Imágenes de células vivas de células fúngicas a investigar los modos de entrada y localización subcelular de defensinas de plantas antifúngicas

Planta defensinas juegan un papel importante en defensa de la planta contra patógenos. Para el uso efectivo de estos péptidos antifúngicos como antifúngicos, comprender sus modos de acción (MOA) es crítico. Aquí, se describe un método de proyección de imagen de células vivas para estudiar los aspectos críticos de MOA de estos péptidos.

El objetivo general de este método de imagen de células vivas es estudiar aspectos críticos de los mecanismos de acción de las defensinas de plantas antifúngicas en células fúngicas. Con el advenimiento de las técnicas avanzadas de microscopía confocal, las imágenes de células vivas se han convertido en una poderosa herramienta para estudiar los modos de acción de las defensinas antifúngicas de las plantas. Haciendo uso de esta tecnología, aquí presentamos un método para ayudar a responder preguntas clave en la comprensión de los modos de acción de las defensinas antifúngicas de las plantas.

Nos centramos en cómo estos péptidos se internalizan en las células fúngicas y cómo estos péptidos se localizan en los orgánulos celulares o se difunden en el citoplasma. Para hacer una suspensión conidial de la cepa PH-1 de Fusarium graminearum, primero se establecieron cultivos de la cepa en placas que contuvieran medio completo. Cultivarlos a 28 grados centígrados durante cinco días.

Para producir conidios, inocular cuatro tapones de 10 milímetros de diámetro del cultivo de cinco días de edad en 50 mililitros de medio carboximetilcelulosa. Cultive estos tapones durante cuatro a siete días a 28 grados centígrados en un agitador giratorio ajustado a 180 rpm. Cuando los cultivos tienen un color rojo, se han formado los conidios.

Para recolectar los conidios en una suspensión, agite el cultivo líquido y filtre un mililitro a través de dos capas de material de filtración, en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Centrifugar la suspensión durante dos minutos y desechar el sobrenadante. Luego, lave el pellet con un mililitro de agua estéril y repita la centrifugación.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de 2x SFM. Luego, cuente los conidios con un hemocitómetro y ajuste la densidad de la suspensión a 100, 000 conidios por mililitro. Para hacer una suspensión de conidios de Neurospora crassa, transfiera los conidios de los cultivos madre a un tubo inclinado que contenga medio de agar Vogel's e incube los tubos a temperatura ambiente bajo luz constante durante cinco días.

Después de cinco días, transfiera una pequeña cantidad de cultivo en crecimiento, utilizando un asa de inoculación, a un tubo de microcentrífuga que contenga dos mililitros de medio líquido de Vogel's. Asegúrate de mezclar los conidios del bucle. A continuación, filtra la suspensión, centrifugala y vuelve a suspender la pelletza de conidios en el medio Vogel's sin necesidad de lavarla.

Por último, ajuste la suspensión final a 100.000 conidios por mililitro. Para hacer una preparación de gérmenes para microscopía confocal, pipetee 50 microlitros de suspensión de conidios en una placa de cultivo de 35 milímetros y deje que los conidios germinen durante tres a seis horas a temperatura ambiente. Para microscopía confocal, pipetee 50 microlitros de suspensión conidial en un micropocillo de 10 milímetros de plato con fondo de vidrio.

Luego, a la concentración inhibitoria mínima predeterminada, agregue 50 microlitros de defensinas marcadas con fluorescencia a la suspensión e incube los conidios con las defensinas marcadas durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, añadir dos microlitros del colorante selectivo de membrana FM4-64, para una concentración final de cinco micromolares. Luego, incube el cultivo durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de examinar los conidios.

Para configurar el microscopio confocal, seleccione el láser de luz blanca. Utilice los láseres de 488 nanómetros y 550 nanómetros para excitar las defensinas marcadas con rodamina y el colorante FM4-64, respectivamente. Ajuste estos láseres a una intensidad del 1%Luego, ajuste las longitudes de onda de detección a 580 a 700 nanómetros para la defensina marcada con rodamina y de 690 a 800 nanómetros para el tinte FM4-64.

Ahora, recoge las imágenes. Para obtener imágenes de lapso de tiempo, agregue 50 microlitros de suspensión de conidios en un plato de micropocillos con fondo de vidrio. A continuación, monte la placa de micropocillos en el microscopio y encuentre las células a baja potencia.

A continuación, cambia a un objetivo de aceite de 100x, 1,44. Para observar las defensinas marcadas con DyLight550, ajuste la línea láser a 550 nanómetros para la excitación y de 560 a 600 nanómetros para la detección. A continuación, establezca el modo de escaneo en xyzt.

A continuación, establezca la posición Z, el zoom, la frecuencia de captura de la imagen, etc., según sea necesario. Ahora, a la suspensión de conidios, agregue 50 microlitros de defensinas marcadas con fluoróforos a la concentración inhibitoria mínima de tres micromolares, y agregue dos microlitros de colorante selectivo de membrana FM4-64 para una concentración final de cinco micromolares. Luego, vuelva a enfocar la óptica si es necesario.

Antes de capturar imágenes, coloque pequeños trozos de papel de filtro húmedo en el plato de micropocillos para evitar la evaporación. A continuación, procesa capturando una imagen cada 3,5 minutos durante 2,5 horas. Se llevaron a cabo imágenes de células vivas para rastrear y comparar la internalización y localización subcelular de dos defensinas de Medicago truncatula.

La defensina cuatro marcada con rodamina sintetizada químicamente se traficó de manera diferente en Neurospora crassa y Fusarium graminearum. FM4-64 marcó las membranas plasmáticas de ambos hongos. Sin embargo, en Fusarium, la defensina cuatro se difunde en el citoplasma.

Mientras que, en Neurospora, se transporta a cuerpos vesiculares. A modo de comparación, la defensina cinco se visualizó utilizando una etiqueta DyLight550 en Neurospora crassa, junto con el marcaje de la membrana plasmática mediante FM4-64. Las imágenes de lapso de tiempo muestran que esta defensina ingresa a las células en 30 a 40 minutos y luego se difunde a través del citoplasma.

Esto difiere del tráfico de defensina cuatro, que ingresa a las células y permanece atrapada dentro de los cuerpos vesiculares incluso después de tres horas. En resumen, las imágenes de células vivas son una herramienta poderosa para aumentar nuestra comprensión de los modos de acción de las diferencias de las plantas antifúngicas. Junto con otros tintes fluorescentes vitales y marcadores celulares, tiene la flexibilidad de modificarse para otros péptidos antimicrobianos.

En última instancia, esta técnica puede ayudar a desarrollar nuevas estrategias para el uso de péptidos antimicrobianos como agente antifúngico en la agricultura y la medicina.