PCR de fusión de alta resolución para el receptor de complemento 1 Longitud Polimorfismo Genotipificación: una herramienta innovadora para la evaluación de la susceptibilidad genética de la enfermedad de Alzheimer

El objetivo general de este método es genotipar los polimorfismos de longitud del receptor 1 del complemento para su uso en la evaluación de la susceptibilidad a enfermedades, como la enfermedad de Alzheimer, para comprender mejor el papel de las isoformas de CR1 en la patogénesis de la enfermedad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. Las principales ventajas de esta técnica es que no requiere muestras de sangre fresca y es más fácil, barata, rápida y, por lo tanto, aplicable a poblaciones más grandes.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando reconocemos los desafíos de realizar Western blots con respecto al tiempo necesario y la necesidad de muestras de sangre fresca. Pipetea 20 microlitros de proteinasa K en el fondo de un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, añada 200 microlitros de muestra al tubo.

Agregue 200 microlitros de tampón de lisis a la muestra. Mezclar por vórtice de pulso durante 15 segundos. Después de mezclar, incubar a 56 grados centígrados durante 10 minutos en un baño de agua.

Centrifuga brevemente el tubo de 1,5 mililitros para eliminar las gotas del interior de la tapa. Luego, agregue 100 microlitros de etanol a la muestra. Mezcle nuevamente mediante vórtice de pulso durante 15 segundos antes de centrifugar brevemente el tubo como antes.

A continuación, aplique cuidadosamente la mezcla a la columna de membrana en un tubo de recolección de dos mililitros. Sin mojar el borde, cierre la tapa y centrifugue a 6.000 veces G durante un minuto. Coloque la columna de membrana en un tubo de recolección limpio de dos mililitros y deseche el tubo que contiene el filtrado.

Abra con cuidado la columna de membrana y agregue 500 microlitros de tampón de lavado sin mojar el borde. Cierre el tapón y centrifugue a 6.000 veces G durante un minuto. Luego, coloque la columna de membrana en un tubo de recolección limpio de dos mililitros y deseche el tubo que contiene el filtrado.

Después de abrir con cuidado la columna de membrana, agregue 500 microlitros de tampón de lavado dos sin mojar el borde. Cierre el tapón y centrifugue a 20.000 veces G durante tres minutos. A continuación, coloque la columna de membrana en un nuevo tubo colector de dos mililitros y vuelva a centrifugar.

Después de la centrifugación, coloque la columna de membrana en un tubo limpio de 1,5 mililitros y deseche el tubo de recolección que contiene el filtrado. Abra con cuidado la columna de membrana y agregue 200 microlitros de agua destilada. Incubar la columna a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de centrifugar a 6.000 veces G durante un minuto.

Para realizar el protocolo HRM-PCR, primero diluya las muestras de ADN en tubos de 1,5 mililitros con agua hasta una concentración de 10 nanogramos por microlitro. A continuación, diluya las soluciones de cebador descongeladas en tubos de 1,5 mililitros con agua hasta la misma concentración de seis micromolares. Descongele las soluciones del kit HRM-PCR y mezcle cuidadosamente mediante vórtice para garantizar la recuperación de todo el contenido.

Centrifugar brevemente los tres viales que contienen la mezcla enzimática con colorante de unión al ADN, cloruro de magnesio y agua en una microcentrífuga antes de abrirlos. En un tubo de 1,5 mililitros a temperatura ambiente, utilice los componentes para preparar la mezcla de PCR para la reacción de 120 microlitros como se describe en el protocolo de texto. Mezclar con cuidado por vórtice.

Es fundamental que trabaje con atención y aplicación de acuerdo con las buenas prácticas en biología molecular. Pipetee 19 microlitros de la mezcla de PCR en cada pocillo de una placa blanca de pocillos múltiples. Agregue un microlitro de la plantilla de ADN ajustada a la concentración, luego selle la placa blanca de pocillos múltiples con lámina de sellado.

Centrifugar la placa blanca de pocillos múltiples durante un minuto a 1.500 veces G en una centrífuga de cubo oscilante estándar que contenga un rotor para placas de pocillos múltiples con adaptadores adecuados. Cargue la placa blanca de pocillos múltiples en el instrumento HRM-PCR. Inicie el programa HRM-PCR con las condiciones de PCR que se encuentran en el protocolo de texto.

Después de la reacción HRM-PCR, realice un análisis HRM para determinar el polimorfismo de longitud CR1 como se describe en el protocolo de texto. Las curvas de fusión se analizaron utilizando el software después de la fusión de alta resolución de los amplicones derivados de la PCR del ADN genómico de sujetos con diferentes isoformas de CR1. Los resultados son curvas que discriminan a los sujetos según sus fenotipos alotípicos de expresión de CR1.

Como se muestra en los dos modos de presentación, curvas de fusión normalizadas y desplazadas y gráfico de diferencia normalizado y desplazado por temperatura, los perfiles de la curva se distribuyen de acuerdo con el CR1 estrella tres, el grupo CR1 estrella uno, el CR1 estrella uno, el grupo CR1 estrella dos, el grupo CR1 estrella uno, el grupo CR1 estrella dos y la estrella CR1 dos, CR1 grupo de cuatro estrellas. Estas curvas corresponden a los alelos de polimorfismo de longitud CR1. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo genotipar fácilmente el polimorfismo de longitud CR1 de acuerdo con curvas perfectas obtenidas por HRM-PCR.

Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades debido a la necesidad de muestras de referencia de genotipos de longitud CR1 ya conocidos. Cuando se domina, esta técnica se puede hacer en cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar la misma concentración para cada muestra de ADN.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación cónica del ADN, para responder a preguntas adicionales, como el hallazgo de un nuevo SNP privado conocido. Después de este desarrollo, esta técnica allana el camino para que las investigaciones en el campo de la genética de poblaciones exploren la presión selectiva de patógenos en el polimorfismo de longitud CR1. Aunque este método puede proporcionar información sobre la susceptibilidad en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer, también se puede aplicar a otros estudios de enfermedades como el lupus eritematoso sistémico y la malaria.