Name: Secuencia de la DNA Nanopore para análisis de metagenómica suelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprende secuenciación nanopore para análisis metagenómico de suelo usando ADN de alto peso molecular y kits rápidos. Este método permite generar datos en tiempo real con más de 125,000 lecturas para identificación de organismos mediante BLASTN y BLASTX en aulas.

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Este proyecto fue apoyo en parte por la Universidad de Johns Hopkins, oficina del Rector a través de la iniciativa científica de puerta de enlace.

Nota: Metagenómica ADN es purificado de suelo (Condado de Baltimore, Maryland) con un aislamiento de genomic de suelo disponible en el mercado kit (véase Tabla de materiales). Utilizando un espectrofotómetro UV (véase Tabla de materiales), el ADN genómico purificado debe tener una proporción de 260/280 (nm) &#62; 1.8 y una proporción de 260/230 entre 2.0-2.2 para asegurar que la muestra está libre de contaminantes. La cantidad de la DNA genomic para las gamas de 200 NS ng 2 μg.
1. método de preparación de la biblioteca rápido (protocolo corto)
Nota: Este es un protocolo corto. Para el kit de secuenciación rápida Consulte la Tabla de materiales .
<ol>
	<li>De 0,2 mL tubo de paredes delgadas (véase Tabla de materiales) Añadir 200 ng de alto peso molecular ADN en una final de volumen de 7.5 μl de agua destilada.</li>
	<li>Añadir 2,5 μl de mezcla de fragmentación (FM) desde el kit de biblioteca rápida preparación y mezclar suavemente por inversión. Centrífuga de pulso a la desactivación (1.000 x g durante 5 s).</li>
	<li>Coloque la muestra en un termociclador (véase Tabla de materiales) para una ronda a 30 ° C durante 1 min seguido de 75 ° C durante 1 minuto Retire el tubo y pulso centrífuga para girar por la muestra.</li>
	<li>Añadir 1 μl de adaptador rápido y 0,2 μl de la mezcla principal de blunt/TA ligasa y luego almacenar la biblioteca adaptada y anclada en el hielo. Nota: Si utiliza el protocolo corto proceda al paso 8</li>
</ol>
2. ligadura secuencia de protocolo (protocolo largo): Fragmentación del ADN de metagenómica
Nota: Ver Tabla de materiales para el kit de secuenciación de la ligadura.
<ol>
	<li>Diluir 1 μg de ADN genómico purificado a un volumen final de 46 μl de agua desionizada.</li>
	<li>Transferencia de la muestra a una fragmentación del ADN del tubo (véase Tabla de materiales) y centrifugue durante 1 min a temperatura ambiente a 8.000 x g utilizando una microcentrífuga (véase Tabla de materiales) para producir fragmentos genomic ~ 8 kb. Asegúrese de que ha pasado todo el líquido en el tubo de colección.</li>
	<li>Invertir el tubo de la fragmentación, retorno a la centrífuga y centrifugue durante 1 minuto para recoger el ADN genómico fragmentado en la cámara baja.</li>
	<li>Transferir el ADN genómico fragmentado a un tubo de 1,5 mL estéril bajo ADN vinculante y analizar una porción en un gel de agarosa de bajo porcentaje (0,6%) para confirmar la fragmentación &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. fragmentación de ADN genómico preparación final
<ol>
	<li>Con 800 ng de ADN genómico fragmentado en 45 μl de agua desionizada, agregue 7 μl finales de preparación para la reacción (véase Tabla de materiales), mezcla de enzima de 3 μl de tampón (véase Tabla de materiales) y 5 μl de nucleasa agua libre.</li>
	<li>Mezcla por inversión y pulso centrífuga (1.000 x g durante 5 s).</li>
	<li>Transferir la muestra a un tubo de paredes delgadas de 0.2 mL e incubar la muestra durante 5 minutos a 20 ° C, seguido por la incubación a 65 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Centrífuga de pulso para llevar contenido a la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja ADN vinculante.</li>
	<li>Preparar bolas magnéticas (véase tabla de materiales). Agregar 60 μL de granos resuspendidos a la reacción de preparación final de paso 3.5 y mezclar mediante pipeteo.</li>
	<li>Incubar en un mezclador rotador a 100 rpm (véase Tabla de materiales) por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pulso Centrifugue la muestra a los granos de la pelotilla, luego coloque la muestra junto al imán.</li>
	<li>Una vez que los granos se adhieren al imán, pipetee sobrenadante y desechar.</li>
	<li>Retire el tubo de las perlas de imán y lavado con 200 μL de etanol al 70% recién preparada transfiriendo suavemente la muestra altibajos.</li>
	<li>Centrífuga de pulso para los granos de la pelotilla y volver al imán.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y deséchelo. Repetir el lavado con 200 μL de etanol al 70%.</li>
	<li>Centrifugar el tubo de retorno al imán y quitar todo el lavado de etanol 70%.</li>
	<li>Con la tapa del tubo de microcentrífuga abierta, seque los granos al aire durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el tubo del imán y suspender el sedimento en 31 μl de agua estéril, libre de nucleasas. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Regresar el tubo al imán hasta que todos los granos han peleteado y el efluente es claro.</li>
	<li>Transferir el eluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Utilizando 1 μl de muestra, cuantificar el ADN preparado final utilizando un espectrofotómetro UV a 260 nm (véase Tabla de materiales). Nota: La recuperación por ciento debe ser ~ 70% (700 ng) de una concentración inicial de 1 μg de ADN genómico.</li>
</ol>
4. adaptador y correa además de fragmentos de ADN genómico preparado final
<ol>
	<li>Mezcle el ligase de la blunt/TA tubos de master mix por inversión y luego pulso centrífuga para dar contenido a la parte inferior.</li>
	<li>Añadir 20 μl de mezcla de adaptador y 50 μl de la mezcla principal de ligadura blunt/TA con 30 μl de ADN preparado final.</li>
	<li>Mezclar por inversión, centrífuga de pulso e incubar 10 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>
5. magnético Bead preparación
<ol>
	<li>Vórtice de los granos y luego transfiera 50 μl de suspensión granos a una microcentrífuga de 1.5 mL del tubo.</li>
	<li>Coloque el tubo en el imán para que sedimenten los granos hasta que el eluido se borra.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y deséchelo.</li>
	<li>Añada 100 μl de tampón de unión del grano (véase Tabla de materiales para el kit de grano) para las cuentas del vórtice para suspender de nuevo los granos, los granos en el imán de la pelotilla, quite el sobrenadante y deséchelo. Repetir el lavado con 100 μl de tampón de Unión.</li>
	<li>Añada 100 μl de tampón de unión del grano a los granos lavados. Vortex para suspender de nuevo las cuentas.</li>
</ol>
6. Biblioteca depuración
<ol>
	<li>Usando una micropipeta P200, agregar 40 μl de granos del paso anterior a la DNA genomic adaptado/atado. Mezclar cuidadosamente la muestra mediante pipeteo.</li>
	<li>Incubar la muestra en un mezclador rotador a 100 rpm por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque la muestra en el imán y permitir que las cuentas resolver. Pipeta del sobrenadante y deséchelo.</li>
	<li>Resuspender los granos en 140 μl de tampón de unión del grano mediante pipeteo. Coloque la muestra contra el imán, deseche el sobrenadante y lavar nuevamente con otro 140 μl de tampón de unión de grano.</li>
	<li>Pulso el tubo de centrífuga, coloque el tubo en el imán para 2 minutos retirar el tampón de Unión restantes grano pellets.</li>
</ol>
7. elución de biblioteca a partir de granos de imán
<ol>
	<li>Resuspender las bolas magnéticas en 15 μl de tampón de elución mediante pipeteo. Incubar la muestra durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque el tubo contra el imán para que sedimenten los granos.</li></ol>Cuando la solución limpia, quitar 15 μl de eluato y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y coloque la muestra en hielo.
	<li>Cuantificar la biblioteca utilizando un espectrofotómetro UV. Nota: La recuperación por ciento debe ser ~ 25% (250 ng) de una concentración inicial de 1 μg de ADN genómico.</li>

8. a partir de un gestión/Control de calidad
<ol>
	<li>Retire la célula de flujo de embalaje y coloque la celda de flujo para el secuenciador portátil y en tiempo real (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Instale el secuenciador a un ordenador mediante un cable USB y ejecute el software de secuenciación (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Haga clic en "Conectar" dispositivo a través del software de la secuencia, seleccione "NC_Platform_QC.py" y haga clic en "Inicio".</li>
	<li>El control de calidad (QC) toma aproximadamente 6-7 min para completar; buscar un 'mar verde' (grandes áreas de la producción) en la lectura del control de calidad para confirmar que hay suficientes poros activos (&#62; 800) para la secuenciación de ADN.</li>
</ol>
9. a partir de un funcionamiento de la secuencia
<ol>
	<li>Abrir el programa de secuenciación; aparecerá un cuadro de diálogo. En el cuadro ID de muestra, nombre de la muestra.</li>
	<li>Haga clic en la casilla "ID de celda de flujo" e introduzca el código que se encuentra en la etiqueta en la parte superior de la celda de flujo.</li>
	<li>Abra la tapa de la célula de flujo y luego deslice la tapa del puerto muestra a la derecha (sentido horario) para que el puerto de la muestra es visible. Una vez que el puerto está abierto, verifique para una pequeña burbuja. Quitar unos microlitros de tampón como la burbuja.</li>
	<li>Verifique para asegurarse que no hay almacenador intermediario a través de la matriz del sensor. Hacer el búfer de cebado mezclando 480 μl de funcionamiento amortiguador de combustible (RBF-1, ver la Tabla de materiales) (Asegúrese de mezclar primero) con 520 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Añadir 800 μl de la solución de cebado en el puerto de cebado. Levante la cubierta del "SpotOn" para hacerla accesible.</li>
	<li>Después de 5 min, agregar un adicional 200 μL de tampón de cebado en el puerto de cebado.</li>
</ol>
10. carga de la biblioteca
<ol>
	<li>Antes de preparar el lugar de la biblioteca los siguientes reactivos en el hielo: RBF-1 (desde el kit de secuenciación), adaptado y ató la biblioteca y biblioteca cargando granos (LLB; desde el kit de secuenciación).</li>
	<li>Añadir a un tubo de centrífuga 0.2ml, 25,5 μl de RBF y 12 μl de agua libre de nucleasa mantenerse a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mezclar la LLB transfiriendo hacia arriba y abajo. Añadir μl 26.5 de la LLB al tubo de 0,2 μl. Mezclar los reactivos mediante pipeteo arriba y abajo. Nota: La abogado tiende a instalarse fuera de la mezcla.</li>
	<li>Añadir 11 μl de la biblioteca adaptada y atada al tubo de 0,2 μl. Mezclar por inversión y vuelta por centrifugación de pulso.</li>
	<li>Añadir 75 μl de la muestra del paso 9.4 al puerto "SpotOn" gota a gota. Asegúrese de que cada gota fluye en el puerto antes de añadir el siguiente.</li>
	<li>Cuidadosamente y a colocar la tapa del puerto de muestra para que el mismo entra en el puerto y vuelva a colocar la tapa del dispositivo.</li>
</ol>
11. a partir de una secuencia de comandos de protocolo de Software de secuenciación
<ol>
	<li>Abrir el menú desplegable debajo de "Seleccionar programa" y seleccionar "secuencia de 48 horas."</li>
	<li>Haga clic en el botón "Ejecutar" para iniciar la secuencia de comandos.</li>
	<li>Compruebe los resultados de la exploración Mux registrados en la secuencia de notificación para el número de poros activos en la exploración de MUX. Nota: Este número puede diferir del número de poros en la serie de CC y una gran diferencia puede indicar un problema.<ol>
		<li>Si hay una reducción significativa de los poros activos de la carrera de control de calidad, reiniciar el software y si todavía hay una diferencia significativa, reiniciar el equipo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Compruebe que la temperatura del disipador de calor es de 34 ° C según la secuencia de comandos de software de secuenciación. Nota: Si la temperatura es no a 34 ° C entonces no habrá suficientes poros activos para la carrera.</li>
	<li>Comprobar el histograma de leerlas largos para determinar si las longitudes de la secuencia son esperados y apropiado para el diseño experimental.</li>
	<li>Cierre al agente escritorio mediante 'cerrar x.' dejar el software de secuenciación por el cierre de la web GUI. Desconecte el dispositivo del ordenador.</li>
</ol>
12. Análisis de gestión y resultados
Nota: Durante la ejecución de la secuencia, los datos pueden controlarse utilizando el programa de "Ver informe" mediante el agente de escritorio. Durante o después de la carrera completa, los archivos están disponibles en un formato de archivo en el → de datos Lee → pasar carpeta (por defecto) de FAST5. Si esta carpeta está abierta mientras la secuencia está activa, el equipo podría congelarse.
<ol>
	<li>Para ver y manipular secuencias, descargar un "HDFViewer".</li>
	<li>Para ver los archivos de la secuencia, directamente abre la HDF espectador → abierto datos carpeta → selecciona que todos los archivos tipos → seleccione C: drive (por defecto) → seleccionar datos → seleccionar lecturas → select pass.</li>
	<li>Busque y seleccione el fichero FASTQ en el menú desplegable izquierdo; los archivos se abrirán y pueden guardarse en formato FASTQ. Nota: A los efectos de la experiencia del estudiante, secuencias de 350 nucleótidos o más fueron seleccionadas para su posterior análisis. Salida de la base llamada permite al usuario ordenar Lee secuencia basado en el tamaño. Archivos FASTQ pueden analizarse mediante BLAST (NCBI) u otros programas de Bioinformática.</li>
</ol>

<ol><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li>
<li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-015-0220-9">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99(2015).</li>
<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114(2015).</li>
<li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li>
<li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Method%22%5BJournal%5D)">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li>
<li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li>
<li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li>
<li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405(2013).</li>
<li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v475/n7356/full/nature10242.html?foxtrotcallback=true">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li>
<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li>
<li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li>
<li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metagenomics+of+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen ninguna revelación.

Se han generado muchos métodos de secuencia de la generación siguiente y cada uno depende de secuenciación por síntesis pero las plataformas de detección para la identificación de nucleótidos difieren. NS, la adición más reciente al mercado, utiliza un método diferente, que no requiere una reacción de secuenciación o etiquetado como nucleótidos. Este método aprovecha diferencial de carga de nucleótidos ya incorporados su paso a través de un poro electrified. La identificación de cada nucleótido se produce por la modulación de la corriente eléctrica por las diferentes bases a medida que pasan a través de la nanopore. Este sistema multiplexado permite muchos fragmentos de la secuencia a la vez. Mediante la secuenciación de ambos filamentos de la DNA, se aumenta perceptiblemente la exactitud de la secuencia y el software de secuenciación, que puede ser cargado en un ordenador portátil, procesa las señales y proporciona la información de secuencia que puede ser analizada.
Pirosecuenciación, una secuenciación por el método de síntesis (SBS), detección de la específica base incorporada en la plantilla depende el ensayo de luciferasa y la generación de señal quimioluminiscente8. En secuencia de semiconductor de ion, el ion de hidrógeno liberado, que disminuye el pH es detectado por un sensor de ion9. Secuencia en tiempo real a la sola molécula depende el cero modo onda guía (ZMW)10, que se ilumina para la detección de una molécula fluorescente etiquetada para el nucleótido incorporado. SBS utiliza un método único para amplificar el ADN diana que los racimos de secuencias únicas son generados13. Detección de la nucleótido añadido se realiza cuando se registra la fluorescencia de los nucleótidos etiquetados. NS por otro lado tiene la ventaja sobre otros métodos en que requiere recursos técnicos limitados, es portable, produce la larga secuencia de lecturas, no requiere previa amplificación del ADN y puede ser operado a un costo reducido en comparación con otros métodos. Nuestros alumnos encuentran el protocolo preparación de biblioteca más nuevo, rápido sencillo y favorable a una clase de laboratorio de tres horas. Algunos de los problemas que encontramos eran burbujas en la célula de flujo que fueron difíciles de eliminar, requiere potencia de los ordenadores significativo (un terabyte de almacenamiento de información), es la corriente de salida de datos en un archivo de FAST5 y la célula de flujo de la secuencia tiene una vida útil limitada antes de que se deteriora. Además, otras desventajas del Protocolo de secuenciación NS ligadura (protocolo largo) es que requiere varios pasos de preparación de la biblioteca, requiere conocimientos en técnicas de biología molecular y genera fidelidad de secuencia reducida en comparación con algunos metodologías de la secuencia3. Sin embargo, recientes avances con el nuevo kit de preparación de biblioteca rápida requiere sólo 10 minutos para la preparación de la biblioteca y ha demostrado una tasa de error de secuencia de la reducción. El nuevo método de preparación de biblioteca era muy favorable para el uso en una clase de laboratorio.
Hay varios pasos críticos en el protocolo, especialmente en el control de calidad de la célula de flujo. Esto incluye realizar un control de calidad inicial dentro de los cinco días de la recepción de la célula de flujo y utilizando dentro de 8 semanas. Aunque hemos utilizado células de caudalómetro que estaban más allá de 8 semanas, se reduce el número de poros abiertos, activo. Es importante que los experimentos se planean para una línea de tiempo donde se logra la máxima utilización de las células de flujo. Hemos utilizado el protocolo de limpieza y volver a utilizar las células de flujo con éxito.
Investigando la metagenómica del suelo representa un reservorio genético sin explotar de la diversidad microbiana. Por ejemplo, un gramo de suelo se estima contienen entre 107 - 109 células procariotas14. Por otra parte, organismos del suelo son una fuente principal de nuevos productos naturales, enzimas y antibióticos. Así, análisis de la secuencia del DNA de suelo metagenómica representa una valiosa herramienta educacional para los estudiantes en cada nivel de enseñanza. La tecnología de NS facilidad de uso y bajo costo hacer este sistema una herramienta de enseñanza muy eficaz. Los estudiantes pueden secuencia de muestras ambientales y al terminar la secuencia utilice herramientas bioinformáticas disponibles para identificar y caracterizar secuencias de microbios y metagenómica en muestras de prueba. Usando la tecnología de NS, los estudiantes tienen experiencia práctica, que se hasta ahora de alcanzar para el uso en los cursos de laboratorio debido a los avanzados conocimientos técnicos y altos costos de reactivos, equipos y mantenimiento en otras plataformas de secuenciación. Uno de nuestros estudiantes (J. Harrison, comunicación personal) había divulgado recientemente, el uso de esta tecnología en un proyecto de monitoreo ambiental de suelos agrícolas. Esperamos que habrá muchas más aplicaciones de esta tecnología en el espacio de la educación.

El objetivo de este procedimiento es demostrar los pasos necesarios para la preparación de una biblioteca ambiental de la DNA para la secuenciación, la utilización de un dispositivo de secuencia nanopore flujo celular y realizar análisis de las secuencias de ADN generadas con software de sistema y el centro nacional para las herramientas de Bioinformática de información biotecnológica (NCBI) identificar especies microbianas en el suelo. Actualmente, la mayoría plataformas de secuenciación de ADN requieren una inversión importante en capacitación técnica y de instrumentación compleja, que no es factible en entornos pobres de recursos o en aplicaciones de campo. La plataforma de secuenciación (NS) nanopore elimina estos problemas con un costo efectivo, sencillo de usar protocolo de preparación de biblioteca y un dispositivo portátil secuenciar y analizar una variedad de diferentes tipos de ácidos nucleicos1,3. Hemos incorporado la plataforma NS en varias clases de laboratorio para estudiantes de maestría.
Nanopore tecnología de biomoléculas de secuenciación ha demostrado amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos bacterianos y virales1,2,6, biodiversidad ambiental estudios, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genómico3,5y caracterización de la resistencia bacteriana a los antibióticos4. NS es un método rápido y preciso a los ácidos nucleicos secuencia que se basa en el principio de la "secuencia del filamento" mediante la detección de perturbaciones eléctricas por las bases de nucleótidos individuales cuando la sola DNA trenzada atraviesa un nanopore insertado en un electrificado membrana de polímero sintético. Los pasos involucrados en la preparación de ADN para NS incluyen fragmentación del genoma y reparación final 3' dA-tailing de fragmentos genómicos, adaptador y correa recocido al ADN, purificación de DNA a biblioteca y cargar la biblioteca en el dispositivo de la célula de flujo nanopore. Fragmentación del genoma en tamaños de 8 kb es logrado por centrifugación a 1-2 μg de ADN genómico a través de un tubo de g de fragmentación. Los extremos genómicos fragmentados luego reparados y cola con dA poli usando un kit disponible comercialmente. Las secuencias solo adaptador trenzado, que son compatibles con la proteína motora nanopore, se agregan a los extremos de ADN que se utilizan para guiar la secuencia de ADN a través de nanopore (figura 1). Las secuencias de anclaje son necesarias para la purificación de ADN y para la localización de las moléculas de ADN a la membrana de poro. La horquilla se genera por la ligadura de un adaptador de horquilla a un extremo de la biblioteca de cola dA. Las estructuras de la horquilla en los extremos de ADN permite la lectura de las hebras sentido y antisentido del ADN paso por nanopore (figura 2). La biblioteca genomic preparada se purifica después de la reacción usando granos de estreptavidina utilizando un campo magnético, seguido por la carga de la muestra en la celda de flujo nanopore para análisis.
El ADN secuenciado se evalúa por la calidad y Lee de la secuencia que es aceptable para el análisis es luego sometido a varias herramientas de bioinformática para identificar microbios. Las secuencias se "traducen" FASTQ de un formato de FAST5. En el formato FASTQ, las secuencias pueden utilizarse luego en el análisis BLAST.

<table><tbody><tr><td>Termociclador</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris G-TUBE</td><td>Covaris</td><td>520079</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Módulo de reparación final</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Tubos de centrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix New</td><td>England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1 Perlas de Strepavidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Modelo 5420</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Modelo 2000</td></tr><tr><td>Bailarina del vientre Agitador orbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z768499</td><td></td></tr><tr><td>Power Kit de aislamiento de ADN del suelo</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>Ligadura Kit de secuenciación 2D</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>Kit de secuenciación rápida para ADN genómico</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de reacción de preparación final y mezcla de enzimas (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Magnetic Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Basic Starter Pack&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td></td><td>Incluye MinION&nbsp; Dispositivo de secuenciación y celda de flujo</td></tr><tr><td>Software MinKNOW</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de secuenciación rápida para ADN genómico</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>Incluye búfer de funcionamiento con combustible (RBF), mezcla de fragmentación (FRM), adaptador rápido (RAD), cuentas de lodaing de biblioteca (LLB)</td></tr></tbody></table>

secuencia de la dna nanopore para análisis de metagenómica suelo

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Este artículo describe los pasos para la construcción de una biblioteca de ADN de suelo, preparación y uso de la célula de flujo nanopore y análisis de las secuencias de ADN identificados usando software de computadora. Secuencia de la DNA Nanopore es una técnica flexible que permite la secuenciación del genoma microbiano rápido identificar especies bacterianas y virales, para caracterizar las cepas bacterianas y para detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los antibióticos. Las ventajas de nanopore sequencing (NS) para Ciencias de la vida son su baja complejidad, coste reducido y rápida secuencia en tiempo real del ADN genómico purificado, amplicones PCR, las muestras de cDNA o RNA. NS es un ejemplo de "secuencia de filamento", que consiste en la secuencia DNA guiando una sola molécula de DNA trenzada a través de un nanopore que se inserta en la membrana de un polímero sintético. La membrana tiene una corriente eléctrica aplicada a través de él, por lo que las bases individuales paso a través de la nanopore la corriente eléctrica se interrumpe en diversos grados por las cuatro bases de nucleótidos. La identificación de cada nucleótido se presenta detectando la modulación característica de la corriente eléctrica por las diferentes bases que pasan por el nanopore. El sistema NS consiste en un dispositivo portátil, dispositivo portátil y una celda de flujo desechable que contiene una matriz nanopore alimentado por USB. El dispositivo portátil se conecta a una computadora portátil estándar que lee y graba la secuencia del ADN utilizando el software de computadora.

La tecnología de diseño y nanopore experimental proporciona un método rápido y barato para que los estudiantes la secuencia de ADN de suelo. El funcionamiento representativo pasa los parámetros de control de calidad con más de 800 poros disponibles para la secuencia. La carrera resultó en más 125.000 lecturas disponibles para el estudio con una longitud de la secuencia media de 5,38 kb. Secuencias se dan una puntuación de calidad y luego se analizaron solamente las secuencias con resultados aceptables. Como la salida de la secuencia de la reacción es en FAST5 formato, que no es aceptado por programas tales como BLAST (NCBI), las secuencias fueron vistas en el visor de HDF que convierte las secuencias en formato FASTQ, que es compatible para el análisis de la explosión. En el futuro iteraciones del software, los datos estarán disponibles en formato FASTQ, eliminando la necesidad para el espectador HDF. Ver complementarias figuras 1, 2 y 3.
50 secuencias de más de 350 nucleótidos de longitud fueron sometidos a análisis de BLASTN (nucleótidos base de datos de nucleótidos) o BLASTX (nucleótidos traducidos en secuencia del aminoácido) (NCBI) para identificar organismos en la muestra de suelo. Dado el tiempo de las limitaciones de la clase y que el enfoque del curso es en métodos de laboratorio y no de bioinformática, tenemos a los estudiantes analizar secuencias dentro de estos parámetros. Nuestras clases de Bioinformática pueden utilizar los datos para el desarrollo de herramientas de análisis de tubería. Este nivel de análisis bioinformáticos no está cubierto en la clase de laboratorio en. Tabla 1 es una lista de los organismos que fueron identificados con los valores de e del e-04 menos de 4. En general, e-valores inferiores a 4 e-04 indican fuerte semejanza entre la secuencia de entrada (consulta) y la secuencia coincidente. Los organismos identificados por BLASTN (contra la base de datos no redundante (nr)) son de una gran variedad de especies y están disponibles para más genómica y análisis de proteínas. Esta muestra de suelo, que vino de un jardín en el Condado de Baltimore, MD nunca había sido probada, por lo que no había ningún dato anterior de que determinar cuáles podrían ser los organismos en el suelo. BLASTN (contra la base de datos de nr) el análisis también indica que hubo secuencias con ninguna similitud en la base de datos de nr. Para determinar si estas secuencias verdaderamente novedosas, es necesario un estudio más profundo. Análisis de varias secuencias por BLASTX reveló varias proteínas de organismos no representados en el análisis BLASTN. La tabla 2 enumera varias proteínas posible incluyendo endopeptidasas y ATPasas como proteínas. Usando esta biblioteca de secuencias, los estudiantes tienen la oportunidad de utilizar herramientas bioinformáticas más sofisticadas para realizar análisis adicional, si dirigida por el instructor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparación de la biblioteca genómica. Pasos para la preparación de la biblioteca genómica de ADN para secuenciación nanopore tecnología. Esta cifra ha sido modificada con los permisos necesarios. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
Figura 2 . Esquema de secuencia de la DNA usando un nanopore. ADN pasa a través de una membrana nanopore con identificación base y generación de señal eléctrica. Esta cifra ha sido modificada con los permisos necesarios. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organismo</td>
			<td>valor de e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrativorens Hyphomicrobium</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya novella</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denitrificans Hyphomicrobium</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0.00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradyrhizobium sp.</td>
			<td>3.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: resultados de análisis BLASTN selectos. Secuencias de la DNA de la metagenómica de suelo sujetada a búsqueda de semejanza BLASTN contra la base de datos de nucleótidos redundante NCBI. Los datos registrados tienen valores e de 4 x e-4 o menos.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Proteína</td>
			<td>Organismo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteína hipotética</td>
			<td>Acidobacter bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM metiltransferasa dependiente</td>
			<td>Denitrificans H.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPasa</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidasa</td>
			<td>Shigella sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteína de lisis</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: resultados de análisis BLASTX selectos. Secuencias de la DNA de la metagenómica de suelo sujetada a búsqueda de semejanza BLASTX contra la base de datos de proteínas no redundantes de NCBI.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
Suplementario Figura 1: resultados de la plataforma de control de calidad. Se presentan los resultados de la plataforma de control de calidad. En la esquina superior derecha están los resultados del control de calidad para los poros activos. Cada cuadrante de la célula de flujo se prueba para los poros activos. La Página principal es dinámica y cambia a medida que se prueba cada cuadrante. En este plazo, se detectaron poros solo 1.414.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
Suplementario Figura 2: FAST5 convertir archivos a archivos FASTQ. Aquí a la derecha, está la salida de los datos de la ejecución de la secuencia. Cada línea representa una secuencia individual. El lado izquierdo de la figura muestra la secuencia destacada de la derecha, en el visor de HDF que convierte la secuencia en un archivo FASTQ que puede utilizarse para su posterior análisis. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
Suplementario Figura 3: secuencia de ejemplo de FASTQ en visor de HDF. Esta secuencia (leído 803) está en un fichero FASTQ que convierte los datos de FAST5 en nucleótidos. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Nanopore technology para secuenciación de biomoléculas tiene amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genomic, metagenomic monitoreo ambiental y caracterización de bacterias resistencia a los antibióticos. En este artículo, el procedimiento de secuenciación de ADN de suelo de metagenómica para identificación de especies utilizando la tecnología de secuenciación nanopore es demostrado.

Secuencia de la DNA Nanopore para análisis de metagenómica suelo

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

El objetivo general de este video es demostrar cómo secuenciar el ADN metagenómico del suelo utilizando una metodología de secuenciación de nanoporos. Este método puede ayudar a los educadores a introducir la secuenciación de ADN en un entorno de aula y proporcionar la generación en tiempo real de nuevos datos de secuenciación de ADN para su análisis. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, asequible y requiere un equipo de laboratorio mínimo.Esta técnica también brinda a los estudiantes la oportunidad de utilizar herramientas bioinformáticas más sofisticadas que generalmente están disponibles en las clases de laboratorio. Este breve protocolo funciona con un kit de secuenciación rápida. Para empezar, añade 200 nanogramos de ADN de alto peso molecular en un tubo de pared delgada de 0,2 mililitros y completa el volumen con agua destilada hasta 7,5 microlitros.A continuación, agregue 2,5 microlitros de mezcla de fragmentación del kit y mezcle el tubo suavemente usando inversiones. Luego use un pulso de centrifugación para girar el contenido de los tubos. Ahora transfiera el tubo a un termociclador para un ciclo de un minuto a 30 grados Celsius, seguido de un segundo ciclo de un minuto a 75 grados Celsius.A continuación, vuelve a girar el tubo. Para completar la biblioteca adaptada y anclada, agregue un microlitro de adaptador rápido y 0,2 microlitros de mezcla maestra de ligasa roma/TA. Luego use la inversión para mezclar el tubo, seguido de otro giro de pulso y almacene el tubo en hielo.Primero, configure el secuenciador, retire la celda de flujo de su empaque y conéctela al secuenciador portátil en tiempo real. A continuación, conecte el secuenciador a un ordenador mediante el cable USB e inicie el software de secuenciación. En el software, seleccione el comando de inicio del dispositivo y elija la opción de plataforma de control de calidad.A continuación, pulse ejecutar para ejecutar el control de calidad. Después de unos siete minutos, se completará la ejecución del control de calidad. El resaltado verde en la lectura indica que hay poros activos disponibles para la secuenciación del ADN.Se requieren al menos 800 poros activos. Ahora ve al cuadro de diálogo. En el campo Id. de muestra, escriba el nombre de la muestra que se va a secuenciar.Para el ID de la celda de flujo, ingrese el código que se encuentra en la etiqueta adjunta a la parte superior de la celda de flujo. Ahora abra la tapa del secuenciador y luego deslice la tapa del puerto de cebado hacia la izquierda para acceder al puerto. Ahora retire unos microlitros de tampón, incluida una pequeña burbuja que suele estar presente.Ahora haga suficiente búfer para llenar el conjunto de sensores. Prepare un mililitro de tampón de cebado recién hecho bien mezclado. Luego agregue 800 microlitros de tampón de cebado y espere cinco minutos.Después de cinco minutos, agregue los 200 microlitros restantes de tampón de cebado. Para preparar la biblioteca para cargar, enfríe RBF1 y LLB en hielo junto con la biblioteca adaptada y anclada. A continuación, añada al nuevo tubo de centrífuga de 0,2 mililitros 25,5 microlitros de RBF1 y 12 microlitros de agua sin núcleo a temperatura ambiente.A continuación, mezcle el LLB con la trituración con pipeta, luego tome una alícuota de 26,5 microlitros y agréguela al tubo con RBF1 diluido. Mezcle los reactivos usando más trituración para evitar que las perlas se asienten. Ahora agregue 11 microlitros de la biblioteca adaptada y atada y mezcle el tubo suavemente usando la inversión.A continuación, utilice un centrifugado de pulso para agrupar la muestra. Mientras evita las cuentas, tome 75 microlitros de la muestra y agréguela al lugar en el puerto gota a gota. Asegúrese de que cada gota fluya hacia el puerto antes de agregar la siguiente.Al cargar la muestra, es vital que cada gota ingrese al puerto antes de que se agregue la siguiente. También es importante evitar volver a suspender las cuentas al cargar el puerto de muestra, lo que puede obstruir el puerto. Ahora vuelva a colocar la tapa del puerto de muestra asegurándose de que el tapón ingrese al puerto.A continuación, vuelva a colocar la tapa del dispositivo y proceda a ejecutar la opción de ejecución de secuenciación de 48 horas seleccionada a través del software. El uso del procedimiento descrito proporciona un método rápido y económico para secuenciar el ADN del suelo con fines educativos. Por lo general, las ejecuciones producían más de 125.000 lecturas, con un promedio de más de 5.000 pares de bases.A cada ejecución se le asignó una puntuación de calidad para seleccionar las más útiles para su posterior análisis. A continuación, cada estudiante sometió 50 secuencias de al menos 350 nucleótidos a análisis BLASTN o BLASTX para identificar el organismo a partir de la muestra. Los organismos identificados con valores de e inferiores a 0,0004 se consideran coincidencias fuertes.Muchas secuencias sometidas a BLASTN no tenían comparación y se relacionaban con organismos nuevos. BLASTX reveló varias proteínas de organismos no representados en el análisis de BLASTN. De interés: Se identificaron las proteínas similares a la endopeptidasa y a la ATPasa.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar y analizar el ADN del suelo para la secuenciación utilizando la tecnología de secuenciación de nanoporos. Este protocolo se puede completar en dos horas y media, requiere un equipo de laboratorio mínimo o experiencia técnica y se puede completar en un salón de clases. Al intentar y completar este procedimiento, es importante recordar canalizar los reactivos con cuidado, mezclar las muestras a fondo y centrifugar las muestras entre pasos para evitar perder la muestra.

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Investigación

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