

Aquí se presenta un protocolo que combina un sistema de cocultivo endotelial neuronal in vitro e incorporación metabólica de sialoglicano con grupos funcionales bioortogonales para expandir las células primarias del tallo neural y del progenitor y etiquetar su superficie sialoglycoproteínas para el análisis de imágenes o espectrometría de masas de marcadores de superficie celular.

Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Este artículo presenta un método para estudiar el tráfico de receptores de glutamato (GluR) en cultivos hipocampales primarios disociados. Utilizando un enfoque de alimentación de anticuerpos para etiquetar receptores endógenos o sobreexpresados en combinación con enfoques farmacológicos, este método permite la identificación de mecanismos moleculares que regulan la expresión superficial de GluR modulando procesos de internalización o reciclaje.

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Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

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Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación (Video) | JoVE Journal

Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación

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