Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

El objetivo general de este procedimiento es derivar de manera eficiente células madre pluripotentes inducidas por medio de la reprogramación episomal a partir de dos tipos diferentes de células madre fetales. Este método puede ayudar a proporcionar una fuente de células madre pluripotentes para la ingeniería de tejidos, el modelado de enfermedades, la investigación básica o los estudios longitudinales. La principal ventaja de esta técnica es que la reprogramación y la maduración de las iPSC se producen en condiciones químicamente definidas, a la vez que están disponibles de forma temprana para posibles terapias pediátricas basadas en células.

Steven McClellan, el investigador principal, y yo mismo demostraremos este procedimiento. Obtener placentas tan pronto como sea posible después del parto. Corta un segmento de nueve centímetros cuadrados del amnios y lávalo en un tubo de centrífuga de 50 milímetros con 30 mililitros de PBS suplementado con una solución antibiótica y antimicótica.

Retire los coágulos de sangre de las membranas y luego use un par de bisturíes finos para picar las membranas en pedazos finos en una placa de cultivo de tejidos estéril de 10 centímetros. Utilice las hojas de bisturí para transferir la masa de tejido de membrana picada a un tubo de disociación de tejido que contenga 4,7 mililitros de medio RPMI-1640. Mezcle las enzimas de disociación.

Monte el tubo en el disociador de tejido y ejecute el programa h_tumor_01. A continuación, incubar el tubo a 37 grados centígrados en una plataforma oscilante durante 30 minutos. Diluya aún más la suspensión con 35 mililitros de RPMI-1640 y aplíquela en un colador de 70 micras colocado sobre un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Centrifugar durante cinco minutos a 200 veces g a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de RPMI-1640 y cuente las células con un hemocitómetro. Siembre las células en grupos de células a una densidad de aproximadamente 10.000 células por centímetro cuadrado en matraces de cultivo de tejidos con medio AFMC recién preparado suplementado con una solución antibiótica y antimicótica.

Excoleche líquido amniótico de bajo número de paso y células madre de membrana para su reprogramación a partir de un matraz T75 añadiendo dos mililitros de enzima de desprendimiento celular a la lámina celular. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco a ocho minutos. Después de la centrifugación a 200 veces g durante 45 minutos, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS y mezcle bien para lavar los componentes del suero.

Cuente las células con un hemocitómetro. A continuación, ajuste la densidad de células a 100.000 células por mililitro de PBS, y ahora cuádruple en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Coloque los tubos de microcentrífuga en tubos de poliestireno de cinco mililitros para permitir la centrifugación en un timón oscilante regular y centrifugue a 200 veces g durante cuatro minutos a temperatura ambiente.

Después del centrifugado, invierta los tubos y deseche el sobrenadante en un contenedor de desechos, y luego realice un paso de centrifugación adicional a 200 veces g durante tres minutos. Después del centrifugado, utilice una pipeta de 200 microlitros para aspirar con cuidado el líquido restante de los tubos. Coloque las puntas de transfección, el tubo, el tampón de resuspensión y el tampón electrolítico en el gabinete de cultivo de tejidos.

Acerque el dispositivo de transfección para que su estación de tubos pueda colocarse directamente en el armario. Llene un tubo de transfección con tres mililitros de tampón electrolítico y monte el tubo en la estación empujándolo completamente dentro de la ranura. Retire las alícuotas previamente preparadas de la solución de plásmido de reprogramación del almacenamiento a menos 80 grados Celsius y permita que se descongelen a temperatura ambiente en el gabinete de cultivo.

Configure los parámetros de transfección en el dispositivo para entregar un pulso de 40 milisegundos a 950 voltios. Vuelva a suspender el pellet que contiene 100.000 células en 10 microlitros de tampón de resuspensión. Trabajando rápidamente, agregue 1/10 de la solución de plásmido de reprogramación a las células resuspendidas.

Monte la punta de transfección en la pipeta de transfección. A continuación, aspire la suspensión celular en la punta de transfección con cuidado, evitando la formación de burbujas de aire. Inserte la pipeta de transfección en el tubo de transfección.

Y presione el botón de inicio en la pantalla en el dispositivo de transmisión. Espere el mensaje en pantalla sobre el éxito de la transfección. A continuación, retire la pipeta del tubo inmediatamente.

Expulse la suspensión en uno de los pozos de las placas de seis pocillos objetivo. Mezcle el medio de un pozo vecino y distribuya la suspensión en partes iguales en ambos pocillos. Repita la transfección para cada tubo de microcentrífuga con células.

Comience agregando 30 microlitros de EDTA de 0,5 milimolares y PBS a cinco tubos de PCR. A continuación, cargue una punta en una pipeta de 10 microlitros ajustada a dos microlitros. Sostenga la punta de la pipeta en ángulo con respecto al borde de la colonia y raspe con cuidado y gradualmente toda la colonia de la superficie.

Aspire inmediatamente toda la colonia en la punta de la pipeta y transfiérala a uno de los tubos de PCR preparados con EDTA. Después de repetir el proceso con otras cuatro colonias, incube a temperatura ambiente durante cuatro a seis minutos. Use una punta de pipeta más grande para pipetear cada suspensión celular hacia arriba y hacia abajo suavemente para dividir la colonia en grupos más pequeños.

Evite crear una suspensión de una sola celda. A continuación, coloque la suspensión directamente en el pocillo objetivo de una placa de 24 pocillos recubierta de vitronectina recombinante. Después de repetir el proceso para las colonias restantes, incube durante tres a seis días.

Después de cuatro a seis días, cuando las colonias hayan crecido y se hayan compactado, lavar las láminas celulares con 300 microlitros de EDTA 0,5 milimolar y aspirar inmediatamente. Luego agregue otros 300 microlitros e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de aspirar el EDTA, ajuste una pipeta de un mililitro a su capacidad, móntela en una punta de diámetro ancho de mililitro y aspire el medio E8 desde el pocillo objetivo de una placa de seis pocillos recubierta de vitronectina.

Rocíe un chorro del medio en un pocillo de la placa fuente para lavar el cultivo de iPSC. A continuación, transfiera la suspensión al pozo objetivo y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para dividir las colonias en grupos de 20 a 40 celdas. Después de colocar todas las celdas, asegúrese de que los grumos se distribuyan uniformemente balanceando y agitando suavemente la placa.

Luego regrese la placa a la incubadora para la adhesión del grupo y el crecimiento de la colonia. El líquido amniótico y las células madre de membrana, que representan las células fuente para la reprogramación, muestran una morfología mesenquimal típica alargada y de fase brillante. Las células adquieren propiedades epiteliales después de que se someten a la transición de mesénquima a epitelial, lo que conduce a la formación de colonias con células similares a adoquines.

Estas colonias proliferan y crean masas celulares irregulares de células MET. En las últimas etapas de la reprogramación, emergen colonias de células completamente reprogramadas, células discernibles individualmente con bordes bien definidos. Estas células completamente reprogramadas están presentes junto a colonias MET que son más numerosas.

Aquí se muestra un clon maduro aislado completamente reprogramado. Después de la derivación y maduración de iPSC, pueden someterse a una caracterización detallada y dirigir la diferenciación en una variedad de tipos de células. No olvide que trabajar con tejidos humanos que no han sido analizados para detectar la presencia de patógenos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el equipo de protección personal y el trabajo en el gabinete de bioseguridad mientras se realiza este procedimiento.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inducir la pluripotencia en las células madre fetales, qué reactivos y equipos usar, y cómo cultivar células madre pluripotentes de manera rutinaria.