Detección de células progenitoras eritroides de donantes Residual después del trasplante de células madre hematopoyéticas para los pacientes con hemoglobinopatías

El objetivo general de este procedimiento es monitorear la quimerismo en el contexto del trasplante de células madre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del trasplante, como el injerto del trasplante de células madre hematopoyéticas en pacientes con hemoglobinopatías. La principal ventaja de este método es que combina la clasificación celular basada en citometría de flujo, el ensayo de información por columnas y el análisis subsiguiente de repeticiones de secuencias cortas para evaluar la proliferación y diferenciación de los precursores en el compartimento eritroide.

La implicación de esta técnica se extiende al tratamiento del rechazo subclínico del injerto porque podría ayudar a identificar pacientes susceptibles a la recaída de la enfermedad e iniciar estrategias inmunomoduladoras posteriores. Además, también puede aplicarse a estudios clínicos futuros, investigación con células madre y diseño de ensayos de terapia cutánea. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el proceso es difícil de aprender y debe ser realizado por personal capacitado.

Este procedimiento será demostrado por Elisabeth Hoflehner, una técnica en mi laboratorio. Para comenzar, genere una suspensión de células individuales de la muestra de médula ósea para la tinción de grasa. Para ello, coloque un filtro celular que contenga la médula ósea y enrósquelo en la parte superior de un tubo de centrífuga.

Utilice el émbolo de la jeringa para forzar los trozos de tejido a través de la malla. Para recoger todo el material, enjuague con unos pocos mililitros de tampón de suspensión. Añada tres mililitros de medio de gradiente a un tubo de centrífuga y superponga cuidadosamente la suspensión de células individuales sobre este.

Centrifugar el tubo a 550 G a 20 grados Celsius durante 30 minutos, con la aceleración ajustada en nueve y la desaceleración en cero. Retirar la capa superior que contiene plasma y plaquetas con la pipeta, asegurándose de dejar intacta la capa de células mononucleares en la interfase. Transferir esta capa de células mononucleares a un tubo de centrífuga.

A continuación, lave las células con 10 mililitros de tampón de suspensión. Centrifugue el tubo a 250 G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en dos mililitros de medio de Dulbecco modificado de Isokov completo, mediante pipeteo.

Para determinar la concentración celular con un hemocitómetro, coloque 95 microlitros de tinción de azul de tripano al 2% en una placa de 96 pocillos. Añada cinco microlitros de suspensión celular, mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante un breve tiempo. Llene el hemocitómetro y obsérvelo bajo un microscopio.

Contar solo las células viables teñidas. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 250 G a 25 grados Celsius durante 10 minutos. Para bloquear el receptor FC, utilizar 2,5 microgramos de bloqueo por 100 microlitros.

Incubar en hielo durante 10 a 15 minutos. Añadir la combinación de anticuerpos monoclonales previamente titulados adecuada para el volumen utilizado para teñir las células. Incubar a cuatro grados Celsius a oscuras durante 20 minutos.

Lave las células con tres mililitros de tampón de tinción y luego, centrifugue. Después de ajustar la concentración celular, transfiera la suspensión celular a un tubo estándar para citometría de flujo, pipeteándola a través de un filtro celular de 70 microlitros para eliminar los agregados. A continuación, configure y optimice el ordenador de células y el software según las instrucciones del fabricante.

Configure una plantilla que incluya un gráfico bivariado para mostrar la dispersión directa o FSC y la dispersión lateral o SSC. Para colocar la población celular de interés en escala, ejecute las células en el ordenador y ajuste FSC y SSC. Comience registrando los datos del tubo control negativo; después, registre los datos de cada tubo control de compensación con tinción individual y calcule la compensación.

A continuación, grafique las muestras experimentales en un diagrama de dispersión bivariado FSC, SSC para incluir tanto células linfocíticas como células mieloides. Comparando las diferentes señales de FSC, excluya dobletes y agregados. Luego, visualice las células singletes que expresan CD45 y CD36 en un diagrama de dispersión bivariado.

Los eventos positivos para CD45 representan leucocitos y sus progenitores. Los eventos negativos para CD45 y positivos para CD36 representan progenitores eritroides. Para definir las células positivas para CD36 y positivas para CD45, utilice herramientas de selección de poblaciones y luego visualice los eventos positivos para CD45 y otro diagrama de dispersión que muestre los parámetros CD34 y SSC.

A continuación, utilice herramientas de selección para definir las células positivas para CD34 o progenitores leucocitarios y las células con alta dispersión lateral o células mieloides en diversas etapas de diferenciación. Después, seleccione las compuertas para ordenar en tubos de recolección externos. Finalmente, continúe con la clasificación celular a cuatro grados centígrados hasta obtener el número deseado de células.

Diluya las células agregando medio IMDM completo suplementado con eritropoyetina recombinante humana o EPO. Transfiera 300 microlitros de las células diluidas a tres mililitros de medio H4434 e incube agitando a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, siembre tres placas de 35 milímetros con un mililitro de suspensión celular cada una.

Coloque dos de las placas de cultivo junto con una tercera llena de agua en una placa de 100 milímetros. Incube estas células en un incubador humedecido a 37 grados Celsius, con 5% de dióxido de carbono durante 14 días. Utilice un microscopio invertido con un aumento de 40x y la placa de cultivo marcada con una cuadrícula de conteo para evaluar las colonias según su morfología.

Clasifique las unidades formadoras de colonias o CFU en células progenitoras multipotenciales, células progenitoras de granulocitos y monocitos, unidades formadoras de brotes eritroides y células formadoras de colonias eritroides. Para comenzar, recupere las células del fax o de la placa de ensayo de CFU según el protocolo descrito en el texto y continúe con la extracción de ADN. Después de centrifugar las células, utilice un instrumento automatizado de aislamiento de ADN de sangre para aislar el ácido nucleico del precipitado.

Mida la concentración de ADN utilizando un fluorómetro. Prepare las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante y luego coloque la muestra en la cámara de muestra del fluorómetro. Añada ADN diluido a una mezcla de polimerasa de ADN, el conjunto de cebadores y la mezcla de reacción para preparar una reacción de PCR según el manual.

Incluya ADN previo al trasplante del donante y del receptor, así como agua libre de nucleasas como control negativo, y 9947A como control positivo. Para analizar los resultados de la PCR, agregue 10 microlitros de muestras de ADN desnaturalizado a los pocillos de una placa de reacción de 96 pocillos. Selle la placa, centrifugue brevemente y coloque la placa en hielo.

Los precursores megacariocíticos eritroides se clasificaron como población positiva para CD36 y negativa para el antígeno CD45. Además, las células positivas para CT45 y positivas para CD34 se identificaron como precursores linfoides mieloides, y las células positivas para CD45, con alta señal de dispersión lateral (SSC), como células mieloides maduras. La pureza de las células progenitoras eritroides tras la clasificación fue superior al 85 %, y la pureza de las células mieloides fue superior al 95 %. Las células de médula ósea separadas mediante microperlas magnéticas específicas para CD34 se cultivaron durante 14 días.

Algunas de estas células parecen proliferar, diferenciarse y formar colonias. La estimulación con diversas concentraciones de EPO incrementó la formación de colonias eritroides prominentemente rojas. El análisis por PCR de repeticiones en tándem cortas o STR específicas para el ADN del receptor y del donante puede detectar quimerismo en las células.

Este método determinó con éxito la cantidad de ADN del receptor frente al del donante en células obtenidas mediante la clasificación celular de células de la médula ósea, así como en células obtenidas del ensayo clonogénico. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que esta técnica debe estandarizarse y realizarse por personal adecuadamente capacitado.

Tras seguir este procedimiento, las células progenitoras eritroides derivadas del donante pueden analizarse adicionalmente para responder preguntas complementarias, como la ventaja selectiva de las células madre eritroides corregidas genéticamente. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del trasplante de células madre exploraran la proliferación y diferenciación de los progenitores en el compartimento eritroide. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear el injerto tras un trasplante de células madre en pacientes con hemoglobinopatías.