Name: Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende a visualizar múltiples proteínas en células T activadas mediante microscopía de localización de moléculas individuales. Esta técnica permite mayor multiplexado que los métodos tradicionales para estudiar la distribución de componentes de microclusters.

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Damos las gracias a Xufeng Wu por el acceso al microscopio STORM. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) Centro de Investigación del Cáncer y el Instituto Nacional de Pulmón del Corazón y la Sangre (NHLBI).

Precaución: Antes de usar, consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) pertinentes. Varios de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y carcinógenos. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando realice el protocolo, incluyendo el uso de controles de ingeniería (campana extractora de humos, guantera) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados). 1. Imágenes multiplexadas de células T activadas <ol><li> Directamente conjugar los anticuerpos con Alexa-647 (A647) colorante utilizando el Alexa 647 kit de marcaje de anticuerpos. Siga el protocolo de etiquetado proporcionado por el fabricante. NOTA: Se recomienda la diálisis de la solución de anticuerpo en 1x PBS antes de este paso para aumentar la eficacia del etiquetado del anticuerpo. </li><li> Girar los anticuerpos marcados durante 5 min a 20.800 rcf y recoger el sobrenadante para eliminar los anticuerpos agregados. </li><li> Preparación de cubreobjetos fluorescentes recubiertos de nano-diamante <ol&gt; <li> Recubrir las cápsulas de cubreobjetos de 8 pocillos (ver lista de reactivos / material) con 250 μl de Poly-L-lisina al 0,01% (PLL) durante 15 minutos, aspirar y secar a 65 ° C durante 30 minutos. (No enjuague antes de secarse.) </li><li> Preparar una dilución de 100 nm FNDs en 1x PBS. Pruebe varias diluciones para asegurarse de que hay suficientes FNDs visibles en cada campo de visión en el paso 1.2.7 (estamos usando una dilución 1: 200 de FNDs proporcionada por el fabricante). </li><li> Vórtice los FNDs diluidos durante 1 min. </li><li> Sonicar el sobrenadante FND durante 30 s en un ajuste de alta potencia. </li><li> Incubar el sobrenadante de FND sonicado en una cámara de cubreobjetos de 8 pocillos revestidos con PLL durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5 veces con 1x PBS y visualizar la cámara recubierta de FND usando una excitación con láser de 647 nm en el microscopio TIRF. Idealmente, 4-10 FNDs individuales deben ser visibles en un campo de vista dada la dilución apropiada de FNDs en la etapa 1.2.2 (estamos usando un objetivo 100X con 256 x 256 de configuración de píxeles de cámara para producir 61 x 61 μm de campo de visión) con enMenos un FND presente en cada cuadrante del campo de imagen. Si los FND parecen estar agrupados ( es decir, FNDs con señal significativamente más alta que los FNDs circundantes y una función de propagación de puntos mayor de 200 nm), centrifugar los FND a 6,800 rcf durante 1 min y repetir el procedimiento de revestimiento usando el sobrenadante FND. </li><li> Añadir 250 μl de anticuerpo anti-CD3 (10 μg / ml) en cada pocillo e incubar durante 1 hora a 37 ° C, o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Retire la solución y agregue 1x PBS durante 30 s. Repita este paso de lavado 5 veces (lavado 5x). </li></ol></li><li> Activación de células T de Jurkat <ol><li> Hilar 1 ml de células Jurkat T a 800 rcf durante 6 min y resuspender en 300 μl de solución 1x HBS. Las células T de Jurkat deberían estar idealmente a una concentración de 0,5-1,0 x 106 células / ml antes del hilado. 1x solución HBS consiste en solución salina tampón HEPES con albúmina sérica bovina al 1% como se ha descrito anteriormente 22 . </li><li> Añadir 150 μLDe una solución de HBS 1x en cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Añadir 50 μL de células T Jurkat resuspendidas a cada pocillo e incubar durante 3 minutos a 37 ° C. </li><li> Añadir 300 μL de Paraformaldehído al 4% a cada pocillo e incubar durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lavar 3 veces con 1x PBS. </li><li> Permeabilizar las células mediante la adición de 250 μL de solución de Triton-X al 0,1% durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 veces con 1x PBS. </li><li> Añadir 250 μl de solución de gelatina de pescado al 1% en 1x PBS a cada pocillo durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 veces con 1x PBS. </li></ol></li><li> Las células T Jurkat activadas por imágenes utilizan madSTORM <ol><li> Añadir 200 μl de anticuerpo marcado a 0,1-0,5 μg / mL a células fijas durante 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5 veces con 1x PBS. </li><li> Añadir 1 ml de tampón STORM y cubrir la cámara con un cubreobjetos de vidrio para limitar la exposición al aire. El buffer de STORM se ha descrito previamente 10 . Recomendamos maRey nuevo STORM buffer para cada ronda de imágenes y girar el buffer STORM a 20.800 rcf durante 2 min para eliminar los precipitados. </li><li> Usando baja potencia láser de 647 nm en el modo TIRF, ubique una célula manchada con al menos 3 FND en el campo de visión. Para facilitar la localización de FNDs, se puede utilizar la excitación concomitante con láser de 568 nm para aumentar el brillo de la señal FND. NOTA: El rendimiento de la corrección fiducial promedio descrita en la sección 2.1 mejora con la inclusión de más FND. </li><li> Aumentar la potencia láser de 647 nm y adquirir imágenes. Normalmente adquirimos 10.000 fotogramas a una exposición de 200 ms, láser de 125 mW 647 nm, lentes objetivo 100X TIRF (1,49 NA), ganancia 100X EM (5 MHz a 16 bits, ganancia de conversión 1). Los detalles de nuestra configuración de imagen se han descrito anteriormente 10 . </li><li> Lavar 5x con 1x TBS. </li><li> Añadir 1 ml oF de tampón de elución (MgCl $ ₃ $ 3,5 M, PIPES 20 mM, Tween-20 al 0,1%, pH 6,5) e incubar a temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Repetir la elución 3 veces. (Deben determinarse las condiciones exactas de elución y el número de enjuagues de elución necesarios para eliminar la señal para cada anticuerpo utilizado). </li><li> Lavar 3 veces con 1x TBS y añadir 1 ml de 1x PBS. </li><li> Photobleach usando láser de 647 nm de alta potencia (125 mW) con láser de 405 nm a 2-5 mW para activar fotoactivamente los colorantes A647 en estado oscuro. Espere hasta que toda la señal restante de anticuerpo no eluido sea fotoblanqueada. Típicamente esto toma 2-5 s de la exposición del laser. Se recomienda adquirir imágenes de muestra (~ 100 fotogramas) utilizando la configuración STORM en 1.3.5 después de la elución y fotoblanqueo para confirmar la eliminación de la señal. Normalmente eliminamos el 99,8% de la señal utilizando este método. Se recomienda probar la eficiencia de elución de cada anticuerpo antes de su uso en madSTORM como se muestra anteriormente [ 10] . </li><li> Añadir 250 mu l de paraformaldehído al 4% durante 15 min. Esta prEventos de reticulación inversa de moléculas fijas en la célula. </li><li> Lavar 3 veces con 1x PBS. </li><li> Repita los pasos 1.3.1-1.3.12 para el etiquetado secuencial de objetivos múltiples. La Figura 1 muestra una imagen compuesta de múltiples moléculas en una célula T de Jurkat activada adquirida usando madSTORM. </li></ol></li></ol> 2. Corrección de deriva y alineación de pilas de imágenes multiplexadas <ol><li> Corrección de la deriva de pilas de imágenes madSTORM <ol><li> Abrir imágenes con ImageJ. Recomendamos convertir los archivos de imagen a un formato TIFF antes de abrirlos en ImageJ. Utilice rectángulo ROI para seleccionar un único FND. Reproducir el lapso de tiempo para asegurarse de que el FND es visible en cada marco de la pila de imágenes. Utilice Run Analysis en el complemento ThunderSTORM para localizar el FND. Para el método de corrección fiducial en promedio descrito en 2.1.5, es importante que un único FND se localiza en cada trama de imagen ( es decir, el número de picos identificados debe ser eCalidad al número de fotogramas). </li><li> Si el FND no está identificado en cada trama, seleccione otro FND. Si varios picos se encuentran en un solo cuadro, quite el pico que se desvía más de picos anteriores. </li><li> Repita 2.1.2 para cada FND en la pila de imágenes. Tenga en cuenta que algunos FNDs no deben ser incluidos en el proceso de corrección de deriva para que puedan servir como un indicador independiente para la precisión de corrección de deriva como se describe en el paso 2.1.7. </li><li> Para una corrección de deriva más rápida y menos precisa, utilice los algoritmos de correlación cruzada o de corrección fiducial incluidos en ThunderSTORM para corregir las imágenes FND. Usualmente se usan 100 bins, 5 de aumento, y 0,1 factor de suavizado de trayectoria para correlación cruzada y 10 de distancia máxima, 0,1 min de relación de visibilidad de marcador y 0,01 de factor de suavizado de trayectoria para la corrección fiducial. La correlación cruzada y la corrección fiducial producirán un archivo de corrección que se puede aplicar a otros FND para probar la precisión de corrección de deriva. </li><li> Para una corrección de deriva más estricta y precisa, utilice el algoritmo de corrección fiducial promedio (AFC) como se describió anteriormente 10 . Este proceso no requiere la optimización de los parámetros y proporciona una precisión de localización más alta de lo previsto por los algoritmos de localización SMLM. Sin embargo, la corrección de deriva promedio requiere al menos 4 FNDs y para que los FNDs se localizen en cada trama de la pila de imágenes. La corrección de la deriva de AFC mejora mejor con la inclusión de más FNDs porque un gran número de FND localizados disminuirá el efecto de distorsión de un pico de outlier en un marco dado. </li><li> Localice todas las funciones de propagación de puntos dentro de la pila de imágenes usando ThunderSTORM como se describió anteriormente 10 . Por lo general, usamos un tamaño de píxel de 100 nm, fotoelectrones por recuento A / D de 4,28, recuento A / D de nivel base de 100, ganancia EM de 100, PSF: localización gaussiana integrada, radio de ajuste de 5 píxeles, método de ajuste de máxima verosimilitud y 1,3 Píxel sigma inicial.</li><li> Aplicar el factor de corrección de deriva adquirido de FNDs a las localizaciones de toda la pila de imágenes. Inspeccione visualmente la imagen final para asegurar una correcta corrección de la deriva ( Figura 2 ). El factor de corrección de la deriva resultante debe ser probado independientemente en FNDs no incluidos en el procedimiento AFC para medir el nivel de precisión de corrección de deriva. La precisión de los FND independientes y corregidos por la deriva debería ser cercana al valor promedio de precisión / incertidumbre calculado a partir del algoritmo de localización utilizado en el paso 2.1.6. </li><li> Repita los pasos 2.1.1-2.1.7 para las pilas de imágenes madSTORM de anticuerpos marcados secuencialmente. Tenga en cuenta que la localización del mismo conjunto de FNDs en cada pila de imágenes madSTORM es crítica para el siguiente procedimiento de alineación. </li></ol></li><li> Alineación de imágenes madSTORM <ol><li> Calcule la posición del centroide de los FNDs corregidos por deriva en cada imagen madSTORM. Para hacer esto, encuentre el eje xyy medioPara cada localizada FND, y el promedio de la media xyy posiciones de todos los FNDs en cada madSTORM imagen. El algoritmo detallado para este paso se ha descrito anteriormente 10 . Alinee las imágenes madSTORM secuenciales utilizando las posiciones centróides de los marcadores fiduciales FND. Para realizar la alineación, calcule el desplazamiento entre dos localizadas madSTORM imágenes mediante la sustracción de la posición centroide de FNDs en la segunda madSTORM imagen de la primera. A continuación, resta la cantidad de desplazamiento de todas las localizaciones en la segunda imagen madSTORM. </li><li> Se recomienda utilizar la primera imagen madSTORM como imagen de referencia y repetir este paso de alineación entre el primero y el tercero, el primero y el cuarto, etc. Pruebe la precisión de la alineación midiendo el desplazamiento entre los FND no incluidos en el proceso de alineación. Los desplazamientos grandes pueden indicar que se usaron diferentes conjuntos de FNDs al calcular las posiciones de centroide de las imágenes secuenciales de madSTORM. </li><li> Si es así, los pasos 2.2.1-2.2.2 shouLd se repita utilizando el mismo conjunto de FNDs para realizar la alineación. NOTA: Se proporcionan códigos personalizados para los procedimientos de corrección de deriva de AFC y de alineación. </li></ol></li></ol>

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Los procedimientos de multiplexación secuencial, corrección de deriva y alineación en madSTORM permiten una visualización precisa y altamente multiplexada de estructuras heterogéneas en células. 10 Además, madSTORM evita las limitaciones de la TORMENTA multicolor como la aberración cromática y las propiedades de fotosensibilización / emisión subóptimas de colorantes rojos no lejanos 9 , 12 . A medida que la etapa de elución reduce signifi...

Se han desarrollado una variedad de técnicas de microscopía de super resolución para superar el límite de difracción de la microscopía óptica (~ 200 nm). Entre éstas se encuentra una categoría de técnicas denominadas microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM) que incluye microscopía de localización por fotoactivación (PALM) y microscopía óptica de reconstrucción estocástica (STORM). Las técnicas SMLM comparten el uso de fluoróforos que pueden ser conmutados entre los estados (fluorescente) y apagado (oscuro / foto-conmutado), permitiendo la localización secuencial de la fluorescencia de las moléculas individuales 1 , 2 , 3 . Debido a su compatibilidad con colorantes y microscopios comercialmente disponibles, STORM directa (dSTORM) se ha convertido en una técnica SMLM ampliamente adoptada 4 . DSTORM puede alcanzar rutinariamente una precisión de localización de ~ 10 nm, definida como la incertidumbre en el cálculo del centro de un difractoFunción de propagación de puntos limitados por iones (PSF). Sin embargo, a pesar de la alta precisión estimada utilizando los algoritmos de localización 5 , 6 , 7 , la determinación exacta de la ubicación real de las moléculas individuales se ha visto obstaculizada por una serie de cuestiones. En primer lugar, el movimiento mecánico de la etapa del microscopio durante la adquisición de imágenes añade una incertidumbre significativa a la precisión de localización. Como las imágenes SMLM se obtienen a lo largo de miles de marcos de lapso de tiempo, los movimientos a escala nanométrica de la etapa del microscopio pueden comprometer significativamente la precisión de la imagen de superresolución final 8 . Para compensar el movimiento de la etapa durante la adquisición de la imagen, la deriva de la etapa es comúnmente estimada a partir de la adaptación basada en regresión de localizaciones binned de la propia imagen (correlación cruzada) o localizaciones secuenciales de los marcadores fiduciales (corrección fiducial) 1 , 9 . Sin embargoEstos métodos requieren la optimización de múltiples parámetros para cada pila de imágenes y no pueden dar cuenta de movimientos de escenario a escalas de tiempo cortas tales como vibración mecánica. Las nanopartículas de oro y las bolas fluorescentes multicolores se han utilizado como marcadores fiduciales en SMLM, pero no son foto-estables y resultan en una precisión significativamente menor después de la corrección de la desviación que los nano-diamantes fluorescentes (FND) En madSTORM 10 . Además del límite de difracción, la microscopía óptica está restringida además por límites espectrales. La visualización simultánea de objetivos múltiples requiere sondas fluorescentes con perfiles espectrales que no se superponen, restringiendo generalmente la microscopía de luz basada en fluorescencia a 6 colores y SMLM a 2-3 colores 4 , 11 , 12 . Además, la aberración cromática no lineal causa desalineación de las imágenes multicolor, wQue requieren amplios procedimientos de alineación utilizando marcadores fiduciales multicolor 8 , 13 . Para superar estos límites, los estudios previos han imaginado múltiples objetivos utilizando fotoblanqueo repetitivo o quimioterapia química de fluoróforos unidos secuencialmente 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Aunque estos métodos pueden superar los límites espectrales de la microscopia, el blanqueo por fluorescencia es conocido por ser un proceso tóxico 20 , y el blanqueo o apagado prolongado puede causar efectos secundarios no deseados tales como pérdida de reticulación. Además, la acumulación de sondas fluorescentes podría conducir al bloqueo estérico de sitios de unión en la muestra, impidiendo la multiplexación a gran escala y la focalización robusta de epítopos. Para evitar tal interferencia estérica, una recienteTudy logrado multiplexing utilizando intercambio estocástico de libremente difundir fragmentos de proteínas [ 21] . Mientras que este método permite el etiquetado denso de las estructuras celulares, requiere una preparación bioquímica extensa para aislar fragmentos peptídicos, no puede localizar posiciones de una sola molécula y no facilita fácilmente el multiplexado a gran escala usando sondas comercialmente disponibles. Presentamos un protocolo detallado de video que describe la unión secuencial y la elución de anticuerpos fluorescentes para la obtención de imágenes dSTORM (madSTORM) de tamaño limitado de anticuerpos, y el uso de nano-diamantes fluorescentes para lograr corrección y alineación precisa de la deriva.

<table><tbody><tr><td>Cámara de cubreobjetos de 8 pocillos</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>solución de poli-L-lisina al 0,1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 nm Nano-diamante fluorescente</td><td>Adamas</td><td>Red FND</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 y épsilon; anticuerpo</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, fracción V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10% Paraformaldehído</td><td>EMS</td><td>15712</td> Gelatina <td>carcinógena</td></tr><tr><td>de piel de pescado de agua dulce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 kit de etiquetado de anticuerpos</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>PIPAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Altamente tóxico, sensible al aire</td></tr><tr><td>Cisteamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>Ciclooctatetraeno 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>Altamente tóxico, sensible al aire</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD Médico</td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>KD Médico</td><td>RGF-3385</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplexado de alta resolución de imágenes de células t utilizando madstorm

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

La creación de imágenes de estructuras celulares heterogéneas mediante la microscopía de localización de moléculas individuales se ha visto dificultada por la precisión de localización y la capacidad de multiplexación inadecuadas. Utilizando marcadores fiduciales fluorescentes de nano-diamante, describimos los procedimientos de corrección y alineación de deriva requeridos para obtener alta precisión en microscopía de localización de molécula única. Además, se describe una nueva estrategia de multiplexación, madSTORM, en la que se dirigen múltiples moléculas en la misma célula usando unión secuencial y elución de anticuerpos fluorescentes. MadSTORM se demuestra en una célula T activada para visualizar las ubicaciones de los diferentes componentes dentro de una membrana-bound, multi-proteína estructura llamada el microcluster de células T receptor. Además, se discute la aplicación de madSTORM como una herramienta general para la visualización de estructuras multi-proteína.

Se utilizó el método secuencial de elución y tinción para producir la imagen madSTORM multiplexada de microclusters y otras estructuras en una célula T de Jurkat activada ( Figura 1 , alineaciones de figuras de comprobación). Cada imagen pseudo-coloreada representa una ronda de formación de imágenes madSTORM adquirida en los pasos 1.1.1 a 1.3.13. Como se ha descrito anteriormente 10 , el campo de visión debe ser monitorizado para dete...

Demostramos un método para la imagen de múltiples moléculas dentro de nano-estructuras heterogéneas con una sola molécula exactitud utilizando secuencial vinculante y elución de fluorescently marcó anticuerpos.

Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

El objetivo general de este protocolo de imagen es visualizar múltiples proteínas en una célula T activada, utilizando microscopía de localización de moléculas individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la activación de células T, como la distribución de moléculas individuales de TC o componentes de microagregados. La principal ventaja de esta técnica es que permite una mayor multiplexación que la lograda mediante los métodos actuales de microscopía de solución supervisada.Para comenzar, conjuge directamente los anticuerpos con el colorante Alexa 647 utilizando el kit de marcado de anticuerpos Alexa 647, siguiendo el protocolo de marcado proporcionado por el fabricante. Centrifugue los anticuerpos marcados durante cinco minutos a 20.800 × g. Tras la centrifugación, recoja el sobrenadante para eliminar los anticuerpos agregados. A continuación, recubra las cámaras con cubreobjetos A12 con 250 microlitros de poli-L-lisina al 0,1 % durante 15 minutos.Luego, aspire la solución sin enjuagar y seque las cámaras a 65 grados Celsius durante 30 minutos. Prepare una dilución de nanodiamantes fluorescentes de 100 nanómetros o FNDs en un PBS, pruebe varia

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Se describe la preparación de tres muestras, y cómo pueden ser utilizados para optimizar y evaluar el desempeño de los microscopios TORMENTA. El uso de estos ejemplos nos muestran la forma de adquirir los datos en bruto y luego procesarla para obtener imágenes de super-resolución en las células de aproximadamente 30 a 50 nm de resolución.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Para investigar las velocidades de flujo y la direccionalidad de la actina filamentosa en la sinapsis inmunológica de las células T, se combinan imágenes de superresolución de células vivas con fluorescencia de reflexión interna total y se cuantifican con espectroscopía de correlación de imágenes espacio-temporales.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

El objetivo general de esta metodología es darle las condiciones experimentales óptimas de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes y reconstrucción para realizar imágenes 2D color doble dSTORM de microtúbulos y filamentos intermedios de células...

Filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4+ células T primarias.

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Imagen de la Sinapsis Inmunológica Humana

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Fluorescencia de reflexión interna total de alto rendimiento y microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa utilizando un chip fotónico

Aquí, describimos una estrategia simple y accesible para visualizar, cuantificar y mapear células inmunitarias en secciones de tejido tumoral incrustado en parafina fija de formalina. Esta metodología combina las técnicas existentes de análisis de imágenes y digitales con el propósito de ampliar la capacidad de multiplexación y el análisis multiparámetro de ensayos de imágenes.

Visualización, cuantificación y mapeo de poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral

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Análisis de imágenes de código de barras multiplexadas para inmunoperfilado y caracterización de mapeo espacial en el análisis unicelular de muestras de tejido de parafina

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

Aprende a visualizar múltiples proteínas en células T activadas mediante microscopía de localización de moléculas individuales. Esta técnica permite mayor multiplexado que los métodos tradicionales para estudiar la distribución de componentes de microclusters.

Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM

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