Name: Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprende a generar gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre de cordón umbilical. Este protocolo permite la producción a gran escala para modelado de enfermedades y cribado de fármacos en investigación de cartílago.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del proyecto de I + D de Tecnología Sanitaria de Corea, Ministerio de Salud, Bienestar y Asuntos Familiares, República de Corea (HI16C2177).

Este protocolo fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC12TISI0861). CBMCs utilizados para la reprogramación se obtuvieron directamente del Banco de Sangre de Cordón del Hospital St. Mary de Seúl. 1. Diferenciación condrogénica de iPSCs <ol><li> Generación CBMC-iPSC <ol><li> Generar CBMC-hiPSCs utilizando el protocolo mostrado en nuestro trabajo anterior 23 . </li><li> Recoja las células de la sangre en un tubo cónico de 15 ml y cuente con un hemocitómetro. </li><li> Preparar 3 x 105 células y centrifugarlas durante 5 min a 515 xg y RT. Desechar el sobrenadante por succión y resuspender las células en 0,5 ml de medio de células sanguíneas. </li><li> Transferir las células a un pocillo de una placa de 24 pocillos sin recubrimiento y añadir la mezcla de virus Sendai, siguiendo las recomendaciones del fabricante. </li><li> Centrifugar la placa durante 30 minutos a 1.150 xg y 30 ° C. </li><li> En popaEr de centrifugación, incubar las células durante la noche (O / N) a 37 ° C en 5% de CO 2 . </li><li> Al día siguiente, transfiera las células transducidas a un pocillo revestido con matriz. Centrifugar la placa a 1.150 xg durante 30 minutos a 30 ° C. </li><li> Después de la centrifugación, se retira el sobrenadante, se añade 1 ml de medio iPSC y se mantienen las células O / N a 37ºC en CO _ { 2 } al 5%. </li><li> Mantener las células unidas a 37 ° C y 5% de CO 2 . Cambie el medio diariamente, reemplazándolo con el medio fresco iPSC. NOTA: Las colonias aparecerán en el día 14-21 después de la transducción. </li></ol></li><li> EB generación <ol><li> Mantener los hiPSCs a 37 ° C y 5% de CO 2 . Cambie el medio diariamente, reemplazándolo con el medio Essential 8 (E8) fresco. </li><li> Preparar 2 x 10 6 hiPSCs en un plato revestido con vitronectina de 100 mm en medio E8. </li><li> Se retira el medio E8 del plato de cultivo y se lava con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). </li><li> Añadir 1Ml de ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA) e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2 min. </li><li> Cosecha de las células con 3 ml de medio E8 y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 250 xg a temperatura ambiente (RT) durante 2 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y resuspender las células en 5 ml de medio E8. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro y preparar 2 x 10 6 células para cada 100 mm placa de Petri. Resuspender las células preparadas en una mezcla de 10 ml de medio E8 y EB (1: 1) con 10 μM de inhibidor de la quinasa rho-asociada (ROCK). </li><li> Incubar las células O / N para la agregación a 37 ° C y 5% de CO 2 . </li><li> Al día siguiente, cosechar los EBs agregados por pipeteo. Centrifugar las células a 250 xg durante 1 min. Se retira el sobrenadante y se resuspende el EB en 10 ml de medio E8 fresco. </li><li> Ampliar los EBs generados durante 5 días, realizando cambios diarios con fresH E8 medio. Para maduración adicional, cambiar el medio de cultivo al medio E7. Mantener los EB a 37 ° C y 5% de CO2 durante otros 5 días, realizando cambios medios diarios con medio E7 fresco. NOTA: El medio E7 es medio E8 sin FGF2. </li></ol></li><li> Inducción de células extraídas de EBs <ol><li> Añadir 6 ml de gelatina al 1% a un plato de 100 mm e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 30 min. </li><li> Retire la gelatina y seque completamente el plato durante 2-3 horas antes de usarlo. </li><li> Transfiera los EB a un tubo cónico de 50 ml. Deje que los EBs se asienten en el fondo del tubo cónico. Eliminar el sobrenadante sin alterar el EB. </li><li> Resuspender los EBs en 10 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 20% (FBS). Transfiera los EBs al plato recubierto de gelatina de 100 mm. Añadir 10 μ M ROCK inhibidor. </li><li> Incubar y mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 7 días. Cambiar de temaDium cada dos días sin añadir inhibidor de ROCK. </li></ol></li><li> Formación de gránulos condrogénicos <ol><li> Aspirar el medio de cultivo del plato y lavar las células tres veces con PBS. </li><li> Aplicar 1 mL de EDTA 1 mM e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2 min. </li><li> Cosecha de las células utilizando 5 mL de DMEM con 20% FBS y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 15 mL. </li><li> Centrifugar las células durante 2 min a 250 xg y RT. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 10 ml de DMEM con FBS al 20%. </li><li> Filtrar y descartar los grupos de células utilizando un tamiz de células de 40 μm y cosechar las células individuales. Contar las células individuales con un hemocitómetro. </li><li> Centrifugar las células durante 2 min a 250 xg y RT. Eliminar el sobrenadante y sembrar 3 x 10 5 células por gránulo en un tubo cónico de 15 mL con 300 μl de medio de diferenciación condrogénica (CDM). </li><li> Para la formación de gránulos, centrifugar las células durante 5 min a680 xg y RT. NOTA: Los gránulos se mantienen en tubos cónicos de 15 mL durante la diferenciación de los gránulos condrogénicos. </li><li> Incubar las células durante la noche a 37 ° C y 5% de CO 2 . </li><li> Cambie el MDL cada 2-3 días. Dentro de 3 días, los gránulos mostrarán morfologías esferoidales aplanadas. Mantener los gránulos durante 21 días a 37 ° C y 5% de CO 2 . </li></ol></li></ol> 2. Caracterización de los gránulos condrogénicos por tinción <ol><li> Incorporación condrogénica <ol><li> Antes de empotrar, preparar y fundir la parafina a 58 ° C. </li><li> Fijar los pellets en 1 mL de paraformaldehído al 4% durante 2 h a RT en un tubo de 1,5 mL. Precaución: Paraformaldehído es altamente tóxico. Evite el contacto con los ojos, la piel o las membranas mucosas. Minimizar la exposición y evitar la inhalación mientras se prepara. </li><li> Coloque una capa de gasa sobre el cassette y transfiera los gránulos fijos usando una pipeta. Cubrir el pellet doblando thColoque la gasa y cierre la tapa del cassette. </li><li> Inicie la deshidratación en 100 ml de etanol al 70% (EtOH) dos veces, 10 min cada uno. Deshidratar los gránulos a través de lavados secuenciales de 10 minutos en EtOH al 80% y al 95%. </li><li> Transferir los gránulos a EtOH al 100% durante 10 min. Repetir tres veces con EtOH fresco. </li><li> Para &quot;limpiar&quot;, se cambia la solución por una mezcla 100: 1 de EtOH y xileno 1: 1, seguido de una mezcla 1: 2 de EtOH y xileno durante 10 min cada uno. Borrar el EtOH restante incubando los gránulos dos veces en 100% xileno, 10 min cada uno. </li><li> Para la infiltración de parafina, incubar los pellets en xileno secuencial y mezclas de parafina. Realizar todo el proceso de infiltración de parafina a 58 ° C. Incubar los pellets en 100 ml de una mezcla 2: 1 de xileno y parafina durante 30 min. </li><li> Se cambia la solución por 100 ml de una mezcla 1: 1 de xileno y parafina e incuba durante 30 min. </li><li> Se cambia la solución por 100 ml de una mezcla 1: 2 de xileno y parafina y se incuba durante 30 min. </li><li> Para la infiltración final, transferir los gránulos al primer baño de parafina al 100% e incubar durante 2 h. </li><li> Transferir los gránulos al segundo baño de parafina al 100% e incubar O / N a 58 ° C. </li><li> Al día siguiente, suavemente transferir los gránulos a un molde con una pinza. Agregue parafina al molde del dispensador de parafina. Solidificar la parafina durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Corte las secciones a 7 μm y transfiera las secciones sobre la diapositiva. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche y guarde los portaobjetos a RT hasta que estén listos para su uso. </li></ol></li><li> Preparación de la diapositiva <ol><li> Desparafinar los portaobjetos moviéndolos a través de 100 ml de EtOH al 100%, 90%, 80% y 70% secuencialmente durante 5 min cada uno. </li><li> Coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 5 min. </li></ol></li><li> Tinción azul Alcian <ol><li> Incubar los portaobjetos en 50 ml de solución de azul alciano al 1% durante 30 min. NOE: El azul de Alcian se diluye en una solución de ácido acético al 3%. Ajustar el pH a 2,5 utilizando ácido acético. </li><li> Coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 2 min. </li><li> Enjuague los portaobjetos en agua desionizada (DW) y contraste con una solución nuclear de color rojo rápido durante 2 min. </li><li> Coloque las diapositivas en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 1 minuto. </li><li> 2.3.5) Proceda a deshidratar y montar los portaobjetos en el paso 2.6. </li></ol></li><li> Tinción con azul de toluidina <ol><li> Incubar los portaobjetos en 50 ml de solución de azul de toluidina durante 4 min. </li><li> Coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 5 min. </li><li> Proceda a deshidratar y montar los portaobjetos en el paso 2.6. </li></ol></li><li> Tinción inmunohistoquímica <ol><li> Incubar las diapositivas en H 2 O 2 al 3% durante 15 min para bloquear la peroxidasa endógena. </li><li> Aplicar 200 μl de anticuerpo primario (anti-COL1A1 y -COL2A1) diluido 1: 100 en tris-bu(TBS) conteniendo 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 5% de suero normal de cabra (NGS) a los portaobjetos e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y lávelos con 50 mL de TBS conteniendo 0,1% de polisorbato 20 (TBST) tres veces durante 5 min cada uno. </li><li> Aplicar 200 μl de anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo, diluido 1: 200 en TBS que contiene BSA al 1% y NGS al 5%) a las placas e incubar a RT durante 40 min. </li><li> Colocar los portaobjetos en un frasco de vidrio y lavarlos tres veces con 50 mL, 5 min cada uno. </li><li> Para la amplificación de la señal, aplique la solución de estreptavidina conjugada con HRP a los portaobjetos e incube durante 10 min. </li><li> Colocar los portaobjetos en un frasco de vidrio y lavarlos tres veces con 50 mL, 5 min cada uno. </li><li> Mezclar la solución de sustrato DAB-peroxidasa, aplicar 200 μL de solución a cada diapositiva e incubar durante 1 min. </li><li> Coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 5 min. </li><li> ContracolorCon hematoxilina de Mayer durante 1 min. </li><li> Lave las diapositivas con DW. </li><li> Proceda a deshidratar y montar los portaobjetos en el paso 2.6. </li></ol></li><li> Deshidratación y montaje <ol><li> Deshidrate los portaobjetos moviéndolos secuencialmente a través de 100 mL de EtOH al 70%, 80%, 90% y 100%, cada 30 segundos. </li><li> Sumerja los portaobjetos en dos cambios de xileno durante 1 minuto cada uno. </li><li> Agregue 50 μl de solución de montaje a los cubreobjetos y coloque los portaobjetos en la parte superior. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo generó con éxito HiPSCs de CBMCs. Se reprogramaron CBMCs a hiPSCs utilizando un vector viral Sendai que contiene Yamanaka factores [ 24] . Tres casos se utilizaron en la diferenciación, y todos los experimentos generados con éxito chondrogenic pellets utilizando este protocolo. Numerosos estudios han informado de protocolos para la diferenciación de hiPSCs en condrocitos 25 , 26 , 27 ...

El uso de hiPSCs representa una nueva estrategia para la detección de drogas y estudios mecánicos de diversas enfermedades. Desde una perspectiva regenerativa, hiPSCs son también una fuente potencial para la sustitución de los tejidos dañados que tienen capacidad de curación limitada, como el cartílago articular 1 , 2 . La regeneración del cartílago articular nativo ha sido un reto durante varias décadas. El cartílago articular es un tejido suave y blanco que recubre el extremo de los huesos, protegiéndolos de la fricción. Sin embargo, tiene una capacidad regenerativa limitada cuando está dañada, lo que hace que la auto-reparación sea casi imposible. Por lo tanto, la investigación centrada en la regeneración del cartílago ha estado en curso durante varias décadas. Anteriormente, la diferenciación in vitro en el linaje condrogénico se realizó generalmente con BMSCs o condrocitos nativos aislados de la articulación de la rodilla [ 3] . Debido tO su potencial condrogénico, las BMSC y los condrocitos nativos tienen numerosos méritos que apoyan su uso en la condrogénesis. Sin embargo, debido a su limitada expansión y fenotipo inestable, estas células enfrentan varias limitaciones en la reconstrucción de los defectos del cartílago articular. Bajo condiciones de cultivo in vitro , estas células tienden a perder sus propias características después de 3-4 pases, lo que finalmente afecta a sus capacidades de diferenciación [ 4] . Además, en el caso de condrocitos nativos, un daño adicional a la articulación de la rodilla es inevitable cuando se obtienen estas células. A diferencia de BMSCs o condrocitos nativos, hiPSCs puede expandirse indefinidamente in vitro . Con las condiciones de cultivo adecuadas, los hiPSC tienen un gran potencial como fuente de reemplazo para la diferenciación condrogénica. Sin embargo, es un desafío para cambiar las características intrínsecas de hiPSCs [ 5] . Por otra parte, se necesitan varias complicaciones in vitroPs para dirigir el destino de hiPSCs a un tipo de célula específico. A pesar de estas complicaciones, el uso de los hiPSCs sigue siendo recomendable debido a su alta capacidad de auto-renovación y su capacidad para diferenciarse en las células objetivo, incluidos los condrocitos [ 6] . La diferenciación condrogénica se realiza habitualmente con sistemas de cultivo tridimensionales, tales como el cultivo de pellets o el cultivo de micromasas, utilizando células progenitoras similares a MSC. Si se usan hiPSCs, el protocolo para generar células progenitoras tipo MSC difiere de los protocolos existentes. Algunos grupos utilizan cultura monocapa de hiPSCs para convertir directamente el fenotipo en MSC-como las células [ 7] . Sin embargo, la mayoría de los estudios utilizan EBs para generar células de crecimiento que se asemejan a MSCs 8 , 9 , 10 , 11 . Se utilizan diversos tipos de factores de crecimiento para inducir el condrogeNesis Normalmente, las proteínas de la familia BMP y TGFβ se usan, solas o en combinación. La diferenciación también se ha inducido con otros factores, tales como GDF5, FGF2, y IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . Se ha demostrado que TGFβ1 estimula la condrogénesis de una manera dependiente de la dosis en MSCs 16 . Comparado con el otro isotipo, TGFβ3, TGFβ1 induce condrogenesis mediante el aumento de la condensación de células mesenquimales pre-cartilage.TGFβ3 induce condrogenesis mediante el aumento significativo de la proliferación de células mesenquimales [ 17] . Sin embargo, TGFβ3 es utilizado con mayor frecuencia por los investigadores que TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 mejora la expresión de genes relacionados con los componentes de la matriz condrogénica en humanosCondrocitos articulares bajo condiciones in vitro 20 . BMP2 aumenta la expresión de genes críticos para la formación de cartílago en MSCs en combinación con TGF β proteínas [ 21] . También se ha demostrado que BMP2 sinérgicamente mejora el efecto de TGF β3 a través de las vías Smad y MAPK [ 22] . En este estudio, CBMC-hiPSCs se agregaron en EBs utilizando medio EB en una placa de Petri de baja fijación. Las células de crecimiento se indujeron uniendo los EB a un plato recubierto de gelatina. La diferenciación condrogénica utilizando células de crecimiento se realizó por cultivo de pellets. El tratamiento con BMP2 y TGFβ3 condensó con éxito las células y indujo la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (ECM) para la formación de gránulos condrogénicos. Este estudio sugiere un sencillo pero eficiente clondrogenic diferenciación protocolo utilizando CBMC-hiPSCs.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Artículos de plástico</resistente></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Plato</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo Córnico</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo Córnico</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta Desechable</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta desechable</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Descripción</strong</td></tr><tr><td>>E8 Materiales medianos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 Medio (500 mL)</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 Medio (Conc.: 543 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Selenito de Sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Medio&nbsp; (Conc.: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Transfferina humana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 Medio (Conc.: 10.7 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Básico FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 Medio&nbsp; (Conc.: 100 ng/mL)</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Humana Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Medio (Conc.: 20 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>TGF humano y beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Medio (Conc.: 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 Medio&nbsp; (Conc.: 64 y mu; g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibidor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Descripción</td></tr><tr><td><fuerte> control de calidad Materiales </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Cubierta de vidrio</td><td>superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovación</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-TRA-1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-TRA-1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón anti-anti-ratón IgG (H+L)</td><td>sonda molecular</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Sonda molecular</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Sonda molecular DAPI</td><td></td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración de oro</td><td>prolongado Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovación</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Colágeno II</td><td>anticuerpo abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Azul Alcián</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>Verde Rápido FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>Rojo rápido nuclear</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>xileno</td><td>Duksan</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina de Mayer</td><td>Industrias químicas puras</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio, recubierto</td><td>Hyun il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore 109634</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Primera hebra Kit de síntesis de ADNc</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td> Descripción</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Materiales de diferenciación condrogénica</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Componente de medios condrogénicos (500 mL)</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>Componente de medios condrogénicos (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Componente condrogénico del medio (Conc.: 64 &mu; g/mL)&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Componente de medios condrogénicos (Conc.: 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D</td><td>355-BM-050</td><td>Componente de medio condrogénico (Conc.: 100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Hman recombinante TGF-beta3</td><td>R& D</td><td>243-B3-002</td><td>Componente de medios condrogénicos (Conc.: 10 ng/ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028 Componente de</td><td>medios condrógenos (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>Componente de medios condrogénicos (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Dexametasona-Soluble en agua&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>Componente de medios condrogénicos (Conc.: 10-7 M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Componente de medios condrogénicos (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Solución de piruvato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>Componente de medios condrogénicos (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma Aldrich P5607-25G</td><td></td><td>Medios condrogénicos componente (40 &mu; g/ml)</td></tr></tbody></table>

formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

El cartílago articular humano carece de la capacidad de repararse. Por lo tanto, la degeneración del cartílago no se trata por tratamientos curativos sino por tratamientos conservadores. Actualmente, se están haciendo esfuerzos para regenerar el cartílago dañado con condrocitos expandidos ex vivo o células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BMSCs). Sin embargo, la viabilidad limitada y la inestabilidad de estas células limitan su aplicación en la reconstrucción del cartílago. Las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSCs) han recibido atención científica como una nueva alternativa para aplicaciones regenerativas. Con ilimitada capacidad de auto-renovación y multipotencia, HiPSCs se han destacado como una nueva fuente de células de reemplazo para la reparación del cartílago. Sin embargo, la obtención de una gran cantidad de gránulos condrogénicos de alta calidad es un reto importante para su aplicación clínica. En este estudio, se utilizó el cuerpo embrioide (EB) derivado de las células de crecimiento para la diferenciación condrogénica. La condrogénesis exitosa fue confirmada por PCR yD con azul alciano, azul de toluidina y anticuerpos contra los tipos de colágeno I y II (COL1A1 y COL2A1, respectivamente). Proporcionamos un método detallado para la diferenciación de células madre mononucleares derivadas de células madre ipSCs (CBMC-hiPSCs) en chondrogenic pellets.

En este estudio, hemos generado gránulos condrogénicos de CBMC-hiPSCs por inducir las células de extracción de EBs. La diferenciación condrogénica se indujo utilizando CBMC-HiPSCs con confirmada alta pluripotencia [ 11] . Un esquema simple de nuestro protocolo se muestra en la Figura 1A . Antes de la diferenciación, las colonias de iPSC se expandieron ( Figura 1B ). Los iPSCs ampliado se ensamblaron como ...

Aquí, proponemos un protocolo para la diferenciación condrogénica de células madre pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células mononucleares de sangre del cordón umbilical.

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

El objetivo general de este procedimiento es generar agregados condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre de cordón. Con este protocolo, podemos generar una cantidad relativamente grande de agregados condrogénicos. Los agregados condrogénicos obtenidos pueden utilizarse en estudios o modelos de enfermedades, cribado de fármacos e investigación traslacional para profundizar en el entendimiento de la naturaleza del cartílago.El cartílago humano tiene una capacidad limitada para repararse por sí solo. Por lo tanto, la degeneración del cartílago debe tratarse mediante terapias conservadoras. Debido a su capacidad ilimitada de autorrenovación y su pluripotencia, las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) han sido destacadas como una nueva fuente de células de reemplazo para la reparación del cartílago.El procedimiento será demostrado por Eugene Nam y Arie Alice Ream, quienes son estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar el protocolo, recolecte las células sanguíneas en un tubo cónico de 15 mililitros y cuéntelas utilizando un hemocitómetro. Prepare tres veces 10 a la quinta células y centrifúgelas durante cinco minutos a 515 ×g a temperatura ambiente.Descarte el sobrenadante por succión y resuspenda las células en 0,5 mililitros de medio para células sanguíneas. A continuación, transfiera las células a un pocillo de una placa de 24 pocillos no recubierta y agregue la mezcla del virus Sendai siguiendo las recomendaciones del fabricante. Centrifugue la placa durante 30 minutos a 1.150 ×g y 30 °C.Después de la centrifugación, incubar las células durante la noche. Al día siguiente, transferir las células transudadas a un pocillo con matriz codificada. Centrifugar la placa.Después de la centrifugación, elimine el sobrenadante, agregue un mililitro de medio para iPSC y mantenga las células. Cambie el medio diariamente y reemplácelo con medio para iPSC fresco. Mantenga las células madre pluripotentes inducidas humanas, o HIPSCs.Cambie el medio diariamente, reemplazándolo con medio esencial ocho o medio E8. Prepare dos veces 10 a la 6ª HIPSC en un mililitro 100 codificado con vitronectina y medio E8. A continuación, retire el medio E8 del recipiente de cultivo y lave las células con solución salina tamponada con fosfato estéril o PBS.Agregue un mililitro de un milimolar de EDTA e incube la placa durante dos minutos. Luego, recoja las células con tres mililitros de medio E8 y transfiera a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue las células a 250 ×g a temperatura ambiente durante dos minutos.Aspire el sobrenadante sin perturbar el pellet celular y re suspenda las células en cinco mililitros de medio E8. Después de contar las células con un hemocitómetro, prepare dos veces 10 a la 6ª células para cada placa de Petri de 100 milímetros. Re suspenda las células preparadas en una mezcla uno a uno de 10 mililitros de medio E8 y medio EB, con 10 micromolar de inhibidor de la carnasa asociada a row, o inhibidor ROCK.Incube las células durante la noche para la agregación. Al día siguiente, recolecte los EBs agregados mediante pipeteo. Retire el sobrenadante y re suspenda los EBs en 10 mililitros de medio E8 fresco.Aumente los EB generados durante cinco días, realizando cambios diarios con medio E8 fresco. Para una mayor maduración, cambie el medio de cultivo al medio E7. Mantenga los EB a 37 grados centígrados y 5 % de dióxido de carbono durante otros cinco días, realizando cambios diarios del medio con medio E7 fresco.Añada seis mililitros de gelatina al 1% a un recipiente de 100 milímetros y incube el recipiente durante 30 minutos. Retire la gelatina y seque completamente este recipiente durante dos o tres horas antes de su uso. Transfiera los EBs a un tubo cónico de 50 mililitros.Deje que los EB se sedimenten en el fondo del tubo cónico. Retire el sobrenadante sin perturbar los EB. A continuación, re suspenda los EB en 10 mililitros de medio de Eagle modificado por Dulbecco, o DMEM, previamente calentado, con 20 % de suero bovino fetal, o FBS.Transfiera los EB a la placa de 100 milímetros con recubrimiento de gelatina. Añada 10 micromolar de inhibidor de rock. Incube y mantenga las células durante siete días.Cambie el medio cada dos días sin agregar el inhibidor rock. Aspire el medio de cultivo del recipiente. Aplique inmediatamente un mililitro de EDTA de un milimolar al recipiente e incube las células durante dos minutos.A continuación, recolecte las células utilizando cinco mililitros de DMEM con 20 %FBS, y transfiera las células a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue las células durante dos minutos a 250 ×g, a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 10 mililitros de DMEM con 20 %FBS.Filtre y deseche los agregados celulares utilizando un filtro celular de 40 micrómetros y recupere las células individuales. Cuente las células individuales utilizando un hemocitómetro. Centrifugue las células.Elimine el sobrenadante y siembre tres veces diez a la quinta células por pellet en un tubo cónico de 15 mililitros con 300 microlitros de medio de diferenciación condrogénica, o CDM. Para la formación del pellet, centrifugue las células y luego incube las células durante la noche. Dentro de tres días, los pellets exhibirán morfologías esferoidales aplanadas.Mantenga los pellet durante 21 días. Antes de incluir, prepare y derrita parafina a 58 grados celsius. Fije los pellet en un mililitro de paraformaldehído al 4% durante dos horas a temperatura ambiente en un tubo de 1,5 mililitros.Coloque una capa de gasa sobre la caja y transfiera los pellet fijados utilizando una pipeta. Cubra el pellet doblando la gasa y cerrando la tapa de la caja. Inicie la deshidratación en 100 mililitros de etanol al 70%.Desecar los pellet mediante lavados sucesivos en etanol al 80 % y al 95 %. Transferir los pellet a etanol al 100 % durante 10 minutos. Para la clarificación, cambiar la solución por una mezcla uno a uno de 100 mililitros de etanol y xileno durante 10 minutos.A continuación, cambie la solución uno a uno por una mezcla uno a dos de etanol y xileno durante 10 minutos. Elimine el etanol restante incubando los pellet en xileno al 100 %. Para la infiltración de parafina, incube los pellet en mezclas secuenciales de xileno y parafina.Realice todo el proceso de infiltración con parafina a 58 grados celsius. Incube los pellet en 100 mililitros de una mezcla dos a uno de xileno y parafina durante 30 minutos. A continuación, sustituya la solución por 100 mililitros de una mezcla uno a uno de xileno y parafina e incube durante 30 minutos.Luego, cambie la solución por 100 mililitros de una mezcla uno a dos de xileno y parafina e incube durante 30 minutos. Para la infiltración final, transfiera los pellet al primer baño de parafina al 100% e incube el pellet durante dos horas. Transfiera los pellet al segundo baño de parafina al 100% e incube durante la noche a 58 grados Celsius.Al día siguiente, utilice pinzas para transferir suavemente los pellet a un molde. Añada parafina al molde desde el dispensador de parafina. Solidifique la parafina durante 30 minutos a cuatro grados celsius.Corte las secciones a siete micrómetros y transfiera las secciones a la portaobjetos. Deje secar las portaobjetos durante la noche y almacénelas a temperatura ambiente hasta que estén listas para su uso. Antes de la diferenciación, las colonias de iPSC fueron expandidas.Las iPSC ampliadas se ensamblaron como cuerpos embrioides (EB) para iniciar la diferenciación. Los EB generados se adhirieron a placas recubiertas con gelatina para inducir el crecimiento celular. Tras 21 días de diferenciación, se obtuvieron pequeños agregados con aspecto de perlas con potencial condrogénico, que se utilizaron para caracterizaciones adicionales.La calidad de los pellet condrogénicos se evaluó histológicamente el día 21, utilizando pellet condrogénicos de BMSC como control positivo. La acumulación de proteínas de la matriz extracelular (ECM) secretadas por los condrocitos diferenciados se confirmó mediante tinción con azul de Alcian y azul de Toluidina. Los pellet condrogénicos generados a partir de CDMC HIPSCs expresaron niveles más altos de COL2A1 que los pellet derivados de CBMSC HIPSCs.La expresión de colágeno tipo uno, un marcador del cartílago fibroso, fue menor en los pellet derivados de CBMC HIPSC en comparación con la expresión de COL2A1. La expresión génica de proteínas de la matriz extracelular del cartílago en pellet condrogénicos del día 21 se confirmó mediante PCR en tiempo real. La expresión de agregacán en los pellet derivados de CBMC HIPSC fue similar a la de los pellet derivados de BMSC.Proporcionamos un método detallado para la diferenciación de células mononucleares derivadas de sangre de cordón de iPSCs en agregados condrogénicos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos meses si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar agregados condrogénicos a partir de iPSCs.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El estrés mecánico puede inducir la diferenciación condrogénica de las células madre, proporcionando un enfoque terapéutico potencial para la reparación del cartílago dañado. Presentamos un protocolo para inducir la diferenciación condrogénica de células madre derivadas del tejido adiposo (ASCs) utilizando la gravedad centrífuga (CG). La regulación positiva de SOX9 inducida por CG da como resultado el desarrollo de fenotipos condrogénicos.

La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Aquí, se presenta un protocolo para la disección de cordón umbilical humano umbilical (CU) y la muestra de placenta fetal en cable de forro (CL), gelatina de Wharton (WJ), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP) para el aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales (MSCs) utilizando la técnica de cultivo de explantes.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

Presentamos un protocolo para generar un linaje condrogénico a partir de sangre periférica humana (PB) a través de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando un método de integración libre, que incluye la formación de células embrionarias (EB), expansión de células fibroblásticas y inducción condrogénica.

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.

Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Este protocolo detalla el aislamiento de condrocitos, condroperogenitores derivados del ensayo de adhesión a la fibronectina (FAA-CP) y condroprogenitores migratorios (MCP) del cartílago articular humano. Abarca la digestión enzimática, la adhesión a la fibronectina y los ensayos basados en la migración para aislar y caracterizar estas células.

Aislamiento de condrocitos y condroprogenitores mediante adhesión de fibronectina y ensayo migratorio

Este estudio describe un método para producir esferoides condrocíticos mediante la agregación de células en esferoides en condiciones de baja adherencia utilizando la gravedad, seguido de un cultivo de los esferoides resultantes en mini-biorreactores.

Generación de esferoides a partir de varios condrocitos utilizando condiciones de baja adherencia por gravedad y mini-biorreactores caseros

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Aprende a generar gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre de cordón umbilical. Este protocolo permite la producción a gran escala para modelado de enfermedades y cribado de fármacos en investigación de cartílago.

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

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