ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

El objetivo general de esta captura optimizada de interactoma de ARNm es aislar e identificar un proteoma unido al ARNm de las células vegetales. Este método se aplica a los protoplastos mesófilos de la hoja de arabidopsis thaliana, un tipo de célula utilizada como herramienta versátil en varios ensayos celulares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los implantes de regulación génica postranscripcional, como el descubrimiento y la comprensión del papel de las proteínas de unión al ARN mensajeros de las plantas.

La principal ventaja de esta técnica es que puede aislar e identificar una planta mensajera en un proteoma unido directamente desde el entorno fisiológico. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la proteína unida al ARN mensajero de los protoplastos mesófilos de la hoja de aribidopsis. También se puede aplicar a otros sistemas como los protoplastos o tejidos de otras plantas.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que se había aplicado con éxito a levaduras y líneas celulares de mamíferos. Aísle los protoplastos mesófilos de la hoja de arabidopsis para dos muestras diferentes, como se describe en el protocolo de texto. Mantenga la muestra de control que no será reticulada por UV o muestra que no sea CL en hielo.

Transfiera la suspensión de protoplast a reticulación, o la muestra de CL a una placa de Petri grande. Agregue 30 mililitros de solución de MMG helada al plato para cubrir la superficie y esparcir las células mediante un pipeteo suave. Cubra la placa de Petri con papel de aluminio cuando la transporte al aparato de reticulación UV.

Coloque la placa de Petri abierta en un aparato de reticulación UV inmediatamente. Asegúrese de que la distancia entre el plato y la lámpara UV sea de ocho centímetros y luego irradie la muestra durante un minuto. Después de eso, alicuota rápidamente la suspensión de protoplast de la placa de Petri en dos nuevos tubos de fondo redondo de 50 mililitros.

Lave el fondo del plato con cinco mililitros adicionales de la solución MMG helada para recoger el resto de los protoplastos. Divida la suspensión entre los dos tubos. A continuación, centrifugar los tubos de muestra sin CL y dos tubos de muestra de CL a 100 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Después de desechar el sobrenadante, vuelva a colocar el tubo con el pellet que no es CL en hielo. Agregue 10 mililitros de solución líquida de MMG a cada tubo de muestra CL y agite suavemente los tubos para volver a suspender los gránulos. Después de combinar las dos muestras en un tubo de fondo redondo de 50 mililitros, centrifugar a 100 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Después de desechar el sobrenadante, mantenga el pellet en hielo. A continuación, añada nueve mililitros de tampón de unión de lisis helada al pellet de celda de cada muestra. Lisar los protoplastos pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente veinte veces, hasta que la solución tenga un color verde claro homogéneo.

Para la homogeneización, pase el lisado de protoplasto dos veces a través de una jeringa de vidrio de 50 mililitros con una aguja estrecha y luego incube el lisado en hielo durante diez minutos. Congele las muestras en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados durante un máximo de tres semanas. Después de descongelar el tubo con lisado de protoplasto congelado a temperatura ambiente, mantenga el tubo en hielo.

Alícuota de 1,8 mililitros de perlas magnéticas oligo-d(T) en seis nuevos tubos de microcentrífuga de fondo redondo de dos mililitros colocados en hielo. Lave la suspensión de perlas en cada tubo con 600 microlitros de tampón de unión de lisis pipeteando brevemente hacia arriba y hacia abajo y gire suavemente las perlas en un rotador durante dos minutos. Mantén las cuentas en hielo.

A continuación, coloque los seis tubos que contienen las cuentas en una rejilla magnética durante al menos tres minutos para dar tiempo suficiente para la captura magnética completa. Cuando las cuentas estén completamente capturadas, la suspensión se aclarará. A continuación, deseche el sobrenadante de los seis tubos e inmediatamente alícuota nueve mililitros de lisado de protoplasto en ellos.

Mezclar las perlas con el lisado pipeteando hasta que la suspensión aparezca marrón y homogénea. Incubar los tubos a cuatro grados centígrados durante una hora con una rotación suave. Después de la incubación, vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética durante tres minutos.

Cuando todas las perlas estén capturadas en el lado de los tubos, recoja el sobrenadante que contiene el lisado de protoplasto en seis nuevos tubos de microcentrífuga de fondo redondo de dos mililitros. A continuación, agregue 1,5 mililitros de tampón de lavado helado uno a cada tubo que contenga perlas y vuelva a suspender las perlas pipeteando. Después de una rotación suave durante un minuto, vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética durante tres minutos.

Deseche el sobrenadante y repita este paso de lavado una vez. Con 1,5 mililitros de tampón de lavado helado dos, repita el mismo procedimiento de lavado dos veces. Si los mRNP se han aislado eficientemente del lisado de protoplasto, debe haber un halo visible alrededor de la bolita de perla en la muestra de CL.

Finalmente, repita el procedimiento de lavado una vez con 1,5 mililitros de tampón bajo en sal helado. Después del lavado, agregue 500 microlitros de tampón de elución a cada tubo y vuelva a suspender suavemente las perlas mediante pipeteo. Incubar a 50 grados centígrados durante tres minutos para liberar los ARN de cola poli-A.

Vuelva a suspender suavemente las perlas pipeteando una vez y vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Transfiera y combine los eluyentes de los seis tubos en un tubo de fondo cónico de 15 mililitros colocado sobre hielo. Esto producirá aproximadamente tres milímetros del eluyente.

La calidad y la cantidad de ARN se pueden determinar inmediatamente utilizando un espectrofotómetro. Prepare las perlas de oligo-d(T)para su reutilización lavándolas dos veces con un mililitro de tampón de elución helado. Después de eso, lávelos con un mililitro de tampón de unión de lisis helado para ajustar la concentración de sal a 500 milimolares.

Utilice estas perlas de oligo-d(T) lavadas para repetir los procedimientos de unión, lavado y elución durante dos rondas adicionales. Esto agotará los ARN de cola poli-A del lisado de protoplasto y producirá un total de nueve milímetros de eluyente para cada muestra. Las cuentas se pueden almacenar y usar para otro experimento un máximo de tres veces.

Para probar la calidad del ARN, digiera las proteínas reticuladas UV con la solución de proteinasa K de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, purifique el ARN con el kit de purificación de ARN para eliminar los contaminantes residuales. Después de la purificación, las muestras están listas para la prueba de calidad de ARN mediante qRT-PCR.

Comience tratando ocho mililitros de cada muestra con 100 unidades de cóctel de ARNasa que contiene ARNasa A y ARNasa T1. Después de un breve vórtice, incube las muestras a 37 grados centígrados durante una hora. Para concentrar las proteínas de unión al ARNm, o mRBP, filtre las muestras utilizando unidades de filtro centrífugas. Cada muestra producirá 75 microlitros con dos microgramos de proteína.

Para el almacenamiento a largo plazo, congele las muestras a menos 80 grados centígrados. Para hacer funcionar un gel de página SDS, mezcle 25 microlitros de cada muestra concentrada con 15 microlitros de tinte de carga 2X y caliente las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Cargue las muestras en un marcador de proteínas en un gel de página SDS con un gel apilante al cinco por ciento y un gel resolutivo al doce por ciento.

A continuación, lave el gel dos veces con agua ultrapura durante cinco minutos por lavado. Usa un kit comercial de tinción de plata para teñir el gel. Si se ha utilizado el número suficiente de protoplastos iniciales, las bandas de proteínas se mostrarán en cinco minutos.

Para probar aún más los mRBP, purifique los péptidos de un segundo gel de página 1D como se explica en el protocolo de texto. Estos péptidos purificados ahora se pueden analizar mediante cromatografía líquida de fase inversa nanométrica, espectrometría de masas y proteómica cualitativa y cuantitativa. Después de la captura de glóbulos de oligo-d(T), la qRT-PCR demostró niveles significativamente más altos de ARNm de referencia de poliubiquitina 10 en comparación con el ARNr 18S.

Dado que las perlas de oligo-d(T) solo se unen al ARN de cola poli-A, esto sugiere que los ARNm están enriquecidos en el eluyente. La captura de mRBP por las perlas de oligo-d(T) se evalúa además mediante un gel de página SDS teñido de plata. El gel muestra una cantidad de proteína significativamente mayor en la muestra de CL reticulado UV en comparación con la muestra no reticulada sin CL.

La duración de la irradiación UV puede influir en la eficiencia de la reticulación. Este gel de página SDS teñido de plata confirma que uno o tres minutos de irradiación UV es la condición óptima, con las intensidades de banda más fuertes. Se identificaron un total de 325 proteínas mediante análisis proteómico cuantitativo.

225 de estas proteínas estuvieron por debajo del nivel de significación debido a la baja abundancia de péptidos presentes para cada proteína, con una alta variabilidad de las intensidades peptídicas. Sin embargo, debido a que todos ellos se detectaron cualitativamente solo en muestras de CL, todos se consideraron resultados positivos. Estas 325 proteínas se clasificaron a su vez en tres categorías, proteínas ribosómicas, RBP principales y RBP candidatas.

Los RBP candidatos carecen de dominios de unión al ARN convencionales y la mayoría de sus funciones no han sido validadas, lo que sugiere posibles funciones novedosas en la regulación del ARN. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana si se realiza adecuadamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las vías de regulación molecular en plantas exploraran el proteoma unido al ARN mensajero de todo el genoma en células y tejidos dicotiledóneas y monocotiledóneas.