Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM

El objetivo general de este protocolo de imagen es visualizar múltiples proteínas en una célula T activada, utilizando microscopía de localización de moléculas individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la activación de células T, como la distribución de moléculas individuales de TC o componentes de microagregados. La principal ventaja de esta técnica es que permite una mayor multiplexación que la lograda mediante los métodos actuales de microscopía de solución supervisada.

Para comenzar, conjuge directamente los anticuerpos con el colorante Alexa 647 utilizando el kit de marcado de anticuerpos Alexa 647, siguiendo el protocolo de marcado proporcionado por el fabricante. Centrifugue los anticuerpos marcados durante cinco minutos a 20.800 × g. Tras la centrifugación, recoja el sobrenadante para eliminar los anticuerpos agregados. A continuación, recubra las cámaras con cubreobjetos A12 con 250 microlitros de poli-L-lisina al 0,1 % durante 15 minutos.

Luego, aspire la solución sin enjuagar y seque las cámaras a 65 grados Celsius durante 30 minutos. Prepare una dilución de nanodiamantes fluorescentes de 100 nanómetros o FNDs en un PBS, pruebe varias diluciones para asegurar que haya suficientes FNDs visibles en cada campo. Vortexee los FNDs diluidos durante un minuto.

A continuación, someta el sobrenadante de FND a ultrasonido durante 30 segundos a potencia alta. Incube el sobrenadante de FND sometido a ultrasonido en una cámara con cubreobjetos A12 recubierta con poli-l-lisina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar la cámara cinco veces con PBS 1x, visualice la cámara recubierta con FND utilizando excitación con láser de 647 nanómetros en el microscopio turf.

Utilice un objetivo de 100x con un campo de visión de 61 por 61 micrones. Idealmente, deben ser visibles cuatro a diez FND individuales en el campo de visión, dada la dilución adecuada de FND, con al menos un FND presente en cada cuadrante del campo de imagen. Una vez que se haya alcanzado la densidad adecuada de FND, agregue 250 microlitros de anticuerpo anti-CD3 a cada pocillo.

Incube la cámara durante una hora a 37 grados Celsius o durante la noche a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, retire la solución de los pocillos y agregue PBS 1x durante 30 segundos. Repita este paso de lavado cinco veces.

Centrifugar un mililitro de células T Jurkat a 800 ×g durante seis minutos. Las células T Jurkat deben tener idealmente una concentración de 0,5 a un millón de células por mililitro antes de la centrifugación. Re-suspender las células en 300 microlitros de solución HBS 1x.

Mientras tanto, agregue 150 microlitros de solución de HBS 1x a cada pocillo de la cámara e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego, agregue 50 microlitros de las células T Jurkat re-suspendidas a cada pocillo e incube durante tres minutos a 37 grados Celsius. A continuación, agregue 300 microlitros de paraformaldehído al 4 % a cada pocillo e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius.

Después de lavar tres veces con PBS 1x, permeabilice las células añadiendo 250 microlitros de solución de Triton X al 0,1 % durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras tres lavados adicionales con PBS 1x, añada 250 microlitros de solución de gelatina de pescado al 1 % a cada pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, lave las células tres veces más con PBS 1x.

Añada 200 microlitros de anticuerpo marcado a una concentración de 0,1 a 0,5 microgramos por mililitro a las células fijadas durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar las células cinco veces con PBS 1x, añada un mililitro de tampón STORM y cubra la cámara con una laminilla de vidrio para limitar la exposición. Utilice pinzas en la platina del microscopio para mantener la cámara con la laminilla en posición.

Este paso es fundamental para la multiplexación a gran escala, ya que el mismo campo de visión debe mantenerse después de varias rondas de lavado e incubación. Utilizando una potencia baja del láser de 647 nanómetros en modo turf, localice una célula teñida con al menos tres FND en el campo de visión. Aumente la potencia del láser de 647 nanómetros y adquiera las imágenes.

Los parámetros típicos se pueden encontrar en el protocolo escrito. Lave las células cinco veces con solución salina tamponada con tris 1x o TBS 1x. A continuación, agregue un mililitro de tampón de elución e incube a temperatura ambiente durante un minuto.

Repita la elución tres veces. Utilice las condiciones exactas de elución y el número de lavados de elución necesarios para eliminar la señal, según se especifique para cada anticuerpo. Luego, lave las células tres veces con TBS 1x y agregue un mililitro de PBS 1x.

La ejecución adecuada de este paso de elución dará como resultado la eliminación del anticuerpo previamente unido y permitirá una mayor eficiencia en la marcación posterior con anticuerpos. Es importante utilizar TBS para los lavados con el fin de minimizar la precipitación entre los pasos de elución. Realice el blanqueamiento fotográfico de las células utilizando un láser de 647 nanómetros a alta potencia, junto con un láser de 405 nanómetros a dos o cinco milivatios, para activar ópticamente los colorantes Alexa 647 en estado oscuro.

Esperar hasta que toda la señal restante del anticuerpo no eluido se fotoactive. Por lo general, esto requiere de dos a cinco segundos de exposición al láser. Adquirir imágenes de la muestra utilizando la configuración STORM tras la ilusión y la fotoblanqueamiento, para confirmar la eliminación de la señal.

A continuación, agregue 250 microlitros de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos. Esto evita la descrosslinkación de las moléculas fijadas en la célula. Lave las células tres veces con PBS 1x.

Repita estos pasos para la etiquetado secuencial de múltiples objetivos. Finalmente, realice la corrección de deriva y alineación de pilas de imágenes multiplexadas según se describe en el protocolo de texto. Se utilizó el método secuencial de ilusión y permanencia para producir la imagen multiplexada MET STORM de microagregados y otras estructuras en una célula T Jurkat activada.

La imagen final de MET STORM ha sido corregida para compensar la deriva y el alineamiento, utilizando la corrección promedio de marcadores fiduciales y marcadores fiduciales FND. Se muestran aquí imágenes de microscopía de localización de molécula individual de un FND individual localizado en 30.000 cuadros de imagen antes y después de la corrección de deriva con corrección fiducial promedio. De manera similar, aquí se presentan imágenes de microscopía de localización de molécula individual de una célula T Jurkat activada marcada con anticuerpo anti-SLP76 fosforilada y marcadores futusiales FND, antes y después de la corrección de deriva con corrección futusial promedio.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes superresolutas multiplexadas de proteínas en una célula T activada, utilizando MET STORM. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres horas por cada ronda de multiplexación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la muestra en la misma posición sobre la platina del microscopio.

Esto puede realizarse utilizando pinzas para microscopio. No olvide que trabajar con nuestro tampón STORM modificado puede ser extremadamente peligroso, y siempre deben tomarse precauciones como el uso de respiradores y gafas protectoras al realizar este procedimiento.