In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

El objetivo general de este procedimiento es permitir la obtención de imágenes de células vivas de cigotos y embriones de Arabidopsis para visualizar la dinámica de su embriogénesis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo de plantas sobre cómo se genera la asimetría del cigoto y la morfología del embrión. La principal ventaja de esta técnica es que podemos rastrear la dinámica viva de la polarización del cigoto y el patrón embrionario.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación con un dispositivo de micropilar y los óvulos son difíciles de explicar solo con texto. Para preparar el dispositivo de matriz de micropilares PDMS, primero corte el dispositivo para que quepa en un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros y esterilice los lados superior e inferior del dispositivo con una exposición a la luz ultravioleta de 15 minutos por lado. Cuando todos los lados hayan sido esterilizados, transfiera el dispositivo PDMS a una nueva placa de cultivo de 35 milímetros y agregue de cinco a siete mililitros de medio N5T fresco a la placa, hasta que el dispositivo esté completamente sumergido.

A continuación, coloque el plato en una cámara de vacío y reduzca la presión, dejando el dispositivo en el vacío hasta que todo el aire del dispositivo haya sido sustituido por un medio. Cuando el dispositivo se haya desgasificado, use pinzas de punta cuadrada para frotar el dispositivo en un trozo de toalla de papel para eliminar el exceso de medio de los lados y la parte inferior. A continuación, coloque el dispositivo sobre un vaso deslizante de 76 por 26 milímetros y cúbralo con una tapa de plato de cultivo de 35 milímetros para mantener el dispositivo hidratado.

Antes de comenzar la disección, esterilice una aguja de 0,40 milímetros y pinzas finas con etanol al 70 por ciento. A continuación, verifique la inflorescencia de la planta para permitir la selección de las silicuas apropiadas para el experimento. Las silicuas de aproximadamente cinco milímetros contienen cigotos y las silicuas de ocho a 10 milímetros incluyen embriones globulares jóvenes.

Con unas pinzas, transfiera de tres a cuatro siliconas de interés a un trozo de cinta adhesiva de doble cara en un vidrio deslizante de 76 por 26 milímetros. A continuación, transfiera el portaobjetos bajo un microscopio estereoscópico y utilice la aguja y las pinzas para abrir las paredes del ovario. Transfiera las silicuas abiertas a la matriz de micropilares del dispositivo PDMS y libere los óvulos en el medio.

A continuación, coloque una cubierta de vidrio de 18 por 18 milímetros en el dispositivo para empujar los óvulos hacia los espacios de la matriz de micropilares. Cuando los óvulos estén en su lugar, use pinzas o dedos para sacar el cubreobjetos horizontalmente del dispositivo para eliminar cualquier exceso de medio, y coloque el dispositivo boca abajo en un nuevo plato con fondo de vidrio de 35 milímetros. Use la punta de las pinzas cuadradas para presionar ligeramente el dispositivo en el fondo del plato y vierta medio N5T fresco en el plato hasta que el dispositivo esté completamente sumergido.

A continuación, sella el plato con parafilm. Para obtener imágenes de lapso de tiempo de los óvulos, transfiera la placa a la platina de un microscopio invertido y use el marcador de fluorescencia para seleccionar los óvulos para la obtención de imágenes. Cuando se hayan localizado los óvulos óptimos, comience a tomar imágenes en vivo de las muestras de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Este sistema de cultivo de óvulos permite rastrear la dinámica viva de la polarización del cigoto y el patrón embrionario. Por ejemplo, aquí se observa la acumulación de microtúbulos en forma de anillo transversal, seguida de su formación en un huso. Luego, las células embrionarias se dividen cuatrimestralmente para formar una forma globular radialmente simétrica.

Sin embargo, el tratamiento de los óvulos cultivados con un inhibidor de la polimerización de actina inhibe la migración nuclear polar, lo que resulta en una división más simétrica del cigoto y sugiere un papel de los filamentos de actina en la polarización del cigoto. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar la disrupción con láser para responder preguntas adicionales sobre el papel de la comunicación de célula a célula en el patrón embrionario.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar eventos ajustados durante la embriogénesis.