Localización cuantitativa de una proteína de Golgi por su masa centro de fluorescencia de imagen

El objetivo general de este método basado en imagen es localizar cuantitativamente una proteína de Golgi a resolución nanométrica. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el estudio del aparato de Golgi, como la organización del Golgi y su funcionamiento. La principal ventaja de este método es que utiliza un microscopio óptico convencional y herramientas de software.

Para empezar, cultiva células HeLa en un matraz de T25 en DMEM suplementado con un 10% de FBS e incuba el cultivo a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, aspira el medio de cultivo y añade un mililitro de EDTA al 25% de tripsina al matraz. Incuba las células a 37 grados Celsius durante dos minutos.

Retira las células de la incubadora y añade un mililitro de medio completo para limpiar suavemente las células de la pared del matraz. Transfiere las células separadas a un tubo de centrifugación estéril y haz girar el tubo a 500 g durante dos minutos para pelletar las células. Después de aspirar el sobrenadante, utiliza un mililitro de medio completo para suspender el pellet celular.

Retirar el medio del pozo de una placa de 24 pozos que contiene una capa de vidrio esterilizada y sembrar aproximadamente 100.000 celdas en el pozo. Usa medio completo para aumentar el volumen del pozo a 5 mililitros. Luego, incuba la placa a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono.

Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, se utilizan 80 nanogramos de GalT-mCherry y 320 nanogramos de ADN plasmídico TPST1-EGFP y reactivo de transfección para transfectar las células según el protocolo del fabricante. Tras incubar las células durante cuatro a seis horas, cambia el medio y devuelve las células a la incubadora durante 12 horas. Aspira el medio en el pozo y añade 5 mililitros de 33 micromoldes Nocodazol que contiene un medio completo y luego incuba las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante tres horas.

Después de limpiar los deslizamientos de la cubierta de vidrio según el protocolo de texto, utiliza una vez PBS que contenga 1 microgramo por microlitro de BSA para diluir perlas fluorescentes multicolores de 110 nanómetros 80 veces. Haz un vórtice breve del tubo para dispersar los agregados de perlas. Usando la punta de una pipeta, extiende 60 microlitros de cuentas diluidas sobre una funda limpia.

En la oscuridad, coloca la funda de la cubierta en una bandeja de 35 milímetros y cúbrela con papel de aluminio. Seca la cubierta en la oscuridad en un desecador conectado a una bomba de vacío. Luego usa 50 microlitros de medio de montaje para montar la cubierta sobre una lámina de vidrio.

Limpiar correctamente las cubiertas es esencial para eliminar los residuos fluorescentes. Para fotografiar cuentas multicolores en canales verdes, rojos y rojos lejanos, al inicio de la sesión de imagen, adquiere pilas 3D de imágenes, tomando tres secciones por encima y por debajo del mejor plano focal. Guarda las pilas como archivos TIFF.

Para obtener imágenes de mini-pilas de Golgi, utiliza TPST1-EGFP y GalT-mCherry transfectados en diapositivas etiquetadas con fluorescencia para encontrar células que expresen TPST1-EGFP y un GalT-mCherry de nivel bajo o medio. Adquiere pilas de imágenes 3D como acabo de mostrar. Para analizar las imágenes, abre la imagen J, elige Archivo, Imagen, Abierto, para abrir un conjunto de imágenes de cuentas que constan de tres archivos TIFF.

Elige Imagen, Stacks, Z Project, para promediar tres secciones consecutivas alrededor de la sección mejor enfocada en el canal rojo. Introduce el número de sección del corte inicial y el corte de parada y, entre las opciones de tipo de proyección, selecciona la intensidad media. Dibuja retornos de inversión de fondo que no contengan cuentas en la imagen.

Luego, en Analizar, Establecer mediciones, comprueba solo el valor gris medio y la desviación estándar o SD. Ejecutar, analizar, medir, para obtener la intensidad media de fondo y la desviación estándar. Elige Procesar, Matemáticas, Susta, para restar la imagen con los valores correspondientes de la intensidad media de fondo más seis veces la desviación estándar. Luego introduce el valor calculado correspondiente a este canal.

Repite el promediado y la resta para las pilas de imágenes de canales verde y rojo lejano usando el mismo corte de inicio y final y el mismo retorno de inversión en fondo. Fusiona las tres imágenes procesadas usando Imagen, Color, Fusiona canales, seleccionando el canal R como rojo, canal G como verde y canal B como azul. Lanza el Gestor de ROI eligiendo Analizar, Herramientas, Gestor de ROI.

Dibuja los retornos de inversión cuadrados alrededor de cuentas individuales. Luego añade el ROI al Gestor de ROI pulsando T en el teclado. En Analizar, Establecer medidas, comprueba solo el centro de masa.

En el Gestor de ROI, selecciona el canal R y haz clic en Medir para obtener las coordenadas X e Y de los centros de ROI en la ventana de resultados. Copia y pega las dos columnas en una hoja de cálculo. Obtén las coordenadas de los centros de retorno de inversión para el canal G y el canal B. Guarda la hoja de cálculo como beads.csv.

En la imagen J, usa plugins instalados para instalar los dos macros, macro Golgi inspección ROI y macro para sacar datos de tres canales. Borra la ventana de ROI Manager y resultados. Abre un conjunto de imágenes mini-pila de Golgi que constan de tres archivos TIFF.

Genera imágenes de fondo con sustrato como se ha demostrado antes en este vídeo para su uso posterior. Luego duplica las imágenes. En Proceso, Calculadora de Imágenes, añade las imágenes del canal G, canal R y canal B de fondo restadas.

En la imagen resultante en Imagen, Ajustar, Umbral, selecciona Establecer para introducir uno como el nivel umbral más bajo. En Analizar, Analizar partículas, introduce también el rango de tamaño para el píxel de tamaño. Introduce 50 a infinito, marca excluyentes en los bordes y añade al administrador.

A continuación, utiliza Imagen, Color, Fusionar canales para fusionar las tres imágenes de fondo que se generaron anteriormente seleccionando el canal R como rojo, el canal G como verde y el canal B como azul. Luego ejecuta la macro macro inspección ROI de Golgi seleccionando Plugins, Macro, Inspección ROI de Golgi. Es importante seleccionar tantos ROIs como sea posible que contengan mini-pilas de Golgi individuales en un conjunto de imágenes.

En Analizar, Establecer mediciones, comprueba solo área, valor medio gris y centro de masa. Obtén datos lanzando la herramienta macro y saca datos de tres canales. Copia las coordenadas de los centros en una hoja de cálculo en el orden indicado aquí.

Luego guarda la hoja de cálculo como ministacks.csv. Proceder a la corrección de desplazamiento cromático de los centros y al cálculo del Cociente de Localización o LQ según el protocolo de texto. El microscopio óptico de grado de investigación moderno equipado con la lente apocromática simple, como el que se usa aquí, muestra un desplazamiento cromático mínimo.

Sin embargo, un examen cuidadoso de la imagen multicolor de la cuenta lo revela. Los centros de fluorescencia roja se definen como las posiciones reales de las cuentas. Los desplazamientos cromáticos relativos de la fluorescencia verde y roja lejana pueden representarse mediante vectores.

El desplazamiento cromático dentro del plano de imagen se ilustra con el vector verde y azul de cada perla. Como se ilustra aquí, la corrección del desplazamiento cromático reduce significativamente el desplazamiento cromático. En las células de mamíferos, el complejo de Golgi se agrega en el área perinuclear, lo que normalmente no es resoluble bajo un microscopio óptico convencional.

Tras el tratamiento con Nocodazol, el complejo perinuclear de Golgi desaparece y decenas de mini-pilas de Golgi se ensamblan en los sitios de salida del retículo endoplásmico a lo largo del citoplasma. Aquí se muestra una imagen de ejemplo generada usando el análisis de imágenes mostrado en este vídeo. Utilizando la herramienta macro de inspección de ROI de Golgi, se listaron 40 mini-pilas de Golgi seleccionadas.

Tras aplicar los tres criterios, se pudieron analizar 21 mini-pilas de Golgi para el cálculo de los LQ de TPST1-EGFP. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora después del marcado por fluorescencia. Tras su desarrollo, este método allanó el camino para que los investigadores que estudian el aparato de Golgi localizaran cuantitativamente una proteína de Golgi con una resolución equivalente a la de la microscopía de inmunoelectrones.